JP7348649B2 - 生物検体中におけるレベルを定量化するための標準としての、ジカルボン酸脂肪酸二量体及びその誘導体 - Google Patents

生物検体中におけるレベルを定量化するための標準としての、ジカルボン酸脂肪酸二量体及びその誘導体 Download PDF

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Description

本発明は、概して、ジカルボン酸及びその誘導体に関する。より詳細には、本発明は、大腸がんの診断において使用するための、ジカルボン酸化合物及びその標識誘導体に関する。
消化管酸（ＧＴＡ，Gastric tract acid）は当初、対照対象に比べて大腸がん（ＣＲＣ，colorectal cancer）患者の血清中において低減している炭素数２８～３６の多価不飽和脂肪酸として発見され報告された。ＧＴＡ－４４６と呼ばれる特異的な炭素数２８のＧＴＡを測定することに基づく商業的スクリーニングアッセイ（Cologic（登録商標））が、ＣＲＣのリスク増大について平均リスク集団をスクリーニングするために開発された。
Cologic（登録商標）試験は、これまで、連続希釈された既知の濃度のＧＴＡ－４４６で構成される外部ＧＴＡ－４４６標準曲線からのＧＴＡ－４４６の選択親／娘フラグメント対のシグナル応答を外挿することにより、試料中におけるＧＴＡ－４４６の量を定量化するための、タンデム質量分析を使用して実施されてきた。しかしながら、市販の合成ＧＴＡ－４４６は入手困難であるため、校正曲線は、大量のヒト血清（典型的には５０リットル又はそれ以上）から精製されたＧＴＡ－４４６に依拠する。このアプローチの不利な点は、単離プロセスが労働集約的であり、少量（４０Ｌのヒト血清から約５ｍｇ）しか得られず、内因性の天然種しかもたらさないことである。したがって、例えば、回収並びに機器感度における例えばマトリックス効果及び／又はドリフト等の他の潜在的な変動原因を制御する標識内部標準には選択肢がなかったことから、アッセイにはある特定の制限が生じる。
典型的には、解析的（analytical）アプローチでは、そのような用途における内部標準の使用が好ましい。好ましい解析的アプローチは、既知量の所望の分析物の安定同位体標識バージョンを試験されている試料にスパイクし、次いで、内因性分析物の標識標準に対する比を決定するものであり得る。次いで、この比を使用して、試料中における標的分析物の定量的評価を外挿することができる。
消化管酸ＧＴＡ－４４６は、少量であっても得るのが難しいことに加えて、完全には特性決定されておらず、合成的に調製されておらず、標識誘導体が生成されていない。さらに、これまでのところ、ＧＴＡ－４４６（Ｃ２８Ｈ４６Ｏ４）は、４つの不飽和、単一のカルボン酸部分及び２つのヒドロキシ部分を含有する、単一の長鎖脂肪酸であると考えられていた。
ＧＴＡ－４４６の定量は、これまでは主としてタンデム質量分析解析（tandem mass spectrometry analyses）にさらに限定されており、何故なら、適切な抗体の欠如により、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ，enzyme-linked immunosorbent assay）ベースの定量化アッセイが実施されてこなかったためである。多くの診断プラットフォームがＥＬＩＳＡ原理に基づいているが、特異的な抗ＧＴＡ－４４６抗体の欠如は、ＧＴＡ－４４６検出及び定量化のための制限要因を表す。特異的抗体の産生は、十分な分量の純粋な化合物抗原を要し、これは、合成ＧＴＡ－４４６が入手困難であることによって制限されてきた。
ＧＴＡ－４４６及び／若しくはその誘導体の代替的な、追加の及び／若しくは改善された供給源、並びに／又は試料中におけるそれらの定量化のための方法が、望ましい。
本発明の目的は、ＧＴＡ－４４６レベル等のＧＴＡレベルを定量化するためのアッセイ、試料、及び／又は対象における大腸がんの診断のためのアッセイの役に立ち得る、式Ｉの構造を有する化合物、又はその塩、エステル、プロドラッグ若しくは標識誘導体、又はそれに関連する化合物を提供することである。
ある特定の実施形態において、式Ｉ若しくは式III：
Figure 0007348649000001
の構造を有する化合物、又はその塩、エステル、プロドラッグ若しくは標識誘導体が、本明細書において提供される。
さらなる実施形態において、化合物は、単離化合物であってよい。
上記の化合物（単数又は複数）の別の実施形態において、化合物は、合成的に調製された化合物、解析標準化合物（analytical standard compound）、又は両方であってよい。
また別の実施形態において、式Ｉ若しくは式III：
Figure 0007348649000002
の構造内に組み込まれた１若しくは２以上の同位体標識を含む同位体標識化合物、又はその塩、エステル若しくはプロドラッグが、本明細書において提供される。
上記の同位体標識化合物のさらなる実施形態において、１又は２以上の同位体標識は、安定同位体標識、放射性同位体標識、又はそれらの組合せであってよい。
上記の同位体標識化合物（単数又は複数）のまたさらなる実施形態において、１又は２以上の同位体標識は、重水素（２Ｈ）及び１３Ｃからなる群から選択されてよい。
上記の同位体標識化合物（単数又は複数）のまたさらなる実施形態において、１又は２以上の同位体標識は、三重水素（３Ｈ）及び１４Ｃからなる群から選択されてよい。
また別の実施形態において、同位体標識化合物は、
すべての炭素－炭素二重結合がトランス配置である、
Figure 0007348649000003
若しくはその誘導体、
又はその塩、エステル若しくはプロドラッグであってよい。
さらに別の実施形態において、上記の同位体標識化合物（単数又は複数）は、解析標準化合物であってよい。
上記の化合物（単数又は複数）の別の実施形態において、化合物は、
Figure 0007348649000004
Figure 0007348649000005
の化合物、若しくはそれらの任意の組合せ、
又はその塩、エステル、プロドラッグ若しくは標識誘導体であってよい。
別の実施形態において、上述した通りの同位体標識化合物（単数又は複数）を含む代謝トレーサー組成物が、本明細書において提供される。
また別の実施形態において、上記の化合物（単数又は複数）のいずれかと、賦形剤、担体又は希釈剤とを含む、組成物が、本明細書において提供される。
さらに別の実施形態において、上述した通りの同位体標識化合物（単数又は複数）を含むインビトロ又はインビボ診断剤が、本明細書において提供される。
別の実施形態において、上記の化合物（単数又は複数）のいずれかと、賦形剤、担体又は希釈剤とを含む、組成物が、本明細書において提供される。
さらに別の実施形態において、試料中における消化管酸（ＧＴＡ）のレベルを決定するための方法であって、
試料からのＧＴＡ検出シグナルを測定するステップであって、ＧＴＡ検出シグナルが試料中におけるＧＴＡレベルを表している、測定するステップと、
測定されたＧＴＡ検出シグナルを校正基準と比較することによって、試料中におけるＧＴＡのレベルを定量化するステップと
を含む、前記方法が、本明細書において提供される。
上記の方法のさらなる実施形態において、ＧＴＡは、
Figure 0007348649000006
であってよい。
上記の方法（単数又は複数）のさらに別の実施形態において、ＧＴＡ検出シグナルは、質量分析によって測定されてよい。
上記の方法（単数又は複数）のまた別の実施形態において、校正基準は、既知量の上記に記載の化合物（単数又は複数）を使用して調製された標準曲線を含み得る。
上記の方法（単数又は複数）のさらに別の実施形態において、校正基準は、
試料を、既知量の上記に記載の同位体標識化合物（単数又は複数）でスパイクすること、及び
試料からの内部標準シグナルを測定することであって、内部標準シグナルが試料にスパイクされる既知量の同位体標識化合物を表している、測定すること
によって得られ得る。
上記の方法（単数又は複数）のさらなる実施形態において、内部標準シグナルは、質量分析によって測定されてよい。
上記の方法（単数又は複数）のさらに別の実施形態において、当該方法は、測定されたＧＴＡ検出シグナルによって表される、試料中におけるＧＴＡレベルの、内部標準シグナルによって表される、試料にスパイクされる既知量の同位体標識化合物に対する比を決定するステップをさらに含み得る。
上記の方法（単数又は複数）のさらに別の実施形態において、校正基準は、可変ＧＴＡ／同位体標識化合物比及び前記比が比較される濃度の一連の混合物から生成された同位体希釈曲線（ＩＤＣ，isotope dilution curve）を含み得る。
上記の方法（単数又は複数）のまた別の実施形態において、ＩＤＣは、ＧＴＡ含有量が固定量の同位体標識化合物に対して変化する一連の混合物から生成され得る。
上記の方法（単数又は複数）の別の実施形態において、固定量の同位体標識化合物は、試料にスパイクされる既知量の同位体標識化合物と実質的に同じであってよい。
別の実施形態において、試料中における消化管酸（ＧＴＡ）のレベルを決定するための、上記に記載の化合物（単数又は複数）の使用が、本明細書において提供される。さらなる実施形態において、ＧＴＡは、
Figure 0007348649000007
であってよい。
さらに別の実施形態において、試料中における消化管酸（ＧＴＡ）のレベルを決定する際に使用するための校正基準を生成するための、上記に記載の化合物（単数又は複数）の使用が、本明細書において提供される。さらなる実施形態において、ＧＴＡは、
Figure 0007348649000008
であってよい。
別の実施形態において、試料中における消化管酸（ＧＴＡ）のレベルを決定する際に使用するための内部標準としての、上記に記載の化合物（単数又は複数）の使用が、本明細書において提供される。さらなる実施形態において、ＧＴＡは、
Figure 0007348649000009
であってよい。
別の実施形態において、対象を、大腸がんを有する又は発病するリスクがあるとして同定するための診断方法であって、
対象から得られた試料中における消化管酸（ＧＴＡ）のレベルを、
試料からのＧＴＡ検出シグナルを測定することであって、ＧＴＡ検出シグナルが試料中におけるＧＴＡレベルを表している、測定すること、及び
測定されたＧＴＡ検出シグナルを校正基準と比較することによって、試料中におけるＧＴＡのレベルを定量化すること
によって決定するステップと、
試料中におけるＧＴＡの決定されたレベルが健常対照群と比較して低減している場合に、対象を、大腸がんを有する又は発病するリスクがあるとして同定するステップと
を含み、
ＧＴＡが、
Figure 0007348649000010
である、前記方法が、本明細書において提供される。
さらなる実施形態において、ＧＴＡ検出シグナルは、質量分析によって測定されてよい。
上記の方法（単数又は複数）のさらに別の実施形態において、校正基準は、既知量の上記に記載の化合物（単数又は複数）を使用して調製された標準曲線を含み得る。
上記の方法（単数又は複数）の別の実施形態において、対象から得られた試料中におけるＧＴＡのレベルを決定するステップは、
試料を、既知量の上記に記載の同位体標識化合物（単数又は複数）でスパイクすること、及び
試料からの内部標準シグナルを測定することであって、内部標準シグナルが試料にスパイクされる既知量の同位体標識化合物を表している、測定すること
を含み得る。
さらなる実施形態において、内部標準シグナルは、質量分析によって測定されてよい。
上記の方法（単数又は複数）のさらに別の実施形態において、当該方法は、測定されたＧＴＡ検出シグナルによって表される、試料中におけるＧＴＡレベルの、内部標準シグナルによって表される、試料にスパイクされる既知量の同位体標識化合物に対する比を決定するステップをさらに含み得る。
上記の方法（単数又は複数）のまた別の実施形態において、校正基準は、可変ＧＴＡ／同位体標識化合物比及び前記比が比較される濃度の一連の混合物から生成された同位体希釈曲線（ＩＤＣ）を含み得る。
別の実施形態において、ＩＤＣは、ＧＴＡ含有量が固定量の同位体標識化合物に対して変化する一連の混合物から生成され得る。
上記の方法（単数又は複数）のさらに別の実施形態において、固定量の同位体標識化合物は、試料にスパイクされる既知量の同位体標識化合物と実質的に同じであってよい。
別の実施形態において、対象を、
Figure 0007348649000011
である消化管酸（ＧＴＡ）のレベルの変化に関連する大腸がんを有する又は発病するリスクがあるとして同定するための診断方法における、上記に記載の化合物（単数又は複数）の使用が、本明細書において提供される。
また別の実施形態において、対象を、
Figure 0007348649000012
である消化管酸（ＧＴＡ）のレベルの変化に関連する大腸がんを有する又は発病するリスクがあるとして同定するための診断方法において使用するための校正基準を生成するための、上記に記載の化合物（単数又は複数）の使用が、本明細書において提供される。
別の実施形態において、対象を、
Figure 0007348649000013
である消化管酸（ＧＴＡ）のレベルの変化に関連する大腸がんを有する又は発病するリスクがあるとして同定するための診断方法において使用するための内部標準としての、上記で定義されている化合物（単数又は複数）の使用が、本明細書において提供される。
別の実施形態において、式Ｉ：
Figure 0007348649000014
の化合物と特異的に結合する、抗体又はその抗原結合フラグメントが、本明細書において提供される。
別の実施形態において、抗体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体であってよい。
別の実施形態において、上記で定義されている化合物（単数又は複数）の、前記化合物の抗原性エピトープと特異的に結合する抗体を調製するための抗原としての使用が、本明細書において提供される。
さらに別の実施形態において、試料中における消化管酸（ＧＴＡ）のレベルをイムノアッセイによって検出する又は定量化するための、上記で定義されている抗体（単数又は複数）の使用であって、ＧＴＡが、
Figure 0007348649000015
である、前記使用が、本明細書において提供される。
また別の実施形態において、対象を、
