CN104710488B - 一种泰拉霉素的半抗原和完全抗原的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种泰拉霉素的半抗原和完全抗原的合成方法，属于免疫学技术领域。本发明通过琥珀酸酐法将泰拉霉素的羟基衍生化，引入游离羧基，合成泰拉霉素半抗原。采用活泼酯法使衍生后的游离羧基与牛血清白蛋白的伯氨基反应形成酰胺键而偶联，制得泰拉霉素完全抗原。以此抗原免疫Balb/c小鼠，小鼠三免后，效价可达1:8000。该抗原具有广阔的实际应用前景。

Description

一种泰拉霉素的半抗原和完全抗原的合成方法
技术领域
本发明涉及一种泰拉霉素的半抗原和完全抗原的合成方法，属于免疫学技术领域。
背景技术
泰拉霉素(Tulathromycin，C41H79N3O12)，是中国2008年批准使用的一种动物专用的半合成大环内酯类抗生素。泰拉霉素药效强、用量少，将会逐渐替代已经产生抗药性的泰乐菌素和替米考星等现有的大环内酯类抗生素，应用潜力巨大。
泰拉霉素的残留分析方法的研究十分必要。目前主要利用放射性标记测定法和HPLC-MS-MS测定泰拉霉素残留。后者较为常用，但是样本前处理复杂、测定过程繁琐、仪器使用成本高，不能满足现场快检的要求。而免疫分析方法具有样本前处理简单、仪器设备费用低、灵敏度高、特异性强等优点，在抗生素残留现场筛选和大量样品快速检测中具有显著的优势。但是目前国内外还没有泰拉霉素酶联免疫吸附检测法(ELISA)的相关报道。
发明内容
本研究首次成功合成了泰拉霉素完全抗原。首先将泰拉霉素改造为具有活性羧基的半抗原。采用活泼酯法合成免疫原泰拉霉素-BSA和包被原泰拉霉素-OVA，为泰拉霉素检测试剂盒的研制开辟了道路。
本发明的第一个目的是提供一种泰拉霉素半抗原。所述半抗原，其合成方法是：按每4-5mg泰拉霉素标准品溶于400-500μL的无水吡啶中，加入1-2mg的丁二酸酐，于90-114℃回流搅拌反应6-9h，氮气吹干反应液，即得泰拉霉素半抗原。
所述泰拉霉素半抗原，在本发明的一种实施方式中，其合成反应方程式如图1所示。合成的半抗原，即衍生后的泰拉霉素具有活性羧基，可以与载体蛋白偶联。
所述泰拉霉素半抗原的结构式，在本发明的一种实施方式中，如下：
所述半抗原，在本发明的一种实施方式中，是采用液质连用(LC-MS)的方法进行鉴定。
本发明的第二个目的是提供一种利用所述半抗原合成泰拉霉素完全抗原的方法。
所述合成泰拉霉素完全抗原方法，包括：(1)按每1mg泰拉霉素半抗原，与0.6-1.0mg的EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺)、0.4-0.8mg的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶于300-400μl的DMF(N,N-二甲基甲酰胺)，室温搅拌反应30-60min，即得到活化好的泰拉霉素衍生物；(2)将6-8mg的载体蛋白溶于2.0-2.5mL的PBS，将上一步活化好的泰拉霉素衍生物边搅拌边逐滴加入载体蛋白溶液中，2-8℃反应12-16h，反应结束后，用PBS透析，即得到泰拉霉素完全抗原。
所述合成完全抗原方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：(1)泰拉霉素半抗原的制备：取4mg泰拉霉素标准品溶于500μl无水吡啶中，加入1mg丁二酸酐，114℃回流搅拌反应6h得泰拉霉素半抗原，氮气吹干反应液；(2)泰拉霉素完全抗原的制备：将1mg泰拉霉素衍生得到的产物(即半抗原)、0.6mg EDC、0.4mg NHS溶于300μlDMF，室温搅拌反应30min；6mg载体蛋白溶于2mL PBS，将活化好的泰拉霉素衍生物边搅拌边逐滴加入载体蛋白溶液中，4℃反应过夜；反应结束后，用PBS透析3d，每6h换一次液。
