CN111072767B - 一种丁香酚完全抗原的合成方法 - Google Patents

一种丁香酚完全抗原的合成方法 Download PDF

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Abstract

一种丁香酚完全抗原的合成方法，本发明涉及化学物合成技术领域；丁香酚羧基化半抗原的制备；称取丁香酚羧基化半抗原，溶于1mL PBS缓冲液中；称取12mg载体蛋白溶于1mL PBS缓冲液中，得到载体蛋白溶液，然后将半抗原溶液逐滴加入到载体蛋白溶液，得到半抗原和载体蛋白混合溶液；将5mg EDC溶于0.5mL PBS缓冲液中，得到EDC溶液，然后将EDC溶液边搅拌边逐滴加入上一步得到的半抗原和载体蛋白混合溶液中，继续冰浴15min，室温下振荡反应1h，反应结束后，用PBS透析；对丁香酚完全抗原的鉴定。制备的丁香酚完全抗原弥补了丁香酚免疫学检测方法技术领域的空白，为丁香酚酶联免疫检测方法的进一步发展奠定了基础。

Description

一种丁香酚完全抗原的合成方法
技术领域
本发明涉及化学物合成技术领域，具体涉及一种丁香酚完全抗原的合成方法。
背景技术
丁香酚(eugenol，cas号为97-53-0)为苯丙素类化合物，可以从丁香树、柴桂等多种植物中提取。对于丁香酚在水产领域中的使用，世界各地的做法并不统一，美国没有批准丁香酚作为水产麻醉剂使用，但允许其作为食品添加剂和牙科手术中的临时镇痛剂；日本和中国台湾允许丁香酚在水产品中使用，其药浴剂量为50～200μg/mL，休药期为7d，最高残留量(MRL)设定为 50μg/kg。我国《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》(GB 2760-2014) 规定丁香酚可以被作为添加剂在食品中使用，但对丁香酚在水产品中的使用并没有相关政策法规和标准。近几年媒体先后曝光我国厦门、北京等城市的水产领域存在麻醉剂滥用的问题，已经引起消费者的广泛关注。
丁香酚的目前的丁香酚的检测虽然取得了一些进展，但基本均采用 GC-MS/MS等大型检测仪器设备，设备比较昂贵，试剂消耗量大，不易推广，无法适应市场需求，实现现场快速检测。免疫层析快速检测方法依据抗原和抗体的特异性作用，具有成本低、灵敏度高、特异性强、简便快速的特点，在丁香酚残留现场筛选和快速检测中具有明显优势。但是目前国内外还没有丁香酚酶联免疫吸附检测法(ELISA)的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种操作简单，设计合理的丁香酚完全抗原的合成方法，制备的丁香酚完全抗原弥补了丁香酚免疫学检测方法技术领域的空白，为丁香酚酶联免疫检测方法的进一步发展奠定了基础，合成的丁香酚免疫原的免疫效价比较好。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：它的操作步骤如下：
1、丁香酚羧基化半抗原的制备：
1.1、按照每9-10mg丁香酚标准品溶于30mL的氢氧化钠溶液中，加入 5-6mg的氯乙酸，于90-100℃回流搅拌反应6-8h，冷却至室温；
1.2、持续搅拌条件下，浓盐酸调节溶液pH＝1；
1.3、将溶液过滤，弃去滤液得到粗产物；
1.4、将粗产物转移到沸水浴中溶解，重结晶纯化，即得到丁香酚羧基化半抗原；
2、丁香酚完全抗原的制备：
2.1、称取5mg丁香酚羧基化半抗原，溶于1mL PBS缓冲液(0.01M)中，得到半抗原溶液；
2.2、称取12mg载体蛋白溶于1mL PBS缓冲液(0.01M)中，得到载体蛋白溶液，然后将半抗原溶液逐滴加入到载体蛋白溶液，得到半抗原和载体蛋白混合溶液；
2.3、将5mg EDC溶于0.5mL PBS缓冲液(0.01M)中，得到EDC溶液，然后将EDC溶液边搅拌边逐滴加入上一步得到的半抗原和载体蛋白混合溶液中，继续冰浴15min，室温下振荡反应1h，反应结束后，用PBS透析，即得到丁香酚完全抗原；
3、采用紫外光谱法或者MALDI-TOF法对丁香酚完全抗原的鉴定：
3.1、紫外光谱法的鉴定方法如下：将载体蛋白(BSA)、丁香酚羧基化半抗原和丁香酚完全抗原(丁香酚半抗原与载体蛋白BSA偶联物)用0.01M PBS (溶剂为水，溶质及其浓度如下：NaCl 8.5g/L，KCl 0.02g/L，NaHPO4.12H2O 2.9g/L，NaHPO4.2H2O 0.593g/L)分别配成浓度为0.25ug/mL、0.25ug/mL、 0.25ug/mL的标准溶液，进行紫外光谱扫描；
3.2、MALDI-TOF的鉴定方法如下：将丁香酚半抗原与载体蛋白BSA偶联物用MALDI-TOF/MS进行检测，通过分子质量数据的改变可说明半抗原与蛋白偶联成功与否，并可计算出蛋白与半抗原的偶联比，基质辅助溶液为芥子酸使溶液，将丁香酚半抗原与载体蛋白BSA偶联物脱盐后与基质辅助溶液混合，点到MALDI靶上，放入质谱仪内进行检测，丁香酚半抗原与载体蛋白BSA 的结合比按以下公式计算：偶联比＝(MC-MB)/MA，式中：MA、MB和MC分别表示半抗原、蛋白、偶联物的相对分子质量。