Figure 0007348649000016
である消化管酸（ＧＴＡ）のレベルの変化に関連する大腸がんを有する又は発病するリスクがあるとして同定するための診断方法における、上記で定義されている抗体（単数又は複数）の使用が、本明細書において提供される。
別の実施形態において、試料中における消化管酸（ＧＴＡ）のレベルを決定するための方法であって、
試料中におけるＧＴＡのレベルを、ＧＴＡと特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを用いるイムノアッセイを使用して測定するステップを含み、
ＧＴＡが、
Figure 0007348649000017
である、前記方法が、本明細書において提供される。
上記の方法のさらなる実施形態において、イムノアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含み得る。
上記の方法（単数又は複数）の別の実施形態において、当該方法は、上記に記載の化合物（単数又は複数）を含む対照試料を、イムノアッセイにおける陽性対照として使用するステップをさらに含み得る。
上記の方法（単数又は複数）のさらに別の実施形態において、当該方法は、試料中におけるＧＴＡのレベルを外挿するために標準曲線を使用するステップをさらに含み得、標準曲線は、複数の既知量の上記に記載の化合物（単数又は複数）を使用して生成されたものである。
別の実施形態において、対象を、大腸がんを有する又は発病するリスクがあるとして同定するための診断方法であって、
対象から得られた試料中における消化管酸（ＧＴＡ）のレベルを、
試料中におけるＧＴＡのレベルを、ＧＴＡと特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを用いるイムノアッセイを使用して測定すること
によって決定するステップと、
試料中におけるＧＴＡの決定されたレベルが健常対照群と比較して低減している場合に、対象を、大腸がんを有する又は発病するリスクがあるとして同定するステップと
を含み、
ＧＴＡが、
Figure 0007348649000018
である、前記方法が、本明細書において提供される。
さらなる実施形態において、イムノアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含み得る。
上記の方法（単数又は複数）の別の実施形態において、当該方法は、上記に記載の化合物（単数又は複数）を含む対照試料を、イムノアッセイにおける陽性対照として使用するステップをさらに含み得る。
上記の方法（単数又は複数）のまた別の実施形態において、試料中におけるＧＴＡのレベルを決定するステップは、試料中におけるＧＴＡのレベルを外挿するために標準曲線を使用するステップをさらに含み得、標準曲線は、複数の既知量の上記に記載の化合物（単数又は複数）を使用して生成されたものである。
別の実施形態において、試料中における消化管酸（ＧＴＡ）のレベルを定量化するためのキットであって、
上記に記載の化合物（単数又は複数）、
上記に記載の代謝トレーサー、
上記に記載の組成物（単数又は複数）、
上記に記載の診断剤、及び
上記に記載の抗体（単数又は複数）
のうち少なくとも１つを含み、
上記に記載の方法（単数又は複数）を実施するための説明書のセットをさらに含んでいてもよい、
キットが、本明細書において提供される。
別の実施形態において、対象を、大腸がんを有する又は発病するリスクがあるとして同定するための診断キットであって、
上記に記載の化合物（単数又は複数）、
上記に記載の代謝トレーサー、
上記に記載の組成物（単数又は複数）、
上記に記載の診断剤、及び
上記に記載の抗体（単数又は複数）
のうち少なくとも１つを含み、
上記に記載の方法（単数又は複数）を実施するための説明書のセットをさらに含んでいてもよい、キットが、本明細書において提供される。
別の実施形態において、式：
を有する化合物、又はその標識誘導体が、本明細書において提供される。
また別の実施形態において、式：
を有する化合物、又はその塩、エステル、プロドラッグ若しくは標識誘導体の合成における、上記化合物の使用が、本明細書において提供される。
別の実施形態において、式（Ｉ）：
Figure 0007348649000021
を有する化合物、又はその同位体標識誘導体を合成するための方法であって、
式
を有する化合物を用意するステップと、
該化合物の、１－ヘプチンとの薗頭カップリングを行うステップと、
リンドラー触媒（Lindlar’s catalyst）による還元を行うステップと、
メチルエステル還元を行うステップと、
メタンスルホニルクロリドとの反応を行うステップと、
メシレートをマロン酸ジメチルで置きかえるステップと、
アセタール開裂、エステル加水分解及び脱炭酸を同時に行うための酸処理を行うステップと、
ウィッティヒ反応を行って、式Ｉの化合物又はその同位体標識誘導体を生成するステップと
を含み、
式２４の化合物又は方法における少なくとも１つの反応物質が、式Ｉの同位体標識誘導体が合成される場合に、得られた式Ｉの化合物に組み込まれる少なくとも１個の同位体標識原子を含む、
前記方法が、本明細書において提供される。
さらなる実施形態において、ウィッティヒ反応は、（トリフェニルホスホラニリデン）アセトアルデヒド又は（４－カルボキシブチル）トリフェニルホスホニウムブロミドとの反応を含み得る。
さらに別の実施形態において、式Ｄ：

［式中、
Ｒ１は、－Ｓｎ（Ｒ１０）３、－ＯＴｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ｂ（ＯＨ）２又は
であり、
Ｒ２は、置換されていてもよい飽和若しくは不飽和Ｃ１－Ｃ２０アルキル、飽和若しくは不飽和Ｃ２－Ｃ２０アルケニル、又は飽和若しくは不飽和Ｃ２－Ｃ２０アルキニルであり、
各Ｒ３は、独立して、置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキルであるか、又はＲ３基は、一緒になって、結合している酸素原子を架橋して５若しくは６員環を形成する、置換されていてもよいエチレン若しくはプロピレン基を形成し、
Ｒ５は、置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１０は、置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキルである］
を有する化合物又はその標識誘導体が、本明細書において提供される。
また別の実施形態において、消化管酸（ＧＴＡ）又はその誘導体の合成における式Ｄの化合物の使用が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態において、ＧＴＡ又はその誘導体は、式Ｎ若しくはＳ：
の化合物、又はその塩、エステル、プロドラッグ若しくは標識誘導体
［式中、
Ｒ２は、置換されていてもよい飽和若しくは不飽和Ｃ１－Ｃ２０アルキル、飽和若しくは不飽和Ｃ２－Ｃ２０アルケニル、又は飽和若しくは不飽和Ｃ２－Ｃ２０アルキニルであり、
Ｒ６は、置換されていてもよい飽和若しくは不飽和Ｃ１－Ｃ２０アルキル、飽和若しくは不飽和Ｃ２－Ｃ２０アルケニル、又は飽和若しくは不飽和Ｃ２－Ｃ２０アルキニルである］
であってよい。
別の実施形態において、上記に記載の式Ｎ若しくはＳの化合物又はその同位体標識誘導体を合成するための方法であって、
上記に記載の式Ｄの化合物を用意するステップと、
Ｒ１基を、置換されていてもよい飽和若しくは不飽和アルキル、飽和若しくは不飽和アルケニル、又は飽和若しくは不飽和アルキニルで置きかえるために、カップリング反応を行い、還元を行ってもよいステップと、
Ｒ５含有エステルをヒドロキシル基に変換するステップと、
ヒドロキシル基を脱離基に変換するステップと、
脱離基をマロン酸ジアルキルで置きかえるステップと、
アセタール加水分解、エステル加水分解及び脱炭酸を行って、アルデヒドを形成するステップと、
アルデヒドにおいてカップリング反応を行って、式Ｎ若しくはＳの化合物又はその同位体標識誘導体を生成するステップと
を含み、
式Ｄの化合物又は方法における少なくとも１つの反応物質が、式Ｎ又はＳの同位体標識誘導体が合成される場合に、得られた式Ｎ又はＳの化合物に組み込まれる少なくとも１個の同位体標識原子を含む、
前記方法が、本明細書において提供される。
任意の方法開発前の負ＡＰＣＩにおける水飽和酢酸エチル中の通常の血清有機抽出物の典型的な全イオンフローインジェクションクロマトグラム（ＴＩＣ，total ion flow injection chromatogram）を示す図である。この図は、包括的な血清マトリックス中におけるＧＴＡ－４４６がいかに低いかを示す。 メタノール水勾配を使用する、１６～１８分のＧＴＡ溶出ウィンドウを示す水飽和酢酸エチル中の通常の血清有機抽出物のフルスキャンカラムクロマトグラム（ＲＰ－１８）を示す図である。 単相抽出（ＭｅＯＨ－１～ＭｅＯＨ－３）対二相抽出（Ｎ－１～Ｎ３）の間の、有機相中におけるＣＲＣ４４６（ＭＲＭ４４５／３８３）レベルの比較を示す図である。このデータに基づき、単相抽出を実装した。 単相抽出、続いて、相分離を使用する、上部有機相の全イオン電流フローインジェクションクロマトグラムを示す図である。ＧＴＡ４４６は、ｍ／ｚ４４５．３として観察される。 粗マトリックスと比較してＧＴＡが濃縮されていることを示す、ＮＡＰＣＩにおける順相フラッシュカラムクロマトグラフィー画分３（Ｆ３）のフルスキャンフローインジェクションクロマトグラムを示す図である。 ＧＴＡ４４６のさらなる精製を示す、ＮＡＰＣＩにおける逆相フラッシュカラムクロマトグラフィー画分５（Ｆ５）のフルスキャンフローインジェクションクロマトグラムを示す図である。 ＧＴＡ４４６のさらなる精製を示す、ＮＡＰＣＩにおける逆相フラッシュカラムクロマトグラフィー画分６（Ｆ６）のフルスキャンフローインジェクションクロマトグラムを示す図である。 分取ＨＰＬＣ－ＲＰ分離からの、ＮＡＰＣＩにおけるＧＴＡ－４４６リッチ試料のフルスキャンクロマトグラムを示す図である。 精製されたＧＴＡ４４６を示す、ＮＡＰＣＩにおける分取ＨＰＬＣ－ＮＰ分離からのフルスキャンクロマトグラムを示す図である。 包括的な血清マトリックスにおいて見られるその内因性バージョンと同様のフラグメンテーションフィンガープリントを示す、ＮＡＰＣＩ ＣＥ＝３５ｖにおける単離されたＧＴＡ－４４６のタンデムＭＳスペクトルを示す図である。 ８つのメチレンプロトン（δ５．５～６．２ｐｍ）、２つの末端メチル基（－ＣＨ２ＣＨ ３、δ０．８４及び０．８９ｐｍ、それぞれ３Ｈ、ｔ）、及び主な官能基としての２つの－ＣＯＯＨ基からのδ１２．０ｐｐｍにおける広幅ピークを示す、単離されたＧＴＡ－４４６バイオマーカー＿２（ＣＤＣｌ３中）の１Ｈ－ＮＭＲを示す図である。 ８個のメチレン炭素（δ１２６～１３６ｐｍ）、２つの末端メチル基（－ＣＨ２ＣＨ３、δ１４．０及び１４．１ｐｍ）、及び２つの－ＣＯＯＨ基からのδ１８１．２、１８１．４ｐｐｍにおける２個のカルボニル炭素、独自の構造実体としての４５．９、４７．０ｐｐｍにおける２個のメチレン炭素を示す、単離されたＧＴＡ－４４６バイオマーカー＿２（ＣＤＣｌ３中）の１３Ｃ－ＮＭＲを示す図である。 ２Ｄプロトン相関を示すＧＴＡ－４４６バイオマーカー＿２（ＣＤＣｌ３中）の１Ｈ－１Ｈ ＣＯＳＹ解析を示す図である。Ｅ，Ｅ及びＥ，Ｚ配置は、それらのカップリング定数から推測した。 直接２Ｄ１３Ｃ－１Ｈ相関を示す単離されたＧＴＡ－４４６バイオマーカー＿２（ＣＤＣｌ３中）の直接１Ｈ－１３Ｃ（ＨＭＱＣ）解析を示す図である。 近接２Ｄ１３Ｃ－１Ｈ相関を示す単離されたＧＴＡ－４４６バイオマーカー＿２（ＣＤＣｌ３中）のロングレンジ１Ｈ－１３Ｃ（ＨＭＢＣ）解析を示す図である。 ＧＴＡ－４４６の提案される１３Ｃ安定同位体形態及び天然形態に基づいて予測されるそれらのタンデムＭＳフラグメントを示す図である。 ２５の個体のヒト血清試料を使用する、ＧＴＡ－４４６の提案される１３Ｃ安定同位体についての血清干渉チェックを示す図である。これは、予測される構造Ａ及びＢの両方が、最も低い血清干渉を有し、ＧＴＡ－４４６の内因性レベルを測定するための同位体希釈法において、内部標準として使用するための候補になり得ることを示す。 ＣＲＣ血液検査において商業的標準として使用するための、ＧＴＡ－４４６の商業的製造のためのプロセス実施形態の概要の例を示す図である。
本明細書において記載されるのは、式Ｉの構造を有する消化管酸（ＧＴＡ）ベースの化合物、及びその塩、エステル、プロドラッグ又は標識誘導体、並びにそれに関連する他の化合物である。そのようなＧＴＡ化合物は、試料のＧＴＡレベルを決定するため、対象を、大腸がんを有する若しくは発病するリスクがあるとして診断するため、又は抗体を作製するために使用され得る。式ＩのＧＴＡ（又は関連化合物）と特異的に結合する抗体又はそのフラグメント、並びに、試料中におけるＧＴＡレベルを決定するため、又は対象を、大腸がんを有する若しくは発病するリスクがあるとして診断するための、そのような抗体又はそのフラグメントの使用が記載される。そのようなＧＴＡ化合物及び／又は抗体を含むキットも提供される。
実施形態及び実施例は、当業者に向けた例証目的で提供するものであり、決して限定するものではないことが分かるであろう。
ある特定の実施形態において、式Ｉ：
Figure 0007348649000026
の構造を有する消化管酸（ＧＴＡ）化合物、又はその塩、エステル、プロドラッグ若しくは標識誘導体が、本明細書において提供される。
ある特定の実施形態において、ＧＴＡ化合物は、式II：
Figure 0007348649000027
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素；対イオン；直鎖状若しくは分岐状置換若しくは非置換のアルカン、アルケン若しくはアルキン；置換若しくは非置換のシクロアルカン、シクロアルケン若しくはシクロアルキン；置換若しくは非置換芳香族基；プロドラッグのプロ部分；フルオロフォア；又は保護基であるか、或いは－ＯＲ１及び／又は－ＯＲ２は、それぞれ独立して、インビトロ又はインビボで処理されていてよい生体開裂可能な官能基によって置きかえられて、－ＣＯＯＨ基又はその塩を形成し得る］
の構造を有する化合物を含み得る。