所述合成完全抗原方法得到的完全抗原，分装后冷冻干燥，-20℃保藏。
所述载体蛋白，在本发明的一种实施方式中，是BSA或OVA。
本发明的第三个目的是提供一种按所述方法得到的泰拉霉素完全抗原。
所述完全抗原，采用如下方法进行鉴定：用50％甲醇PBS溶液做稀释液，取0.1mg/mL BSA、0.01mg/mL泰拉霉素和0.1mg/mLBSA的混合物，0.1mg/mLBSA-泰拉霉素偶联物，0.01mg/mL泰拉霉素于1cm石英比色皿中，设置空白对照为50％甲醇PBS溶液。激发波长为278nm，激发和发射单色仪的狭缝宽度均为5nm，扫面速度为300nm/min,扫描范围300-500，进行荧光发射光谱扫描测定。
本发明还提供了一种鉴定或应用所述泰拉霉素完全抗原的方法，是按照100μg/只的剂量，皮下注射免疫五只雌性Balb/c小鼠。初次免疫将免疫原与完全弗氏佐剂按照1:1混合。以后将免疫原与不完全弗氏佐剂按照1:1混合每间隔两周进行一次加强免疫。三免后尾部取血间接法测定效价。
本发明的有益效果：
(1)制备的泰拉霉素完全抗原是国内外首次的报道，弥补了泰拉霉素免疫学检测方法技术领域的空白，为泰拉霉素酶联免疫检测方法的进一步发展奠定了基础；
(2)制备方法简单，通过严格控制温度、时间、和投料比，成功制备的泰拉霉素完全抗原。经鉴定，合成的泰拉霉素免疫原偶联比为1:17。据文献报道，偶联比在1:8-1:20范围内的免疫原的免疫效价比较好。
(3)利用本发明的免疫原对Balb/c小鼠进行免疫注射，三次免疫后小鼠血清效价达到1:8000，效价较高，血清的IC50为98.5μg/L，特异性良好。
附图说明
图1为泰拉霉素半抗原的合成路线图；
图2为泰拉霉素半抗原质谱图；
图3为泰拉霉素及其偶联物的荧光光谱图。
具体实施方式
实施例1泰拉霉素半抗原的合成
采用琥珀酸酐法对泰拉霉素进行衍生，具体步骤如下：取4mg泰拉霉素标准品溶于500μl无水吡啶中，加入1mg丁二酸酐，114℃回流搅拌反应6h，氮气吹干反应液，即得泰拉霉素半抗原。
采用LC-MS对所得的泰拉霉素半抗原进行鉴定。泰拉霉素半抗原的质谱图如图2所示。泰拉霉素的分子量为806.08，丁二酸酐分子量为100.07。根据理论推测，泰拉霉素结构中的羟基与丁二酸酐反应后得到的衍生物分子量为906.08。从图2可以看出，存在衍生物质荷比为906.6的峰，理论与实际得出的峰值一致，说明泰拉霉素发生了羧基化，成功引入了羧基。
实施例2泰拉霉素半抗原的合成
取5mg泰拉霉素标准品溶于400μL的无水吡啶中，加入2mg的丁二酸酐，于90-114℃回流搅拌反应9h，吹干反应液，即得泰拉霉素半抗原。
实施例3泰拉霉素完全抗原的合成
完全抗原的合成采用活泼酯法。将1mg泰拉霉素衍生得到的产物(即半抗原)、0.6mg EDC、0.4mg NHS溶于300μl DMF，室温避光搅拌反应30min。6mg BSA溶于2mL PBS，将活化好的泰拉霉素衍生物边搅拌边逐滴加入BSA溶液中，4℃反应过夜。反应结束后，用0.01mol/L的PBS透析3d，每6h换一次液。
实施例4泰拉霉素完全抗原的合成