进一步地，所述的步骤1.1中的氢氧化钠溶液的浓度为17.6％m/V。
进一步地，所述的步骤3.1中的紫外光的波长为200-800nm。
进一步地，所述的载体蛋白为BSA或OVA。
采用上述方法后，本发明有益效果为：
1、制备的丁香酚完全抗原是国内外首次报道，弥补了丁香酚免疫学检测方法技术领域的空白，为丁香酚酶联免疫检测方法的进一步发展奠定了基础；
2、制备方法简单，通过严格控制温度、时间和原料比，成功制备的丁香酚完全抗原。经鉴定，合成的丁香酚免疫原偶联比为1∶12.5；据报道，偶联比在1∶8-1∶20范围内的免疫原的免疫效价比较好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为丁香酚羧基化半抗原的合成路线图。
图2为丁香酚羧基化半抗原的一级质谱图。
图3为丁香酚羧基化半抗原的二级质谱图。
图4为丁香酚羧基化半抗原及其与载体蛋白BSA偶联物的紫外光谱图(实线代表丁香酚羧基化半抗原与BSA偶联物，短虚线代表丁香酚羧基化半抗原，点虚线代表BSA)。
图5为丁香酚羧基化半抗原与其与载体蛋白BSA偶联物的MALDI-TOF质谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
参看如图1-图5所示，本具体实施方式采用的技术方案是：
1、取9mg丁香酚标准品溶于30mL的氢氧化钠溶液(17.6％，m/V)中，加入5mg的氯乙酸，于90℃回流搅拌反应6h，冷却至室温；持续搅拌条件下，浓盐酸调节溶液pH＝1；将溶液过滤，弃去滤液得到粗产物；将粗产物转移到沸水浴中溶解，重结晶纯化3次，得羧基化半抗原，合成路径以及产物参看图1；
2、采用液相色谱串联质谱对所得的丁香酚半抗原进行鉴定，丁香酚半抗原的一级质谱图和二级质谱图如图2和图3所示，丁香酚的分子量为164.1，氯乙酸的分子量为94；根据理论推测，丁香酚结构中的酚羟基与氯乙酸反应后得到的衍生物分子量为222.1；从图2可以看出，存在衍生物质荷比为222.1 的峰，理论与实际峰值一致，说明丁香酚发生了羧基化，成功引入了羧基；
3、取5mg丁香酚衍生得到的产物(即羧基化半抗原)溶于1mL PBS缓冲液(0.01M)中，得到半抗原溶液；取12mg载体蛋白溶于1mL PBS缓冲液(0.01M) 中，得到载体蛋白溶液，然后将半抗原溶液逐滴加入到载体蛋白溶液；将 5mgEDC溶于0.5mL PBS缓冲液(0.01M)中，得到EDC溶液，然后将EDC溶液边搅拌边逐滴加入上一步得到的半抗原和载体蛋白混合溶液中，继续冰浴 15min，室温下振荡反应1h；反应结束后，用PBS透析1天，每个6h换一次液，即得到丁香酚完全抗原；
4、将得到的丁香粉完全抗原分装后冷冻干燥，-20℃保存；
5、取BSA、丁香酚羧基化半抗原和所得丁香酚完全抗原(丁香酚半抗原与载体蛋白BSA偶联物)用进行紫外(200-800nm)吸收光谱扫描测定，结果如图4所示，丁香酚半抗原与载体蛋白BSA偶联物的紫外吸收强度明显高于同等浓度载体蛋白BSA的紫外吸收强度，对照丁香酚羧基化半抗原和载体蛋白 BSA的紫外吸收光谱，说明丁香酚羧基化半抗原与载体蛋白BSA成功偶联；或者，取丁香酚半抗原与载体蛋白BSA偶联物进行MALDI-TOF测定，通过分子质量数据的改变可说明半抗原与蛋白偶联成功与否，并可计算出蛋白与半抗原的偶联比。基质辅助溶液为芥子酸使溶液。将丁香酚半抗原与载体蛋白BSA偶联物脱盐后与基质辅助溶液混合，点到MALDI靶上，放入质谱仪内进行检测。丁香酚半抗原与载体蛋白BSA的结合比按以下公式计算：偶联比＝ (MC-MB)/MA，式中：MA、MB和MC分别表示半抗原、蛋白、偶联物的相对分子质量，BSA在连上丁香酚分子后，其质量数会发生改变，BSA的分子量为66353.057。由丁香酚半抗原与载体蛋白BSA偶联物的质谱图(图5)可见，丁香酚半抗原与载体蛋白BSA偶联物分子离子峰为69132.945，其对应的分子量为69131.945。已知丁香酚半抗原的相对分子质量是222，可得出平均每个载体蛋白BSA分子上偶联的丁香酚半抗原分子个数＝(69131.945- 69132.945)/222≈12.5个。制备相应的抗血清小分子化合物合成的全抗原，一般要求小分子与载体蛋白的最适偶联比在1∶10～1∶25之间，方可有效地刺激机体产生免疫应答。从偶联比结果来看，本具体实施方式制备的丁香酚免疫抗原(hapten-BSA)免疫小鼠，有可能产生相应的应答。
进一步地，所述的载体蛋白为BSA或OVA。
采用上述方法后，本具体实施方式有益效果为：本具体实施方式提供了一种丁香酚完全抗原的合成方法，制备的丁香酚完全抗原弥补了丁香酚免疫学检测方法技术领域的空白，为丁香酚酶联免疫检测方法的进一步发展奠定了基础，合成的丁香酚免疫原的免疫效价比较好。
以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (1)