理解されるであろう通り、ある特定の実施形態において、式Ｉ及び／又はIIの化合物は、立体異性体の混合物（概してラセミであってよく、又は立体異性体の１若しくは２以上が少なくとも部分的に濃縮されていてよい）として提供されてよく、又は実質的に立体異性的に純粋な形態で提供されてよい。式Ｉ及びIIの化合物は、２個のキラル炭素を含み、Ｒ／Ｒ、Ｒ／Ｓ、Ｓ／Ｒ、及びＳ／Ｓジアステレオマーとして構成されてよい。故に、ある特定の実施形態において、次の通りの構造：
Figure 0007348649000028
Figure 0007348649000029
を有するＧＴＡ化合物、又はそれらの任意の混合物が、本明細書において提供される。
ある特定の実施形態において、例として、対イオンは、－ＣＯＯ－基上の負電荷を平衡させるために任意の適切な対イオンを含んでよく、それにより、塩を形成する。非限定的な例は、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム又はアルキルアンモニウムを含み得る。
プロドラッグのプロ部分の例は、例えば、メチル、エチル、プロピル若しくはイソプロピル基、疎水性基、膜輸送ペプチド若しくはシグナル、膜横断部分、細胞標的化部分、又はインビトロ若しくはインビボで生体開裂可能である別の適切な基を含み得る。
フルオロフォアの例は、例えば、フルオレセイン、シアニン、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、又は他のそのようなフルオロフォア、染料若しくは市販の標識を含み得る。
保護基の例は、例えば、メチルエステル、ベンジルエステル、ｔｅｒｔ－ブチルエステル、オキサゾリン又はシリルエステルを含み得る。当業者ならば、その多くが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるGreene’s Protective Groups in Organic Synthesis, Fourth Ed., ISBN: 9780471697541 (2007; John Wiley & Sons, Inc.)において記載されている、様々な保護基に気付くであろう。
インビボ又はインビトロで処理されて－ＣＯＯＨ基又はその塩を形成し得る生体開裂可能な官能基の例は、例えば、任意の適切なカーボネート、エステル、アミド又はカルバメート基を含み得る。
ある特定のさらなる実施形態において、ＧＴＡ化合物は、上述した化合物のいずれかの同位体標識誘導体を含み得る。ある特定の実施形態において、同位体標識誘導体は、その中で統合された、１つの、又は１つを超える、同位体標識を含み得る。ある特定の実施形態において、１又は２以上の同位体標識は、安定同位体標識、放射性同位体標識、又はそれらの組合せを含み得る。同位体標識は、例えば、重水素（２Ｈ）若しくは１３Ｃ、又は両方を含み得る。ある特定の実施形態において、同位体標識は、例えば、三重水素（３Ｈ）、１４Ｃ又は両方を含み得る。ある特定の実施形態において、同位体標識は、例えば、ＧＴＡ構造内の飽和炭素において、炭素原子と共有結合した、少なくとも１つの重水素又は三重水素標識を含み得る。当業者ならば、本明細書における教示を考慮して、特定の用途に適合させるために上述した化合物に組み込まれ得る又は結合され得る、様々な標識（同位体、放射性同位体、蛍光、又はその他）に気付くであろう。
ある特定の実施形態において、同様の特性を共有し得る、上述した消化管酸（ＧＴＡ）化合物に関連する化合物も、本明細書において提供される。ある特定の実施形態において、式III：
Figure 0007348649000030
の構造を有する化合物、又はその塩、エステル、プロドラッグ若しくは標識誘導体が、本明細書において提供される。
別の実施形態において、式IV：
Figure 0007348649000031
［式中、Ｒ１及びＲ２は、式IIに関して上記に記載である］
の化合物が、本明細書において提供される。
理解されるであろう通り、ある特定の実施形態において、式III及び／又はIVの化合物は、立体異性体の混合物（概してラセミであってよく、又は立体異性体の１若しくは２以上が少なくとも部分的に濃縮されていてよい）として提供されてよく、又は実質的に立体異性的に純粋な形態で提供されてよい。式III及びIVの化合物は、２個のキラル炭素を含み、Ｒ／Ｒ、Ｒ／Ｓ、Ｓ／Ｒ、及びＳ／Ｓジアステレオマーとして構成されてよい。故に、ある特定の実施形態において、次の通りの構造：
Figure 0007348649000032
Figure 0007348649000033
を有する化合物、又はそれらの任意の混合物が、本明細書において提供される。
ある特定のさらなる実施形態において、式III又はIVの化合物は、上述した化合物のいずれかの同位体標識誘導体を含み得る。ある特定の実施形態において、同位体標識誘導体は、その中で統合された、１つの、又は１つを超える、同位体標識を含み得る。ある特定の実施形態において、１又は２以上の同位体標識は、安定同位体標識、放射性同位体標識、又はそれらの組合せを含み得る。同位体標識は、例えば、重水素（２Ｈ）若しくは１３Ｃ、又は両方を含み得る。ある特定の実施形態において、同位体標識は、例えば、三重水素（３Ｈ）、１４Ｃ、又は両方を含み得る。ある特定の実施形態において、同位体標識は、例えば、構造内の飽和炭素において、炭素原子と共有結合した、少なくとも１つの重水素又は三重水素標識を含み得る。当業者ならば、本明細書における教示を考慮して、特定の用途に適合させるために上述した化合物に組み込まれ得る又は結合され得る、様々な標識（同位体、放射性同位体、蛍光、又はその他）に気付くであろう。
そのような化合物及びその企図される使用のさらなる実施形態について、以下でさらに詳細に記載する。
消化管酸及びＧＴＡ－４４６
本明細書において提供されるのは、消化管酸ＧＴＡ－４４６を含む多価不飽和２８－炭素ジカルボン酸脂肪酸、及びそれらの誘導体である。そのような化合物は、例えば、血清及び／又は他の生体マトリックス中における、前記２８－炭素脂肪酸又は別のＧＴＡのレベルを定量化するアッセイの、正確さ及び／又は特異性を改善する際に使用するためのものであってよい。
ある特定の実施形態において、本明細書において記載されている通りの化合物は、例えば、ある特定の実施形態において、ヒト血清試料又は他のそのような試料であってよい生物検体等である試料中における、例えば消化管酸ＧＴＡ－４４６又は別のそのようなＧＴＡを含む関連分子の定量化において、例えば参照標準又は校正基準として使用され得る。
消化管酸ＧＴＡ－４４６は、これまでは完全には特性決定されておらず、合成的に調製されておらず、標識誘導体が生成されていなかった。さらに、これまでのところ、ＧＴＡ－４４６（Ｃ２８Ｈ４６Ｏ４）は、４つの不飽和、単一のカルボン酸部分及び２つのヒドロキシ部分を含有する、単一の長鎖脂肪酸であると考えられていた。
しかしながら、本明細書において詳述される実験的研究は、ＧＴＡ－４４６が、実際には、２つの１４－炭素不飽和脂肪酸の共役を含むジカルボン酸脂肪酸二量体であることを今や明らかにした（以下の式Ｉを参照）。具体的には、ＧＴＡ－４４６は、９及び５’位において架橋され、２つの末端カルボン酸基を含む。これらの結果に基づき、ＧＴＡファミリーは、概して、それらのアルキル骨格間に架橋された長鎖（Ｃ１４－Ｃ２２）多価不飽和脂肪酸二量体で構成され得る可能性が高いように思われる。本発明者らの知る限り、この研究は、特にヒト血清中において、この構造を有する分子が報告された最初の事例を表す。
Figure 0007348649000034
ＮＭＲ（１Ｈ、１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＭＢＣ及びＨＭＱＣ）及び質量分光法（ＦＴＩＣＲ及びＭＳ／ＭＳ）から導出されるＧＴＡ－４４６の分子構造。化学式Ｃ２８Ｈ４６Ｏ４。精密質量：４４６．３４
したがって、ある特定の実施形態において、例えば解析標準として役立ち得る精製又は単離されたＧＴＡ－４４６化合物又は組成物が、本明細書において提供される。高純度を実現するための、標的の沈殿、相分離、ＦＣＣ（Flash Column Chromatography：フラッシュカラムクロマトグラフィー）及び／又はＨＰＬＣ分離のステップを含み得るマルチステッププロセスを伴う、ヒト血清等のＧＴＡ－４４６リッチ出発材料から式Ｉの精製化合物を得るための単離プロセスも、本明細書において提供される。
別の実施形態において、１又は２以上の標識を精製されたＧＴＡ－４４６アイソフォームに組み込むことによってＧＴＡ－４４６（及びそれに関連する他の化合物）の標識アイソフォームを産生するための方法が、本明細書において提供される。例として、そのような標識は、重水素交換のステップ、又は適切な市販の試薬（例えば、４－フェニル－１，２，４－トリアゾリン－３，５－ジオン（ＰＴＡＤ，4-Phenyl-1,2,4-triazoline-3,5-dione））及び種々のカルボン酸誘導体を使用する共役系のDiels-Alder誘導体化を含み得る種々の形態の誘導体化から選択される別の適切な修飾ステップを含む方法によって、組み込まれ得る。ある特定の実施形態において、ＧＴＡ－４４６の標識アイソフォームが質量分析用途において使用するためのものである場合、ＧＴＡ－４４６の標識アイソフォームは、親娘イオンの質量が、ＭＳ解析によって同定又は定量化されている非標識ＧＴＡ－４４６分析物（又は他の分析物）と共通ではないように設計され得る。合理的に設計された同位体標識化合物の例について、以下でさらに詳細に記載する。
ある特定の実施形態において、式Ｉ：
Figure 0007348649000035
の構造を有する化合物、又はその塩、エステル、プロドラッグ若しくは標識誘導体が、本明細書において提供される。
上述した式II、III及びIVのもの等の関連化合物も提供される。
ある特定の実施形態において、化合物は、単離又は精製化合物であってよい。化合物は、例えば、合成的に調製された化合物であってよい。化合物は、ある特定の実施形態において、アッセイにおいて使用するための解析標準化合物として調製され得る。
そのような化合物と、許容される賦形剤、担体又は希釈剤とを含む、組成物も、本明細書において提供される。
ヒト血清からの単離
ヒト血清からＧＴＡ－４４６を単離するためのプロセスの例を、以下の実施例１及び２において詳細に記載する。プロセスは、ある特定の実施形態において、高いＧＴＡ－４４６濃度を持つものを同定するための市販の血清のロットの評価、続いて、大（５０Ｌ）量の選ばれたロットの調達を伴い得る。ある特定の実施形態において、血清の試験ロットは、ギ酸で緩衝（それによりタンパク質が沈殿）した、水と酢酸エチルとの間で抽出され得る。実施例１の研究において、ＧＴＡ－４４６は、選択された方法下、９つの他の同様の脂肪酸のプールにより、１６．３～１７．６分の間で溶出されることが観察された（以下を参照）。血清源の選択は、ＧＴＡ－４４６について、この出発時の抽出がいかに清潔にされ及び／又は濃縮されているかに基づいて決まることがあり、これは、他の汚染物質が精製の効率を低減させ得ることからスケールアップ抽出を容易にする際に有用であり得る。
以下でさらに詳細に記載される実験は、体液についてＧＴＡ－４４６を単離するための方法を同定した。ある特定の実施形態において、そのために、溶媒抽出／沈殿のステップ、続いて、カラムクロマトグラフ分離のステップを含む、ヒト血清、血液、又は他の適切な体液からＧＴＡ－４４６を単離するための方法が、本明細書において提供される。
ある特定の実施形態において、体液からＧＴＡ－４４６を精製するための方法であって、
単相抽出／タンパク質沈殿ステップにおいて体液を処理し、それにより、沈殿したタンパク質固体及び液相を産生するステップと、
沈殿したタンパク質固体を液相から分離するステップと、
相分離ステップにおいて液相を処理して、有機血清抽出物を得るステップと、
カラム分離ステップにおいて有機血清抽出物を処理するステップであって、
順相分離ステップ、
逆相分離ステップ、及び
逆相段階とその後の順相段階を含む、二段階ＨＰＬＣ分離ステップ
を含むステップと
を含み、
精製されたＧＴＡ－４４６画分が、二段階ＨＰＬＣ分離ステップの順相段階の後に溶出され、それにより、精製されたＧＴＡ－４４６を提供する、
前記方法が、本明細書において提供される。
上記の方法のある特定の実施形態において、単相抽出／タンパク質沈殿ステップは、メタノールの存在下、水中酢酸エチルを使用する抽出を含んでよく、ここで、メタノールは、水中酢酸エチルを混合するためのメディエーターとして作用する。例として、血清：ＭｅＯＨ（１％ギ酸を加えたもの）：ＥｔＯＡｃの約１：２：４の比を有する溶媒混合物を含む単相抽出混合物は、単相抽出／タンパク質沈殿ステップに使用されてよく、これは、沈殿が発生するまで約５分の待ち時間を可能にすることを伴い得る。ある特定の実施形態において、相分離ステップは、液相を相分離するためのヘキサンの使用を含んでよく、それにより、有機血清抽出物を得る。したがって、ある特定のそのような実施形態において、相分離ステップにおける溶媒比は、例えば、約１：２：４：４ 血清：メタノール：酢酸エチル：ヘキサンであってよい。
合理的に設計された標識誘導体
式Ｉの構造及びこの構造のバイオマーカーＧＴＡ－４４６との結合の発見は、追加で同位体標識ＧＴＡ－４４６誘導体化合物の合理的な設計を可能にする。そのような化合物は、例えば、生体試料中における質量分析ベースのＧＴＡ－４４６（又は他のＧＴＡ）解析及び／又は定量化を容易にするように設計され得る。例として、同位体標識ＧＴＡ－４４６誘導体化合物は、解析及び／又は定量化方法において使用されている親／娘ＧＴＡ－４４６ＭＳシグナルに対応する内部標準シグナルを提供するように設計され得る。そのような同位体標識ＧＴＡ－４４６誘導体化合物は、例えば、解析及び／又は定量化方法において使用されている親／娘ＧＴＡ－４４６（又は他のＧＴＡ）ＭＳシグナルに対応する内部標準シグナルを提供するように設計されてよく、それにより、内部標準シグナルは、解析中に検出される他の無関係な血清シグナルと実質的に重複せず、又はそれらから干渉を受けない。