完全抗原的合成采用活泼酯法。将1mg泰拉霉素衍生得到的产物、0.6mg EDC、0.4mg NHS溶于300μlDMF，室温搅拌反应30min。6mg OVA溶于2mL PBS，将活化好的泰拉霉素衍生物边搅拌边逐滴加入OVA溶液中，4℃反应过夜。反应结束后，用PBS透析3d，每6h换一次液。完全抗原与载体蛋白的偶联比为1:17，溶于PBS。
实施例5泰拉霉素完全抗原的合成
取实施例2得到的泰拉霉素半抗原1mg，与1.0mg的EDC、0.8mg的NHS溶于400μl的DMF，室温搅拌反应60min，即得到活化好的泰拉霉素衍生物；(2)将8mg的载体蛋白溶于2.5mL的PBS，将上一步活化好的泰拉霉素衍生物边搅拌边逐滴加入载体蛋白溶液中，2-8℃反应12-16h，反应结束后，用PBS透析，即得到泰拉霉素完全抗原。
实施例6泰拉霉素完全抗原的鉴定
1荧光光谱法
取BSA、泰拉霉素和BSA的混合物，BSA-泰拉霉素偶联物，进行荧光发射光谱扫描测定。荧光光谱如图3。从图3可以看出，偶联物荧光发射强度明显低于同浓度的牛血清白蛋白，对照泰拉霉素及泰拉霉素和BSA混合物的荧光光谱可以初步鉴定泰拉霉素和BSA偶联成功。
2免疫动物试验
按照100μg/只的剂量，皮下注射免疫五只雌性Balb/c小鼠。初次免疫将免疫原与完全弗氏佐剂按照1:1混合。以后将免疫原与不完全弗氏佐剂按照1:1混合每间隔两周进行一次加强免疫。试验结果表明，三免后尾部取血间接法测的效价可达1:8000。血清的IC50为98.5μg/L，特异性良好。
综上可知，本发明成功合成了泰拉霉素完全抗原，利用该抗原可生产泰拉霉素抗体，为泰拉霉素免疫分析方法的建立和发展奠定了基础。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种合成泰拉霉素完全抗原的方法，其特征在于，所述方法，包括：(1)按每1mg泰拉霉素半抗原，与0.6-1.0mg的EDC、0.4-0.8mg的NHS溶于300-400μl的DMF，室温搅拌反应30-60min，即得到活化好的泰拉霉素衍生物；(2)将6-8mg的载体蛋白溶于2-2.5mL的PBS，将上一步活化好的泰拉霉素衍生物边搅拌边逐滴加入载体蛋白溶液中，2-8℃反应12-16h，反应结束后，用PBS透析，即得到泰拉霉素完全抗原；所述泰拉霉素半抗原的合成方法是：每4-5mg泰拉霉素标准品溶于400-500μl的无水吡啶中，加入1-2mg的丁二酸酐，于90-114℃回流搅拌反应6-9h，氮气吹干反应液，即得泰拉霉素半抗原。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：(1)泰拉霉素半抗原的制备：取4mg泰拉霉素标准品溶于500μl无水吡啶中，加入1mg丁二酸酐，114℃回流搅拌反应6h得泰拉霉素半抗原，氮气吹干反应液；(2)泰拉霉素完全抗原的制备：将1mg泰拉霉素半抗原、0.6mg EDC、0.4mg NHS溶于300μl DMF，室温搅拌反应30min；6mg载体蛋白溶于2mL PBS，将活化好的泰拉霉素衍生物边搅拌边逐滴加入载体蛋白溶液中，4℃反应过夜；反应结束后，用PBS透析3d，每6h换一次液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体蛋白是BSA或OVA。
4.权利要求1-3任一所述方法得到的泰拉霉素完全抗原。
5.权利要求4所述泰拉霉素完全抗原在制备人工抗体方面的应用。
6.权利要求4所述泰拉霉素完全抗原在制备检测试剂盒方面的应用。
7.权利要求4所述泰拉霉素完全抗原在泰拉霉素残留检测方面的应用。
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