1.一种丁香酚完全抗原的合成方法，其特征在于：它的操作步骤如下：
(1)、丁香酚羧基化半抗原的制备：
(1.1)、按照每9-10mg丁香酚标准品溶于30mL的氢氧化钠溶液中，氢氧化钠溶液的浓度为17.6％m/V，加入5-6mg的氯乙酸，于90-100℃回流搅拌反应6-8h，冷却至室温；
(1.2)、持续搅拌条件下，浓盐酸调节溶液pH＝1；
(1.3)、将溶液过滤，弃去滤液得到粗产物；
(1.4)、将粗产物转移到沸水浴中溶解，重结晶纯化，即得到丁香酚羧基化半抗原；
(2)、丁香酚完全抗原的制备：
(2.1)、称取5mg丁香酚羧基化半抗原，溶于1mL PBS缓冲液中，得到半抗原溶液；
(2.2)、称取12mg载体蛋白溶于1mL PBS缓冲液中，得到载体蛋白溶液，然后将半抗原溶液逐滴加入到载体蛋白溶液，得到半抗原和载体蛋白混合溶液；所述的载体蛋白为BSA或OVA；
(2.3)、将5mg EDC溶于0.5mL PBS缓冲液中，得到EDC溶液，然后将EDC溶液边搅拌边逐滴加入上一步得到的半抗原和载体蛋白混合溶液中，继续冰浴15min，室温下振荡反应1h，反应结束后，用PBS透析，即得到丁香酚完全抗原。
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