そのような同位体標識化合物の設計例において、干渉研究は、干渉シグナルの欠如を検証するためにＧＴＡ－４４６の種々の理論上の１３Ｃが組み込まれたアイソフォームの親－娘イオン組合せを調査するための、血清及びタンデムＭＳ解析を使用して実施した。ある特定の例において、３つの候補標準を解析し、これは、対応する非標識ＧＴＡ－４４６タンデムＭＳ対と同様の理論上のＭＳ／ＭＳフラグメント、並びに水及び二酸化炭素の損失後に親及び娘フラグメントをもたらした。そのそれぞれが合理的に設計された同位体標識ＧＴＡ－４４６誘導体を表す、図１６における構造（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を参照されたい。これらを、個々の血清抽出物の２５の試料において解析した。分子Ａ及びＢの両方は特に、スパイクされていない血清抽出物における低干渉を示したが、このことは、両方が特に有用な潜在的な内部標準候補であると示唆するものである。同位体標識化合物（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、並びにフラグメントＡ及びＢの干渉解析を、図１６のように、図１７に示す。そのような同位体標識化合物は、ある特定の実施形態において、血清中におけるＧＴＡ－４４６レベルを定量化するための安定同位体希釈法への組み込みに使用され得る。
ある特定の実施形態において、式Ｉ：
Figure 0007348649000036
の構造内に組み込まれた１若しくは２以上の同位体標識を含む同位体標識化合物、又はその塩、エステル若しくはプロドラッグが、本明細書において提供される。
上記の同位体標識化合物は、ある特定の実施形態において、安定同位体標識、放射性同位体標識、又はそれらの組合せである、１又は２以上の同位体標識を含み得る。１又は２以上の同位体標識は、例えば、重水素（２Ｈ）及び１３Ｃからなる群から選択されてよい。１又は２以上の同位体標識は、ある特定のさらなる実施形態において、三重水素（３Ｈ）及び１４Ｃからなる群から選択されてよい。
ある特定の例において、同位体標識化合物は、式（Ａ）、（Ｂ）若しくは（Ｃ）：
の構造を有する化合物、又はその塩、エステル若しくはプロドラッグであってよい、又はそれらを含んでよい。
ある特定の実施形態において、同位体標識化合物は、式（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のいずれか１つの標識化戦略を、式II、III又はIVの化合物に適用してよい。
ある特定の実施形態において、同位体標識化合物は、解析標準化合物として使用するためのものであってよい。ある特定の他の実施形態において、同位体標識化合物は、代謝トレーサー組成物、インビトロ若しくはインビボ診断剤において、又は別の組成物において使用するためのものであってよい。
合成
別の実施形態において、本明細書において記載されている通りの、合成的に調製されたＧＴＡ－４４６関連化合物（又はその塩、エステル若しくは標識誘導体）、又はそれに関連する他の化合物が企図される。ある特定の実施形態において、合成化学アプローチを使用して調製された、そのような化合物又はその誘導体が企図される。そのような合成的に調製された化合物は、例えば、同位体希釈質量分析検出法において使用され得る。
血清からＧＴＡ－４４６を単離する際の難しさ（純粋なＧＴＡ４４６の収率は、典型的には、出発血清から１％未満である）及びＧＴＡ－４４６に対応する安定同位体標識化合物の天然源の欠如により、ＧＴＡ－４４６又はその誘導体の非標識及び／又は標識形態の合成的産生は、安定同位体アッセイ等のＧＴＡ－４４６アッセイを容易にするために有用であり得る。
これまで、本発明者らの知る限り、ＧＴＡ－４４６又はその誘導体を得るための公知の又は報告された単離又は合成スキームはなかった。ＧＴＡ－４４６の構造がこれまで不明であったことを考慮して、式Ｉの化合物及びその誘導体の調製のための合成スキームは、単純に企図されなかった。
過去には、滑沢剤及びポリマーの産生のための、単量体の、モノ不飽和脂肪酸を利用するジカルボン酸脂肪酸二量体の工業規模の製造が、報告されていた。そのような方法は、典型的には、高温（２００℃～３００℃）、高圧（７０～１７５ｐｓｉ）等の厳しい反応条件を含み、多くの場合、触媒としての粘土又は粘土鉱物並びに長時間の混合及びかき混ぜを使用する。これらの反応の最終生成物は、典型的には、非特異的なポリマー混合物を含む。一般化された脂肪酸二量体化プロセスのための典型的な概略的な反応経路は、そのようなプロセスに基づき、下記：
を含んでよい。
二量体化プロセス中に、シス／トランス異性化、二重結合シフト、分岐、環形成及び／又は重合等の他の副反応も発生し得、潜在的に、様々な副生成物につながる。多くの場合、分別蒸留法を用いて、副生成物及び未反応の出発材料の残りから所望の種を分離する。
前述の方法は、ＧＴＡ－４４６合成にとって理想的ではない場合があり、何故なら、共役点及び不飽和の位置に対する特異性は実現することが難しい場合があるためである。第２に、ＧＴＡ－４４６は、二量体化を複雑にする４つの二重結合を含有する（モノ不飽和脂肪酸が例において示されている）。
故に、合成化学アプローチを用いて、本明細書において記載されている通りの化合物を産生し得ることが、本明細書において企図される。ＧＴＡ－４４６構造の解明を含む本明細書において提供される教示を考慮して、様々な合成アプローチが、提供される構造の逆合成解析によって企図され得る。合成スキームは、ある特定の実施形態において、合成中に望ましくない副生成物へと転位することを実質的に回避する、適切な出発材料の使用並びに／又は反応性官能基のブロッキング／保護を伴い得る。
ある特定の実施形態において、合成アプローチは、例えば、２つのＣ１４カルボン酸鎖間で炭素－炭素（Ｃ－Ｃ）二量体化し、適切な触媒を使用することによって及び／又は反応性部位のブロッキングによって特異的なアルケン立体化学を保持して所望の最終生成物を得ることを含み得ることが企図される。例えば、適切な不斉ヘックカップリング又は粘土鉱物触媒高温／高圧二量体化を用いて、ＧＴＡ－４４６を合成してもよい。
ＧＴＡ－４４６の同位体標識誘導体は、例えば、重水素（２Ｈ）又は１３Ｃ形態のいずれかとして合成され得る。重水素は、ある特定の条件下での溶媒による水素交換を受けて、重水素化及び非重水素化形態間の平衡を得ることができる。１３Ｃは、低い天然存在度（約１％）を持つ特に安定な同位体であり、これは、Ｃ－Ｃ結合によって共有的に組み込まれていることから、その１２Ｃバージョンによる実質的な転位を受けないと予測される。少なくとも１個の重水素、少なくとも１個の１３Ｃ、又は両方を含む同位体標識化合物は、すべて本明細書において企図されており、特定の用途に適合させるように選択され得る。例えば、高い安定性が所望される場合、１３Ｃが使用され得るが、ある特定の用途には重水素標識誘導体も企図される。特定の用途に応じて、本明細書において記載されている化合物の放射性標識誘導体も企図される。ある特定の実施形態において、標識誘導体は、以下でさらに詳細に記載する通り、合成中に１又は２以上の標識試薬／反応物質を使用することによって、生成され得る。
ＧＴＡ化合物及びその誘導体を調製するための合成戦略を以下で提示し、式Ｉ及びIIIの化合物を調製するためのより詳細な提案される合成経路を、以下の実施例４及び５においてさらに記載する。
下記の合成経路は、式Ｄの前駆体化合物又はその標識誘導体：
［式中、
Ｒ１は、－Ｓｎ（Ｒ１０）３、－ＯＴｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ｂ（ＯＨ）２又は
であり、
Ｒ２は、置換されていてもよい飽和若しくは不飽和Ｃ１－Ｃ２０アルキル、飽和若しくは不飽和Ｃ２－Ｃ２０アルケニル、又は飽和若しくは不飽和Ｃ２－Ｃ２０アルキニルであり、
各Ｒ３は、独立して、置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキルであるか、又はＲ３基は、一緒になって、結合している酸素原子を架橋して５若しくは６員環を形成する、置換されていてもよいエチレン若しくはプロピレン基を形成し、
Ｒ５は、置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキルであり、
Ｒ１０は、置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキルである］
から、ＧＴＡ化合物、その誘導体、及び／又はそれに関連する化合物を生成し得る。
ある特定の実施形態において、式Ｄの化合物を使用して、次の通りの式Ｅの化合物との反応によって、式Ｆ、Ｇ又はＨの化合物を生成し得ることが企図される。
理解されるであろう通り、化合物Ｄ及びＥは、化合物Ｆ、化合物Ｇ又は化合物Ｈのうち少なくとも１つを提供するように、スティル、薗頭、鈴木又は任意の他の適切な金属媒介性クロスカップリング反応を使用してカップリングされ得る。当業者ならば、本明細書における教示を考慮して、代わりのクロスカップリング反応が、化合物Ａを化合物Ｂとカップリングする際に有用であり得ることを認識するであろう。式Ｅの化合物（及び、同様に、式ＤのＲ１部分）は、そのようなカップリング反応に適合するように選択され得る。
ある特定の実施形態において、式Ｅの化合物は、
Ｒ６が、置換されていてもよい飽和若しくは不飽和Ｃ１－Ｃ２０アルキル、飽和若しくは不飽和Ｃ２－Ｃ２０アルケニル、又は飽和若しくは不飽和Ｃ２－Ｃ２０アルキニルであり、
Ｒ７が、－Ｈ、－Ｓｎ（Ｒ１０）３、－ＯＴｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ｂ（ＯＨ）２又は
であり、
Ｌが、
であり、
Ｒ１０が、置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキルであり、
Ｒ７及びＬが、式Ｆ、Ｇ又はＨの化合物のいずれか１つを生成するための式ＤのビニルＲ１基との反応のために選択される
ものを含み得る。
次いで、式Ｆ、Ｇ又はＨの化合物を使用して、ＧＴＡ化合物、その誘導体及び／又はそれに関連する化合物を生成し得ることが企図される。
式Ｆの化合物が使用される場合、ＧＴＡ化合物、その誘導体及び／又はそれに関連する化合物が、次の通りに調製され得ることが企図される。
化合物Ｊは、例えば水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素リチウム又はＤＩＢＡＬを使用する、化合物Ｆのエステルの還元によって、調製され得ることが企図される。当業者ならば、本明細書における教示を考慮して、エステルのアルコールへの還元に有用であり得る代わりの試薬があることを認識するであろう。化合物Ｋは、化合物Ｊを、例えば、ＭｓＣｌ、Ｔｓ－Ｃｌ、Ｂｓ－Ｃｌ、トリフル酸無水物、ＣＢｒ４／ＰＰｈ３、Ｎ－ヨードスクシンイミド／ＰＰｈ３又はＣＣｌ４／ＰＰｈ３と反応させることによって、調製され得る。当業者ならば、本明細書における教示を考慮して、代わりの条件もアルコールを脱離基に変換するために適切であり得ることを認識するであろう。式Ｋの化合物において、Ｒ８は、特定の用途に応じて、－ＯＭｓ、－ＯＴｆ、－ＯＴｓ、－ＯＢｓ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ又は任意の他の適切な脱離基であってよい。化合物Ｌは、例えば、塩基性条件下、化合物Ｋをマロン酸ジアルキルと反応させることによって、調製され得る。当業者ならば、本明細書における教示を考慮して、脱離基をマロン酸ジアルキルで置きかえるための多くの適切な条件があり得ることを認識するであろう。式Ｌの化合物において、各Ｒ９は、独立して、例えば、置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキルであってよい。化合物Ｍは、化合物Ｌのタンデム脱炭酸によるアセタール及びエステルの同時酸加水分解によって、調製され得ることが企図される。当業者ならば、本明細書における教示を考慮して、この転換に有用であり得る種々の試薬及び触媒があることを認識するであろう。化合物Ｎは、化合物Ｍとのウィッティヒ反応によって、調製され得る。当業者ならば、本明細書における教示を考慮して、ウィッティヒ反応代替が利用可能であり得、ジュリアカップリング及びホーナー・エモンズカップリング反応を含み得るがこれらに限定されないことを認識するであろう。
式Ｇ又はＨの化合物が使用される場合、ＧＴＡ化合物、その誘導体及び／又はそれに関連する化合物が、次の通りに調製され得ることが企図される。
化合物Ｈは、リンドラー触媒又はボラン等の試薬を使用する還元（ヒドロホウ素化）によって、化合物Ｇに変換され得ることが企図される。当業者ならば、本明細書における教示を考慮して、三重結合のシス－オレフィンへの還元に影響するための適切な代わりの試薬及び方法が使用されてもよいことを認識するであろう。化合物Ｏは、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素リチウム又はＤＩＢＡＬを使用する、化合物Ｇのエステルの還元によって、調製され得る。当業者ならば、本明細書における教示を考慮して、代わりの試薬が、エステルのアルコールへの還元に有用であり得ることを認識するであろう。化合物Ｐは、化合物Ｏを、例えば、ＭｓＣｌ、Ｔｓ－Ｃｌ、Ｂｓ－Ｃｌ、トリフル酸無水物、ＣＢｒ４／ＰＰｈ３、Ｎ－ヨードスクシンイミド／ＰＰｈ３又はＣＣｌ４／ＰＰｈ３と反応させることによって、調製され得る。当業者ならば、本明細書における教示を考慮して、アルコールを脱離基に変換するために有用な代わりの条件が使用され得ることを認識するであろう。式Ｐの化合物において、Ｒ８は、特定の用途に応じて、－ＯＭｓ、－ＯＴｆ、－ＯＴｓ、－ＯＢｓ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ又は任意の他の適切な脱離基であってよい。化合物Ｑは、塩基性条件下、化合物Ｐをマロン酸ジアルキルと反応させることによって、調製され得る。当業者ならば、本明細書における教示を考慮して、脱離基をマロン酸ジアルキルで置きかえるための多くの利用可能な条件があり得ることを認識するであろう。式Ｑの化合物において、各Ｒ９は、独立して、例えば、置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキルであってよい。化合物Ｒは、化合物Ｑのタンデム脱炭酸によるアセタール及びエステルの同時酸加水分解によって、調製され得る。当業者ならば、本明細書における教示を考慮して、この転換に有用であり得る種々の試薬及び触媒があり得ることを認識するであろう。化合物Ｓは、化合物Ｒとのウィッティヒ反応によって、調製され得ることが企図される。当業者ならば、本明細書における教示を考慮して、ウィッティヒ反応代替が利用可能であり得、ジュリアカップリング及びホーナー・エモンズカップリング反応を含み得るがこれらに限定されないことを認識するであろう。
理解されるであろう通り、上記で提示したもの等の合成経路を使用して、ＧＴＡ化合物、その誘導体、その標識バージョン及び／又はそれに関連する化合物を生成し得る。試薬、反応物質及びＲ基の選択を通して、様々な異なるＧＴＡ又はＧＴＡ様化合物が、そのような合成経路を使用して調製され得ることが企図される。ある特定の実施形態において、同位体標識及び／又は放射性標識等の標識は、合成中に標識が化合物に組み込まれるような、１又は２以上の標識を担持する試薬／反応物質を使用することによって、そのようなＧＴＡ化合物及び誘導体に組み込まれ得る。
式Ｉ及びIIIの化合物を調製するためのより詳細な提案される合成経路を、以下に提供される実施例４及び５においてさらに記載する。
試料中におけるＧＴＡのレベルを決定するための方法
ＧＴＡ－４４６化合物、及び同位体標識誘導体を含むその誘導体は、ＧＴＡ定量化アッセイにおいて特に有用であり得る。ある特定の実施形態において、そのような化合物は、例えば、同位体希釈質量分析方法の使用を含むＧＴＡ－４４６定量化を可能することによって、市販のCologic（登録商標）結腸がんスクリーニング検査を強化するために使用され得る。
ＧＴＡ－４４６定量化方法及びアッセイ、並びに、対象を、大腸がんを有する又は発病するリスクがあるとして同定するための診断方法及びアッセイの例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２００７／０３０９２８号パンフレットにおいて詳細に記載されているものを含み得る。該参考文献は、中でも、ＧＴＡ－４４６に対応する４４６．３４ダルトンの代謝マーカー及び本明細書において記載されている新たに解明された構造について記載している。
理解されるであろう通り、本明細書において記載されている通りのＧＴＡ－４４６化合物、及び同位体標識誘導体を含むその誘導体は、所望の消化管酸（ＧＴＡ）のレベルを調査するＧＴＡ定量化アッセイにおいて有用であり得る。消化管脂肪酸（ＧＴＡ）は、ホモ及びヘテロ１４～２２炭素二量体脂肪酸のファミリーを含むことが認識されることになり、現在記載されているＧＴＡ－４４６化合物及びその誘導体は、これらのＧＴＡの定量化において有用であり得ることが本明細書において企図される。
プロトタイプＧＴＡファミリーメンバー、ＧＴＡ－４４６は、式Ｉによって描写される通り、２つの１４－炭素鎖からなる。ＧＴＡ－４４６は、大腸がんスクリーニングのための商業的Cologic（商標）血液検査において測定される分析物であるのに対し、ＧＴＡ ＰＣ－５９４、２つの二量体化された１８－炭素脂肪酸で構成される３６炭素ジカルボン酸脂肪酸は、膵臓がんリスクのためのPanaSee（商標）血液検査において測定される。現在、いずれの方法も内部標準を組み込んでおらず、これはそのような標準の欠如による。そのような標準の欠如は、複数のプラットフォームでアッセイを実行することを難しくし、アッセイ結果を幾分限定する。現在記載されている主題を使用して、Cologic（商標）及びPanaSee（商標）等のアッセイとの組合せに適切であり得る１２Ｃ及び１３Ｃ構造を提供することによって、内部標準の欠如に対処し得る。
ＧＴＡ－４４６特異的標準は、ＧＴＡ－４４６レベルを測定するCologic（商標）アッセイに特によく適合し得るが、そのような標準は、任意の他の適切なＧＴＡの定量化にも有用であり得ることが企図される。これまでに測定されたすべてのＧＴＡは、衝突誘起解離（ＣＩＤ，collision-induced dissociation）タンデム質量分析下で、特に水及び二酸化炭素損失の相対的パターンにおいて、独自のフラグメンテーションパターンを示す。理論に縛られることを望むものではないが、当業者ならば、標準が標的分析物と同様の特性を呈する限り、代わりの参照標準を使用して様々な分子を定量化し得ることが分かるであろう。ＧＴＡ代謝系の場合において、ＧＴＡ－４４６のＣＩＤ下での挙動は、他のＧＴＡと同様であり、故に、ＧＴＡ－４４６の１３Ｃ内部標準及び１２Ｃ／１３Ｃ ＧＴＡ４４６の同位体希釈曲線は、適切な解析信頼度を持つ複数のＧＴＡ種にわたって、相対的定量化を提供するのに役立ち得る。
ある特定の実施形態において、本明細書において記載されている通りのＧＴＡ－４４６ベースの化合物は、例えば、ＧＴＡ ＰＣ－５９４を調査するためのPanaSee（商標）アッセイと組み合わせて使用され得る。例として、本明細書において記載されている通りのＧＴＡ－４４６ベースの化合物は、国際公開第２０１１／０３８５０９号パンフレットにおいて記載されている通り、ＧＴＡのレベルを調査するために使用され得る。故に、ある特定の実施形態において、試料中における消化管酸（ＧＴＡ）のレベルを決定するための方法であって、
試料からのＧＴＡ検出シグナルを測定するステップであって、ＧＴＡ検出シグナルが試料中におけるＧＴＡレベルを表している、測定するステップと、
測定されたＧＴＡ検出シグナルを校正基準と比較することによって、試料中におけるＧＴＡのレベルを定量化するステップと
を含む、前記方法が、本明細書において提供される。
ある特定の実施形態において、ＧＴＡは、
Figure 0007348649000046
、又は別の適切なＧＴＡファミリーメンバーであってよい。
ある特定の実施形態において、ＧＴＡ検出シグナルは、質量分析によって測定されてよい。ある特定のさらなる実施形態において、ＧＴＡ検出シグナルは、市販のCologic（登録商標）アッセイのような及び／又は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０３０９２８号パンフレットにおいて記載されている通りの技術のような質量分析技術によって測定されてよい。
上述した方法のある特定の実施形態において、校正基準は、既知量の本明細書において定義されている通りの化合物を使用して調製された標準曲線を含み得る。
ある特定の実施形態において、上述した方法は、
試料を、既知量の本明細書において定義されている通りの同位体標識化合物でスパイクするステップと、
試料からの内部標準シグナルを測定するステップであって、内部標準シグナルが試料にスパイクされる既知量の同位体標識化合物を表している、測定するステップと
をさらに含み得る。
内部標準シグナルは、ある特定の実施形態において、質量分析によって測定されてもよい。
ある特定の実施形態において、上述した方法は、測定されたＧＴＡ検出シグナルによって表される、試料中におけるＧＴＡレベルの、内部標準シグナルによって表される、試料にスパイクされる既知量の同位体標識化合物に対する比を決定するステップをさらに含み得る。校正基準は、ある特定の実施形態において、可変ＧＴＡ／同位体標識化合物比及び前記比が比較される濃度の一連の混合物から生成された同位体希釈曲線（ＩＤＣ）を含み得る。ある特定の実施形態において、ＩＤＣは、ＧＴＡ含有量が固定量の同位体標識化合物に対して変化する一連の混合物から生成され得る。ある特定の実施形態において、固定量の同位体標識化合物は、試料にスパイクされる既知量の同位体標識化合物と実質的に同じであってよい。
当業者ならば、本明細書における教示を考慮して、ＩＤＣ質量分析技術、同位体希釈質量分析技術、及びＩＤＣ曲線を生成するための方法に気付くであろうし、そのような技術を、特定の用途に適合するように所望される通りに選択及び／又は修正することができるであろう。
試料中における消化管酸（ＧＴＡ）のレベルを決定する際に使用するための校正基準を生成するための、本明細書において記載されている通りの化合物の使用も、本明細書において提供される。ある特定の実施形態において、ＧＴＡは、
Figure 0007348649000047
、又は別の適切なＧＴＡファミリーメンバーであってよい。
また、試料中における消化管酸（ＧＴＡ）のレベルを決定する際に使用するための内部標準としての本明細書において定義されている通りの同位体標識化合物の使用も、本明細書において提供される。ある特定の実施形態において、ＧＴＡは、
Figure 0007348649000048
、又は別の適切なＧＴＡファミリーメンバーであってよい。
本明細書において記載されている通り、定量化すること又は定量化は、試料又は体液中における、相対的又は定量的用語いずれかでの、特定の分子、例えばＧＴＡの量の決定に関するように意図される。例えば、これは、モル／Ｌ、重量パーセント、又は他の標準測定単位での、分子の濃度の決定を意味し得る。代替として、該用語は、内部標準又は対照に対する分子のレベルの相対的決定に関し得る（例えば、濃度を計算することなく）。例えば、分子の相対的定量化は、内部標準又は対照と比較した、例えば、疾患又は治療の進行を測定するために前の時点と比較した経時的な、対象における増大又は減少の決定を伴い得る。
対象を、大腸がんを有する又は発病するリスクがあるとして同定するための診断方法
ＧＴＡ－４４６化合物、及び同位体標識誘導体を含むその誘導体は、対象を、ＧＴＡ－４４６レベルに関係する大腸がんを有する又は発病するリスクがあるとして同定するための診断方法において、特に有用であり得る。ある特定の実施形態において、そのような化合物は、例えば、同位体希釈質量分析方法の使用を含むＧＴＡ－４４６定量化を可能にすることによって、市販のCologic（登録商標）結腸がんスクリーニング検査を強化するために使用され得る。
ＧＴＡ－４４６定量化方法及びアッセイ、並びに、対象を、大腸がんを有する又は発病するリスクがあるとして同定するための診断方法及びアッセイの例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２００７／０３０９２８号パンフレットにおいて詳細に記載述されているものを含み得る。該参考文献は、中でも、ＧＴＡ－４４６に対応する４４６．３４ダルトンの代謝マーカー及び本明細書において記載されている新たに解明された構造について記載している。
ある特定の実施形態において、対象を、大腸がんを有する又は発病するリスクがあるとして同定するための診断方法であって、
対象から得られた試料中における消化管酸（ＧＴＡ）のレベルを、
試料からのＧＴＡ検出シグナルを測定することであって、ＧＴＡ検出シグナルが試料中におけるＧＴＡレベルを表している、測定すること、及び
測定されたＧＴＡ検出シグナルを校正基準と比較することによって、試料中におけるＧＴＡのレベルを定量化すること
によって決定するステップと、
試料中におけるＧＴＡの決定されたレベルが健常対照群と比較して低減している場合に、対象を、大腸がんを有する又は発病するリスクがあるとして同定するステップと
を含み、
ＧＴＡが、
Figure 0007348649000049
である、前記方法が、本明細書において提供される。
ある特定の実施形態において、ＧＴＡ検出シグナルは、質量分析によって測定されてよい。ある特定のさらなる実施形態において、ＧＴＡ検出シグナルは、市販のCologic（登録商標）アッセイのような及び／又は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０３０９２８号パンフレットにおいて記載されている通りの技術のような質量分析技術によって測定されてよい。
上述した方法のある特定の実施形態において、校正基準は、既知量の本明細書において定義されている通りの化合物を使用して調製された標準曲線を含み得る。
ある特定の実施形態において、対象から得られた試料中におけるＧＴＡのレベルを決定するステップは、
試料を、既知量の本明細書において記載されている通りの同位体標識化合物でスパイクすること、及び
試料からの内部標準シグナルを測定することであって、内部標準シグナルが試料にスパイクされる既知量の同位体標識化合物を表している、測定すること
をさらに含み得る。
ある特定の実施形態において、内部標準シグナルは、質量分析によって測定されてもよい。
ある特定の実施形態において、そのような方法は、測定されたＧＴＡ検出シグナルによって表される、試料中におけるＧＴＡレベルの、内部標準シグナルによって表される、試料にスパイクされる既知量の同位体標識化合物に対する比を決定するステップをさらに含み得る。校正基準は、ある特定の実施形態において、可変ＧＴＡ／同位体標識化合物比及び前記比が比較される濃度の一連の混合物から生成された同位体希釈曲線（ＩＤＣ）を含み得る。ある特定の実施形態において、ＩＤＣは、ＧＴＡ含有量が固定量の同位体標識化合物に対して変化する一連の混合物から生成され得る。固定量の同位体標識化合物は、ある特定の実施形態において、試料にスパイクされる既知量の同位体標識化合物と実質的に同じであってよい。
当業者ならば、本明細書における教示を考慮して、ＩＤＣ質量分析技術、同位体希釈質量分析技術、及びＩＤＣ曲線を生成するための方法に気付くであろうし、そのような技術を、特定の用途に適合するように所望される通りに選択及び／又は修正することができるであろう。
ある特定の実施形態において、対象を、
Figure 0007348649000050
である消化管酸（ＧＴＡ）のレベルの変化に関連する大腸がんを有する又は発病するリスクがあるとして同定するための診断方法における、本明細書において記載されている通りの化合物の使用が、本明細書において提供される。
別の実施形態において、対象を、
Figure 0007348649000051
である消化管酸（ＧＴＡ）のレベルの変化に関連する大腸がんを有する又は発病するリスクがあるとして同定するための診断方法において使用するための校正基準を生成するための、本明細書において記載されている通りの化合物の使用が、本明細書において提供される。
さらに別の実施形態において、対象を、
Figure 0007348649000052
である消化管酸（ＧＴＡ）のレベルの変化に関連する大腸がんを有する又は発病するリスクがあるとして同定するための診断方法において使用するための内部標準としての、本明細書において記載されている通りの同位体標識化合物の使用が、本明細書において提供される。
イムノアッセイ－抗体生成
別の実施形態において、ＧＴＡ－４４６と特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを生成するための、本明細書において記載されている通りのＧＴＡ－４４６化合物の使用が、本明細書において提供される。そのような抗体は、ＧＴＡ－４４６の検出及び／又は定量化において、様々な使用を有し得る。そのような抗体は、ある特定の実施形態において、試料中におけるＧＴＡ－４４６レベルを検出及び／又は定量化するための、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等のイムノアッセイにおいて使用するためのものであってよい。
これまで、ＧＴＡ－４４６の定量化は、タンデム質量分析に限定されており、適切な抗体の欠如により、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって実施されてこなかった。特異的抗体の産生は、概して、十分な分量の純粋な化合物を要し、これは、合成ＧＴＡ－４４６が入手困難であることによってこれまで制限されてきた。
ある特定の実施形態において、抗ＧＴＡ－４４６抗体の生成における、単離された、精製された又は合成ＧＴＡ－４４６の使用が、本明細書において提供される。ある特定のさらなる実施形態において、そのような抗ＧＴＡ－４４６抗体を用いる、ＧＴＡ－４４６検出及び／又は定量化イムノアッセイが、本明細書において提供される。
ある実施形態において、式Ｉ：
Figure 0007348649000053
の化合物と特異的に結合する、抗体又はその抗原結合フラグメントが、本明細書において提供される。
ある特定の実施形態において、抗体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体であってよいか、又はそれを含んでいてもよい。
別の実施形態において、本明細書において記載されている通りの化合物の、前記化合物の抗原性エピトープと特異的に結合する抗体を調製するための抗原としての使用が、本明細書において提供される。
当業者ならば、本明細書における教示を考慮して、本明細書において記載されている通りの抗ＧＴＡ－４４６抗体又はそのフラグメントを生成するための、様々な適切な技術に気付くであろう。そのような技術の例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Antibodies: A Laboratoy Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2014, ISBN: 978-1-936113-81-1において記載されているものを含み得る。
試料中におけるＧＴＡのレベルを決定するためのイムノアッセイ
本明細書において記載されている通りの抗ＧＴＡ－４４６抗体は、試料中におけるＧＴＡレベルの検出及び／又は定量化のための、ＥＬＩＳＡベースのアッセイ等であるがこれに限定されないイムノアッセイにおいて使用され得る。
ある特定の実施形態において、試料中における消化管酸（ＧＴＡ）のレベルを決定するための方法であって、
試料中におけるＧＴＡのレベルを、ＧＴＡと特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを用いるイムノアッセイを使用して測定するステップを含み、
ＧＴＡが、
Figure 0007348649000054
である、前記方法が、本明細書において提供される。
ある特定の実施形態において、イムノアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含み得る。
ある特定の実施形態において、上述した方法は、本明細書において定義されている通りの化合物を含む対照試料を、イムノアッセイにおける陽性対照として使用するステップをさらに含み得る。
さらなる実施形態において、上述した方法は、試料中におけるＧＴＡのレベルを外挿するために標準曲線を使用するステップをさらに含み得、標準曲線は、複数の既知量の本明細書において記載されている通りの化合物を使用して生成されたものである。
別の実施形態において、試料中における消化管酸（ＧＴＡ）のレベルをイムノアッセイによって決定又は定量化するための、抗ＧＴＡ－４４６抗体又はそのフラグメントの使用であって、ＧＴＡが、
Figure 0007348649000055
である、前記使用が、本明細書において提供される。
対象を、大腸がんを有する又は発病するリスクがあるとして同定するためのイムノアッセイ
本明細書において記載されている通りの抗ＧＴＡ－４４６抗体は、対象を、大腸がん（ＣＲＣ）を有する又は発病するリスクがあるとして同定する診断方法の一部としての、試料中におけるＧＴＡレベルの検出及び／又は定量化のための、ＥＬＩＳＡベースのアッセイ等であるがこれに限定されないイムノアッセイにおいて使用され得る。
ある特定の実施形態において、対象を、大腸がんを有する又は発病するリスクがあるとして同定するための診断方法であって、
対象から得られた試料中における消化管酸（ＧＴＡ）のレベルを、
試料中におけるＧＴＡのレベルを、ＧＴＡと特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを用いるイムノアッセイを使用して測定すること
によって決定するステップと、
試料中におけるＧＴＡの決定されたレベルが健常対照群と比較して低減している場合に、対象を、大腸がんを有する又は発病するリスクがあるとして同定するステップと
を含み、
ＧＴＡが、
Figure 0007348649000056
である、前記方法が、本明細書において提供される。
ある特定の実施形態において、イムノアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含み得る。
さらなる実施形態において、上述した方法は、本明細書において記載されている通りの化合物を含む対照試料を、イムノアッセイにおける陽性対照として使用するステップをさらに含み得る。
さらなる実施形態において、試料中におけるＧＴＡのレベルを決定するステップは、試料中におけるＧＴＡのレベルを外挿するために標準曲線を使用するステップをさらに含み得、標準曲線は、複数の既知量の本明細書において記載されている通りの化合物を使用して生成されたものである。
別の実施形態において、対象を、
Figure 0007348649000057
である消化管酸（ＧＴＡ）のレベルの変化に関連する大腸がんを有する又は発病するリスクがあるとして同定するための診断方法における、本明細書において記載されている通りの抗ＧＴＡ－４４６抗体又はその抗原結合フラグメントの使用が、本明細書において提供される。
定量化及び／又は診断キット
ある特定の実施形態において、試料中におけるＧＴＡレベルの検出及び／又は定量化に関連するキットが、本明細書において提供される。
ある実施形態において、試料中における消化管酸（ＧＴＡ）のレベルを定量化するためのキットであって、
本明細書において記載されている通りの化合物、
本明細書において記載されている通りの代謝トレーサー、
本明細書において記載されている通りの組成物、
本明細書において記載されている通りの診断剤、及び
本明細書において記載されている通りの抗体又はその抗原結合フラグメント
のうち少なくとも１つを含み、
本明細書において記載されている通りの方法を実施するための説明書のセットをさらに含んでいてもよい、
キットが、本明細書において提供される。
別の実施形態において、対象を、大腸がんを有する又は発病するリスクがあるとして同定するための診断キットであって、
本明細書において記載されている通りの化合物、
本明細書において記載されている通りの代謝トレーサー、
本明細書において記載されている通りの組成物、
本明細書において記載されている通りの診断剤、及び
本明細書において記載されている通りの抗体又はその抗原結合フラグメント
のうち少なくとも１つを含み、
本明細書において記載されている通りの方法を実施するための説明書のセットをさらに含んでいてもよい、
キットが、本明細書において提供される。
ヒト血清からのＧＴＡ－４４６単離のための方法
ヒト血清からＧＴＡ－４４６を単離するための一般的なプロセス（例えば、図１８を参照）は、高いＧＴＡ－４４６濃度を持つロットについて市販の血清の複数のロットの評価、続いて、大（５０Ｌ）量の選ばれたロットの調達を伴い得る。この例における血清の試験ロットは、ギ酸で緩衝した、水と酢酸エチルとの間で抽出した。ＧＴＡ－４４６は、選択された方法下、９つの他の同様の脂肪酸のプールにより、１６．３～１７．６分の間で溶出した（図２参照）。血清源の選択は、他の汚染物質がプロセスにおける精製の効率を低減させ得ることから、ＧＴＡ－４４６による出発時の（staring）抽出が、スケールアップ抽出のためにいかに清潔にされ及び濃縮されているかに基づいて決めた。
血清中における内因性ＧＴＡ－４４６の低い存在度（図１）により、本明細書において、血清抽出プロトコールが設計された。ヒト血清マトリックスは、ある範囲の溶解度を有する様々な成分で構成されている。タンパク質、脂質及び炭水化物等の複合分子に加えて、血清は、アミノ酸、ビタミン及び他の小代謝産物等の非常に小さい分子も含有する。それらの構造的官能性は、非常に極性の高い（水／メタノール媒質中の、炭水化物及びタンパク質並びに他の親水性成分）～中極性（酢酸エチル、クロロホルム及びジクロロメタン中の、リン脂質及び脂肪酸並びに他のヘテロ原子の小代謝産物）～非極性（ヘキサン中の、トリ及びジグリセリド並びにより大きい糖脂質）溶媒組合せの範囲の、可変溶解度をもたらす。したがって、取り扱う及び蒸発させるために安全及び好都合であるＧＴＡ－４４６濃縮画分を得る初期分離ステップのための適切な溶媒スキームの選択を実施した。タンデムＭＳ／ＭＳフラグメンテーションは、低分子量（５００ａｍｕ未満）と一緒に、標的分子がカルボン酸及びヒドロキシル官能性を持つ小代謝産物であり（上述した通り）、酢酸エチル／メタノール溶媒組合せ中で容易に可溶化されるであろうことを示唆した。メタノールがマトリックス中におけるタンパク質の沈殿をもたらすことから、この溶媒組合せは、抽出に好都合である。
水中酢酸エチルの、メタノールの存在下での混和性により（後者は、水中酢酸エチルを混合するためのメディエーターとして作用する）、単相沈殿ステップは、予備ＧＴＡ－４４６濃縮ステップにおいてＧＴＡ－４４６の良好な濃度を実現するように設計された。二相沈殿とは異なり、ＣＲＣマーカーの有機相への完全な移行が弱い静電引力及び水性相との分子間水素結合により阻害されるかもしれない場合、いかなる初期相分離もないことから、単相沈殿ステップによりそのようなリスクが低減された。この仮説を検証するために、単相（ＭｅＯＨ－１～ＭｅＯＨ－２）及び二相（Ｎ１～Ｎ３）分離間の抽出物を、ＭＳ解析を使用して比較し、これにより、前者が後者を上回る２０％の抽出効率を示すことを検出した（図３）。
ＧＴＡ－４４６抽出を改善するための取り組みの中で、適正な酸強度を持つメタノール／酢酸エチル比の選択、及び沈殿のための待ち時間について研究した。このステップにおける方法開発中の主な焦点は、蒸発時間及び廃溶媒の低減も可能にするであろう低い溶媒容量を使用して良好な抽出効率を得ること、並びに低い酸強度を使用することであった。血清：ＭｅＯＨ（１％ギ酸を加えたもの）：ＥｔＯＡｃの１：２：４の比を有する溶媒混合物を沈殿ステップのために選択して、沈殿まで５分間の待ち時間を可能にした。
均質化された液体を遠心分離及びデカントすることによって、液体から沈殿したタンパク質固体を分離したところ、今や血清中はすべて極性及び非極性可溶分となった。単離プロセスにおける次の段階は、減圧下で低温蒸発を容易にすること及びＧＴＡ－４４６を含有する血清の粗有機抽出物を得るための、ＧＴＡ－４４６の揮発性溶媒系への相分離であった。単相溶液中において、メタノールは、水及び酢酸エチルを混合するための中間体として作用するため、有機及び水性相の両方が分離不可能である。
抽出媒質中における水の存在が、蒸発ステップ中により長い時間及びより高い温度を産生したことから、大容量の溶媒混合物（Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ：ＥｔＯＡｃ、１：２：４）は、小規模ロータベーパーを使用して効率的に蒸発させるのに不都合であった。また、酸性水性相中におけるＧＴＡ－４４６の安定性は、ラクトン形成の可能性による懸案事項であった。したがって、水性相から、中性、低極性、有機相へのＧＴＡ－４４６の迅速な及び効率的な分離は、単相沈殿ステップの後で抽出シーケンスに相分離ステップを導入することによって設計した。これは、所望の分析物から水性相中に抽出された不要な極性物質のほとんども分離した。相分離は、水と酢酸エチルとの溶媒比を調整し、水よりも酢酸エチルの量が多いと溶媒を２つの層に簡単に分離することによって；又は、有機可溶分を上部有機相中に分散させる、ヘキサン等の非混和性の非極性溶媒を添加することによってのいずれかで、実現した。一連の実験は、沈殿ステップから得られた溶媒混合物への、異なる容量の水、酢酸エチル及びヘキサンの、異なる組合せでの添加を有するように設計した（表１）。
Figure 0007348649000058
有機及び水性相の両方を収集し、飛行時間質量分析によって解析して、各実験におけるＧＴＡ－４４６抽出効率を決定した。ＧＴＡマーカーパネルは、抽出効率において顕著な差異を示さなかったすべての種類の試験抽出の有機相において検出された。３つの溶媒組合せの中で、ＧＴＡ－４４６抽出に基づく区別はなかったため、相分離の優れた明瞭性により、ヘキサンを選択した。相分離を得るために水を添加した２つの実験では、エマルションが形成され、明確な分離を得るにはより長い時間がかかった。また、水性相の全容積は、バルク抽出における他の２つと比較してはるかに少なく、取り扱いやすかった。したがって、同定された最終溶媒比は、１：２：４：４ 血清：メタノール：酢酸エチル：ヘキサンであった。次いで、有機上部層を蒸発乾固させて、その元のマトリックス中の極性不純物のほとんどを欠いている、ＧＴＡ－４４６が濃縮された粗抽出物を得た（図４参照）。
単離プロセスの次のステップは、粗マトリックス中の他の不純物からのＧＴＡ－４４６の分離及び精製であり、順及び逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ，high performance liquid chromatography）並びにフラッシュカラムクロマトグラフィーを使用するカラム分離シーケンスに依拠していた。具体的には、順相クロマトグラフィーを最初に実施して、粗混合物から、トリ及びジアシルグリセリド並びに同様の実体等の非極性材料のほとんどを排除した。他の一般的な血清脂肪酸を持つＧＴＡ－４４６と中～長鎖長の誘導体との間の適合する極性性質により、それらは、各種脂肪化合物のプールとして、一緒に溶出する傾向がある。その結果、血清中における適合する成分から９５％を超える純度を得るためのＧＴＡ－４４６の分離及び単離は難しく、脂肪酸及びそれらのアナログの微量不純物レベルは、多くの場合、細かいＨＰＬＣ精製の後であっても、精製されたＧＴＡ－Ｃ２８画分とともに残存する。これは、干渉シグナルにより、ＮＭＲデータを使用して完全な構造解明を得ることを難しくしていた。この困難を克服するために、ほとんどの不純物を排除するＨＰＬＣへの注入前に、初期順相フラッシュカラム分離、続いて、逆相ＦＣの使用を用い、その後のＨＰＬＣ精製のために一画分中にＧＴＡ－４４６及び密接に関連した分子を残す方法が開発された。
初期順相フラッシュカラム分離は、シリカゲルを使用し、低～高極性の溶媒勾配を用いた。粗血清抽出物をシリカゲルカラムに充填し、酢酸エチル中、より高いヘキサン濃度で出発し、メタノール中、より高いジクロロメタン濃度で終了する、溶媒で溶出した。溶出物を６つの異なる画分として収集し、減圧下で蒸発乾固させて、各画分の粗試料を得た。乾燥画分は、負の大気圧化学イオン化（ＮＡＰＣＩ，negative atmospheric pressure chemical ionization）下、飛行時間又は他の同様の質量分析技術によって解析され得る。フルスキャンフローインジェクションクロマトグラムは、ＧＴＡ－４４６バイオマーカーが、典型的には、Ｆ３（２０ｍｇ、２．２％回収率）において、他のＣ３６－ＧＴＡアナログ（ｍ／ｚ：５５０～６００ａｍｕ）とともに、６０：４０ ヘキサン／ＥｔＯＡｃの溶媒組合せで溶出することを示した（図５参照）。負のＡＰＣＩモードでの画分１及び２のクロマトグラフ解析は、脂肪酸不純物のほとんど［ｍ／ｚ：２５５．２（１６：０）、２７９．２（１８：２）、２８１．２（１８：１）、３０３．２（２０：４）］が溶出したことを指し示した。画分４の粗ドライダウン（crude dry down）の解析は、より極性の高いＣ３６－ＧＴＡの存在を指し示し、画分４の後に溶出した関連分子はなかった。
逆相フラッシュカラム分離は、Ｃ－１８結合シリカに依拠し、水中６０％アセトニトリルで出発し、９５％まで次第に増大し、１００％メタノール洗浄液で終了して、１００ｍｌずつの１５の画分を収集した。次いで、乾燥画分のフルスキャンフローインジェクションクロマトグラム（full scan flow injection chromatogram）を使用して、典型的には７５：２５及び８０：２０ ＡｃＣＮ：Ｈ２Ｏの溶媒組合せを持つ他のＣ２８－ＧＴＡアナログとともにＦ５及び６において現れる、ＧＴＡ－４４６を含有する画分を同定した（図６及び７）。後者の画分Ｆ７及び１２は、他のＣ２８－Ｃ３６－ＧＴＡアナログの組合せを含有していた。次いで、ＧＴＡ－４４６リッチ画分（Ｆ５及び６）を合わせて、６０％を上回るＧＴＡ－４４６を含有する別のＧＴＡ－４４６リッチ画分を得たが、試料中には依然として他のＣ２８及びＣ３６－ＧＴＡアナログがあった。純度をさらに改善するために、ＧＴＡ－４４６構造異性体を効率的に分割する、調節された２ステップのＨＰＬＣ分離を実施した。
ＦＣＣ分離と同様に、２ステップＨＰＬＣ分離は、初期逆相ステップ、続いて、分取ＨＰＬＣを使用する順相（シアノ（ＣＮ）カラム）ステップを含んでいた。逆相ＦＣＣ分離からのＧＴＡ－４４６濃縮画分を、ダイオードアレイ検出器及びＵＶ／ｖｉｓ吸収を用いる逆相カラムを使用する分取ＨＰＬＣ分離に適切な、適切な溶媒（１：１ ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＣＮ）に溶解した。次いで、異なる比の水：アセトニトリル：ギ酸を混合し、１４～２９分の間、３０秒溶出画分を収集することによって作製した２つの溶媒系を使用して、勾配溶出を３５分間かけて行った。収集された画分の解析は、ＧＴＡ－４４６濃縮が７５％を上回ることを示したが、不純物として他のＣ２８－ＧＴＡアナログがあった。
次いで、逆相分取ＨＰＬＣからのＧＴＡ－４４６濃縮画分をプールし、ヘキサン、ＥｔＯＡｃ及びギ酸を含むアイソクラティック溶媒で溶出するシアノ結合順相分取ＨＰＬＣカラムを使用するさらなる精製に供した。ＵＶカットオフ波長を、λ＝２５６ｎｍを超える値に設定して、ＥｔＯＡｃからのシグナル干渉を克服した。代替として、溶媒のスペクトル干渉を回避するためにＵＶ検出器をＭＳ検出器と取り換えてよく、ＭＳデータを使用するＧＴＡ－４４６の存在の検出のために、小容量の溶出剤を毎回試験してよく、これは、信頼できる検出方法を提供し得る。ＬＣＭＳによる第２の分取ＨＰＬＣ精製から収集された画分の解析は、典型的には、同様のタンデムＭＳパターンを示す複数の立体異性形態の９５％を超えるＧＴＡ－４４６の純度を指し示した。血清中の初期出発濃度に応じて、４０Ｌのヒト血清から、種々の画分の中でおよそ５ｍｇの精製されたＧＴＡ－４４６を得ることが可能であった。
図８は、分取ＨＰＬＣ－ＲＰ分離からのＮＡＰＣＩにおけるＧＴＡ－４４６リッチ試料のフルスキャンクロマトグラムを示す。
ヒト血清からのＧＴＡ－４４６単離のための実験プロトコール
この例では、１２０ｍｌの解凍及びよく混合したSeracare社製血清を、２０００ｍｌの目盛り付きガラスボトルに添加した。同じボトルに、内容物を旋回させながら、０．１％ギ酸で酸性化した２４０ｍｌのメタノールをゆっくりと添加した。混合物を、タンパク質沈殿の完了のために５分間にわたって静置させた。次に、同じフラスコに、４８０ｍｌの酢酸エチル溶液をゆっくりと添加した。混合物をさらに５分間にわたって静置させた。次いで、溶液を手で撹拌して、均質化混合物を得て、１６個の５０ｍｌのファルコンチューブに等しく（約５２．５ｍｌ／チューブ）配分した。これらを１０分間にわたって遠心分離して（３５００ｒｐｍ／４℃）、沈殿物を気密パレットに押し込むと、液体から十分に分離したチューブの底に留まった。上清を、４８０ｍｌのヘキサンを含有する分液漏斗に移し、よく振とうし、相を分離させた。有機相を、質量分析法により、ＧＴＡ－４４６の存在について解析した。底部水性相を収集し、さらなる抽出のためにヘキサンの第２の漏斗に移した。上部有機層を無水硫酸ナトリウム下で乾燥させ、濾過し、減圧下で乾燥させて、ヒト血清の粗有機抽出物（４５Ｌの血清を処理して合計２０８．０５ｇ）を得た。
上記の沈殿方法から得られた合計２０８ｇの粗有機抽出物を、順相（normal phase）フラッシュカラムクロマトグラフィー分離に供した。カラム条件及び溶媒勾配を表２にまとめる。カラム直径、シリカゲルの重量及び溶出剤の容量を、使用した際の粗有機抽出物の重量に対してスケールアップした。
Figure 0007348649000059
圧縮空気をフラッシュして気泡の捕捉を回避して装填の均質化を得ながら、ヘキサンを使用してカラムを取り付けた。３０ｇの粗抽出物を、最小容量のＤＣＭに溶解し、カラムに取り付けた。画分を収集し、ＧＴＡを含有する各画分（Ｆ８～Ｆ１３）のＬＣＭＳ解析に基づき、減圧下で蒸発乾固させ、ドライダウンされたものをさらなる分離に使用した。他の画分を廃棄した。２０８ｇの粗有機抽出物を処理して合計約３ｇを収集した。
プールＦＣＣ－ＮＰ画分（Q-Starデータに基づくＦ８～Ｆ１３から）を含有する合計２．５ｇのＧＴＡ－４４６を、ＦＣＣ－ＲＰでさらに分離した。カラム条件及び溶媒勾配を表３にまとめる。カラム直径、シリカゲルの重量及び溶出剤の容量を、使用した際の粗有機抽出物の重量に対してスケールアップした。
Figure 0007348649000060
アセトニトリルを使用してカラムを取り付け、圧縮空気をフラッシュして気泡の捕捉を回避して装填の均質化を得ながら、６０：４０ ＡｃＣＮ：Ｈ２Ｏで平衡させた。１ｇの粗抽出物を、１：１ ＡｃＣＮ：ＤＣＭを使用して溶解し、カラムに取り付けた。画分を収集し、ＬＣＭＳによって解析した。ＧＴＡ－４４６の大部分がＡｃＣＮ／Ｈ２Ｏ ７０／３０の組合せによって溶出し、より少ない量が、６５／３５のＡｃＣＮ／Ｈ２Ｏを使用する最終画分において溶出した。これらの画分を減圧下で乾燥させ、重量を決定した。２．５ｇの粗有機抽出物を処理して、合計およそ１．６ｇを収集した。これらを、その後、ＨＰＬＣにおけるさらなる精製に供した。
ＦＣＣ＿ＲＰからのＧＴＡ－４４６リッチプール（１４０ｍｇ）を、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２：ＡＣＮ中で可溶化して、１８０ｍｇ／ｍＬ溶液を産生し、これを、次の通りの逆相条件下で、分取ＬＣ精製のための充填物として使用した：溶媒Ａ＝Ｈ２Ｏ：ＡＣＮ：ギ酸（９５：５：０．０５）、溶媒Ｂ＝０．０５％ギ酸を加えたＡＣＮ、流速＝２５．５ｍＬ／分、温度＝周囲、λ＝２１０ｎｍカラム＝２１．２ｍｍ×１５０ｍｍ、５μｍ、分取ＨＴ XDB-C18（Agilent社、970150-902、SN.USMQ001200）溶媒組成＝３５分間にわたって７５％Ｂ 分別＝１４～２９分から合計で３０の画分（３０秒スライス）。表４に示される通り、ＵＶ吸収及び保持時間ウィンドウに基づき個々の画分をプールした。
Figure 0007348649000061
次いで、７つのプールされた試料を、逆及び順相両方のクロマトグラフィーを使用するＬＣＭＳにおいて解析して、ＧＴＡ－４４６単離及び他の考えられる不純物干渉の程度を視覚化した。プールされた試料５、５Ｂ及び７はいずれも、単離されたＧＴＡ－４４６レベルを示した。プール５及び５ａの逆相ＬＣＭＳは、ＧＴＡ－４４６がほぼ完全に単離されたことを示したが、順相ＬＣＭＳスペクトルは、異なる異性体及び他の微量不純物の間を分割するために、順相におけるさらなる精製が必要とされることを示した。
２５．７ｍｇの逆相分取ＨＰＬＣ精製されたＧＴＡ－４４６リッチ試料を、１５０ｕｌのＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、下記のＬＣ条件を使用する順相分取ＨＰＬＣ（SBCN）においてさらに精製した。流速＝４ｍｌ／分、温度＝周囲、カラム＝９．４ｍｍ×３００ｍｍ、５μｍ、Zorhax SB-CN（Agilent社）、注入容量４０ｕｌ。ＬＣ勾配は、表５に示される通りであった。
Figure 0007348649000062
表６に示す通りの保持時間ウィンドウに基づいて画分をプールした。
Figure 0007348649000063
プールされた試料のそれぞれをＬＣＭＳにおいて解析し、許容される精製（９５％を超えるＧＴＡ－４４６）を示した。３つのＧＴＡ－４４６同位体が、プール１、２及び４において、それぞれ２．２、３．２及び３．８分の異なるｔＲで同定された。プール３はごくわずかであり、プール５は、標的のさらなる回収のために同じ条件下で再精製され得るカラム洗浄液をほとんど含有していた。プールされた試料を乾燥させ、秤量し、完全な構造解明のためにＮＭＲ分光法において解析した。各異性体についての最終重量は、表７に示される通りであった。
Figure 0007348649000064
ＧＴＡ－４４６の構造的特性決定
精製された異性体を、１Ｈ、１３Ｃ等の１Ｄ ＮＭＲ実験、並びにＨ－Ｈ（ＣＯＳＹ）、Ｈ－Ｃ（ＨＭＱＣ）及びロングレンジＣ－Ｈ（ＨＭＢＣ）カップリングのような２Ｄ実験において解析して、ＧＴＡ－４４６の完全な構造解明を得た。最も豊富な異性体の構造を、ＭＳ（図９、１０）及びＮＭＲ分光法（図１１～１４）を使用して得られたスペクトル情報を使用し、解明した。ＧＴＡ－４４６のタンデムＭＳスペクトルの評価（ｍ／ｚ４４５．３（Ｍ－））は、異なる強度におけるＨ２Ｏ（Ｍ－－１８）、ＣＯ２（Ｍ－－４４）、２×Ｈ２Ｏ（Ｍ－－３６）及びＣＯ２＋Ｈ２Ｏ（Ｍ－－６２）の損失を示唆している。この強度パターンは独自であり、任意の血清由来のＧＴＡ－４４６のＭＳ／ＭＳフラグメンテーションに一致する。ＣＯ２の損失は、これらが考えられるカルボン酸であるという結論につながった。水の損失は、最初は、それらがヒドロキシル基を含有することを示唆し、水及び二酸化炭素の損失は、一緒になって、カルボキシル及びヒドロキシル官能性が、単一カルボキシル基からよりも互いに分離されるべきであることを示唆していた。加えて、ＭＳ／ＭＳは、２つのヒドロキシル基の存在を示唆したのに対し、フラグメントｍ／ｚ２２３は、２つの同様の実体への構造の開裂を指し示し、これは、２つの同様の構造成分間の考えられる架橋系を示唆するものであった。しかしながら、ＭＳ／ＭＳ情報を用いた完全構造の解釈だけは難しかった。
したがって、精製されたＧＴＡ－４４６の１Ｈ ＮＭＲを実施し、これは、８つのメチレンプロトン（δ５．５～６．２ｐｍ）、２つの末端メチル基（－ＣＨ２ＣＨ３、δ０．８４及び０．８９ｐｍ、それぞれ３Ｈ、ｔ）、及び２つの－ＣＯＯＨ基からのδ１２．０ｐｐｍにおける広幅ピークからのシグナル、並びにδ０．９８～２．４８ｐｐｍのＣＨ２及びＣＨ基の他の３４のシグナルを示した（図１１参照）。１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルは、８個のメチレン炭素（δ１２６～１３６ｐｍ）、２つの末端メチル基（－ＣＨ２ＣＨ３、δ１４．０及び１４．１ｐｍ）、及び２つの－ＣＯＯＨ基からのδ１８１．２、１８１．４ｐｐｍにおける２個のカルボニル炭素、４５．９、４７．０ｐｐｍにおける２個のメチレン炭素からのシグナル、δ２２．１～３４．１ｐｐｍにおけるＣＨ２基の１４の二次炭素シグナルを示した（図１２参照）。１Ｈ－１Ｈ ＣＯＳＹ解析は、２つの共役系を示した（図１３）。Ｅ，Ｅ及びＥ，Ｚ配置は、それらのカップリング定数から推測した。詳細な構造情報は、ＨＭＱＣ及びＨＭＢＣ解析から得、これは、９及び５’位における２つの鎖間の結合を明確に示した（図１４、１５）。これらのスペクトル情報を使用して、ＧＴＡ－４４６の構造は、式Ｉ：
Figure 0007348649000065
に示される通り、９－（５’－（６’Ｅ，８’Ｚ）－テトラデカ－ジエン酸）－（５Ｅ，７Ｅ）－テトラデカ－ジエン酸（（５Ｅ，７Ｅ，１１Ｅ，１３Ｚ）－９－ペンチル－１０－（４’－ブタン酸））－ノナデカテトラエン酸）と解明された。
ＧＴＡ－４４６のための提案される合成経路
合成ＧＴＡ－４４６及び関連化合物を調製するための、提案される合成経路の実施形態を以下に記載する。この例は、当業者に向けたものであること、並びに、種々の修正、代替、追加、削除及び／又は置換が為され得ることが理解されるであろう。
化合物１５及び化合物１６（参照標準として）の合成は、次の通りに提案され得る。
Figure 0007348649000066
スキーム１に示される通り、化合物１７と化合物１８との間のマイケル付加は、化合物１９を生成し得る。化合物１９に適用されるウィッティヒ反応は、化合物２０を生成し得る［１］。化合物２０をメタノール（［２］又はオルトギ酸トリメチル［３］及び酸で処理することは、ジメチルアセタール化合物２１を生成し得る。化合物２０のメタノリシスは、ヒドロキシルエステル化合物２２を生成し得る。化合物２２のスワーン酸化は、アルデヒド化合物２３を産生し得る。アルデヒドのトリフル酸無水物との反応は、ビニルトリフレート化合物２４を産生し得る［４，５］。
スキーム２に示される通り、化合物２４と化合物２５の薗頭カップリングは、化合物２６を生成し得る［６］。リンドラー触媒を使用するその後の還元は、シス－オレフィン化合物２７を生成し得る。メチルエステルの還元は、アルコール化合物２８を生成し得る。メタンスルホニルクロリドとの反応は、化合物２８をメシレート化合物２９に変換し得る。メシレートのマロン酸ジメチルによる置きかえは、化合物３０を生成し得る。化合物３０を酸で処理すると、同時アセタール開裂、エステル加水分解及び脱炭酸が、アルデヒド化合物３１を生成し得る。例えば（トリフェニルホスホラニリデン）アセトアルデヒド又は（４－カルボキシブチル）トリフェニルホスホニウムブロミドとの最終ウィッティヒ反応は、化合物１５の合成を完了し得る。
スキーム３に示される通り、化合物２４と化合物３２との間の鈴木反応は、化合物３３を生成し得る［７］。故に、化合物１６の完成は、スキーム２において例証される通りの化合物２８から化合物１５への変換のためと同じ戦略に準拠する。
化合物１７は、Sigma Aldrich社から入手可能であり、化合物１８は、Sigma Aldrich社から入手可能であり、化合物２５は、Sigma Aldrich社から入手可能であり、化合物３２は、Sigma Aldrich社から入手可能である。すべてのウィッティヒ試薬は、Sigma Aldrich社から入手可能である。
合成参考文献（そのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）：
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［２］Andrade, Juan et al; Acetals; Ger. Offen., 3403426, 01 Aug 1985
［３］Yan, Jingqi et al; Method for preparing acetal by using acraldehyde; Faming Zhuanli Shenqing, 102276427, 14 Dec 2011
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［７］Pirovano, Valentina et al; Gold-catalyzed synthesis of tetrahydrocarbazole derivatives through an intermolecular cycloaddition of vinyl indoles and N-allenamides; Chemical Communications, 49(34), 3594-3596; 2013
ＧＴＡ－４４６中間体化合物２４のための追加の提案される合成経路
合成ＧＴＡ－４４６及び関連化合物を調製するための、提案される合成経路の実施形態が実施例４に記載されており、これは、中間体化合物２４を経由して進む。この例では、化合物２４の調製のための別の実施形態が提案される。この例は当業者に向けたものであること、並びに、種々の修正、代替、追加、削除及び／又は置換が為され得ることが理解されるであろう。
スキーム４に示される通り、３－ヒドロキシプロピオンアルデヒド化合物３８を、ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ，tert-butyl diphenylsilyl）エーテル等のシリルエーテルとして保護して、化合物３９を得ることができる。その後の脱水によるアルドール縮合は、化合物４０を生成し得る。化合物４０とヘプタナール（化合物１８、スキーム１）との間のマイケル付加は、化合物４１を生成し得る。化合物４１に適用されるウィッティヒ反応は、化合物４２を生成し得る。化合物４２をＤＭＳＯ及びＮａＣｌで処理することは、化合物４３を生成し得る。化合物４３のメタノール又はオルトギ酸トリメチル及び酸との反応は、ジメチルアセタール化合物４４を生成し得る。化合物４４のフッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ，tetrabutylammonium fluoride）との反応は、化合物２２を生成し得る。化合物２２から化合物２４への前進は、実施例４において記載されている通りに進み得る。
１又は２以上の例証的な実施形態を例として記載してきた。本願の請求項に記載の本発明の範囲から逸脱することなく、若干数の変形及び修正が為され得ることが、当業者には理解されるであろう。
（参考文献）
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本明細書の上記（参考文献）に記載されたすべての文献及び他の箇所で引用されたすべての文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (46)

  1. 式Ｉ若しくは式III：
    の構造を有する化合物、その塩又は同位体標識化合物。
  2. 化合物、その塩又は同位体標識化合物が単離化合物である、請求項１に記載の化合物、その塩又は同位体標識化合物。
  3. 化合物、その塩又は同位体標識化合物が合成的に調製された化合物である、請求項１又は２に記載の化合物、その塩又は同位体標識化合物。
  4. 化合物、その塩又は同位体標識化合物が解析標準化合物である、請求項１～３のいずれかに記載の化合物、その塩又は同位体標識化合物。
  5. 式Ｉ若しくは式III：
    の構造内に組み込まれた１若しくは２以上の同位体標識を含む同位体標識化合物、又はその塩。
  6. １又は２以上の同位体標識が、安定同位体標識、放射性同位体標識、又はそれらの組合せである、請求項５に記載の同位体標識化合物。
  7. １又は２以上の同位体標識が、重水素（２Ｈ）及び１３Ｃからなる群から選択される、請求項５又は６に記載の同位体標識化合物。
  8. １又は２以上の同位体標識が、三重水素（３Ｈ）及び１４Ｃからなる群から選択される、請求項５又は６に記載の同位体標識化合物。
  9. 同位体標識化合物が、
    すべての炭素－炭素二重結合がトランス配置である、


    若しくは前記同位体標識化合物の誘導体、又はその塩である、請求項５～７のいずれかに記載の同位体標識化合物。
  10. 化合物が、解析標準化合物である、請求項５～９のいずれかに記載の同位体標識化合物。
  11. 請求項５～９のいずれかに記載の同位体標識化合物を含む、代謝トレーサー組成物。
  12. 請求項１～９のいずれかに記載の化合物、その塩又は同位体標識化合物と、賦形剤、担体又は希釈剤とを含む、組成物。
  13. 請求項５～９のいずれかに記載の同位体標識化合物を含む、インビトロ又はインビボ診断剤。
  14. 試料中における消化管酸（ＧＴＡ）のレベルを決定するための方法であって、
    前記試料からのＧＴＡ検出シグナルを測定するステップであって、前記ＧＴＡ検出シグナルが前記試料中における前記ＧＴＡレベルを表している前記ステップと、
    測定された前記ＧＴＡ検出シグナルを校正基準と比較することによって、前記試料中における前記ＧＴＡのレベルを定量化するステップとを含み、ＧＴＡが、
    である、前記方法。
  15. ＧＴＡ検出シグナルが、質量分析法によって測定される、請求項１４に記載の方法。
  16. 校正基準が、請求項５～１０のいずれかに記載の化合物の既知量を使用して作成された標準曲線を含む、請求項１４～１５のいずれかに記載の方法。
  17. 校正基準が、請求項５～１０のいずれかに記載の同位体標識化合物の既知量で試料をスパイクするステップ、及び
    前記試料からの内部標準シグナルを測定するステップであって、前記内部標準シグナルが前記試料にスパイクされる前記同位体標識化合物の前記既知量を表している、前記の測定するステップによって得られる、
    請求項１４～１５のいずれかに記載の方法。
  18. 内部標準シグナルが、質量分析法によって測定される、請求項１７に記載の方法。
  19. 測定されたＧＴＡ検出シグナルによって表される、試料中におけるＧＴＡレベルの、内部標準シグナルによって表される、前記試料にスパイクされた同位体標識化合物の既知量に対する比を決定するステップをさらに含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
  20. 校正基準が、可変ＧＴＡ／同位体標識化合物比と前記比が比較される濃度との一連の混合物から生成された同位体希釈曲線（ＩＤＣ）を含む、請求項１９に記載の方法。
  21. ＩＤＣが、ＧＴＡ含有量が固定量の同位体標識化合物に対して変化する一連の混合物から生成される、請求項２０に記載の方法。
  22. 同位体標識化合物の固定量が、試料にスパイクされた同位体標識化合物の既知量と実質的に同じである、請求項２１に記載の方法。
  23. 試料中における消化管酸（ＧＴＡ）のレベルを決定するための、請求項１～１０のいずれかに記載の化合物、その塩又は同位体標識化合物の使用。
  24. ＧＴＡが、
    である、請求項２３に記載の使用。
  25. 試料中における消化管酸（ＧＴＡ）のレベルを決定する際に使用するための校正基準を生成するための、請求項１～１０のいずれかに記載の化合物、その塩又は同位体標識化合物の使用。
  26. ＧＴＡが、
    である、請求項２５に記載の使用。
  27. 試料中における消化管酸（ＧＴＡ）のレベルを決定する際に使用するための内部標準としての、請求項５～９のいずれかに記載の化合物の使用。
  28. ＧＴＡが、
    である、請求項２７に記載の使用。
  29. 対象を、大腸がんにかかっている又は大腸がんになるリスクがあると認定するための診断を補助する方法であって、
    前記対象から得られた試料中における消化管酸（ＧＴＡ）のレベルを、
    前記試料からのＧＴＡ検出シグナルを測定することであって、前記ＧＴＡ検出シグナルが前記試料中における前記ＧＴＡレベルを表している、前記の測定すること、及び
    測定されたＧＴＡ検出シグナルを校正基準と比較することによって、前記試料中における前記ＧＴＡのレベルを定量化すること
    によって決定するステップであって、
    前記試料中における前記ＧＴＡの決定されたレベルが健常対照群と比較して低減していることが、前記対象が大腸がんにかかっている又は大腸がんになるリスクがあることを示す、ステップ
    を含み、
    前記ＧＴＡが、
    である、前記方法。
  30. ＧＴＡ検出シグナルが、質量分析法によって測定される、請求項２９に記載の方法。
  31. 校正基準が、既知量の請求項５～１０のいずれかに記載の化合物を使用して調製された標準曲線を含む、請求項２９又は３０に記載の方法。
  32. 対象から得られた試料中におけるＧＴＡのレベルを決定するステップが、
    前記試料を、請求項５～１０のいずれかに記載の同位体標識化合物の既知量でスパイクすること、及び
    前記試料からの内部標準シグナルを測定することであって、前記内部標準シグナルが前記試料にスパイクされた前記既知の分量の前記同位体標識化合物を表している、前記測定すること
    を含む、請求項２９又は３０に記載の方法。
  33. 内部標準シグナルが、質量分析法によって測定される、請求項３２に記載の方法。
  34. 測定されたＧＴＡ検出シグナルによって表される、試料中におけるＧＴＡレベルの、内部標準シグナルによって表される、前記試料にスパイクされた同位体標識化合物の既知量に対する比を決定するステップをさらに含む、請求項３２又は３３に記載の方法。
  35. 校正基準が、ＧＴＡ／同位体標識化合物の様々な比と前記比が比較される濃度との一連の混合物から生成された同位体希釈曲線（ＩＤＣ）を含む、請求項３４に記載の方法。
  36. ＩＤＣが、ＧＴＡ含有量が固定量の同位体標識化合物に対して変化する一連の混合物から生成される、請求項３５に記載の方法。
  37. 同位体標識化合物の固定量が、試料にスパイクされる同位体標識化合物の既知量と実質的に同じである、請求項３６に記載の方法。
  38. 式：
    を有する化合物、又はその同位体標識化合物。
  39. 式：
    を有する化合物、その塩又は同位体標識化合物の合成における、請求項３８に記載の化合物の使用。
  40. 式（Ｉ）：
    を有する化合物、又はその同位体標識化合物を合成するための方法であって、
    請求項３８に記載の化合物を用意するステップと、
    前記化合物を１－ヘプチンで薗頭カップリングを行うステップと、
    リンドラー触媒による還元を行うステップと、
    メチルエステル還元を行うステップと、
    メタンスルホニルクロリドとの反応を行うステップと、
    メシレートをマロン酸ジメチルで置きかえるステップと、
    アセタール開裂、エステル加水分解及び脱炭酸を同時に行うための酸処理を行うステップと、
    ウィッティヒ反応を行って、式Ｉの化合物又はその同位体標識化合物を生成するステップと
    を含み、
    前記請求項３８に記載の化合物又は前記方法における少なくとも１つの反応物質が、式Ｉの同位体標識化合物が合成される場合に、得られた式Ｉの化合物に組み込まれる少なくとも１個の同位体標識原子を含む、
    前記方法。
  41. ウィッティヒ反応が、（トリフェニルホスホラニリデン）アセトアルデヒド又は（４－カルボキシブチル）トリフェニルホスホニウムブロミドとの反応を含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 式Ｄ：
    [式中、
    Ｒ１は、－Ｓｎ（Ｒ１０）３、－ＯＴｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ｂ（ＯＨ）２又は
    であり、
    Ｒ２は、置換されていてもよい飽和若しくは不飽和Ｃ１－Ｃ２０アルキル、置換されていてもよい飽和若しくは不飽和Ｃ２－Ｃ２０アルケニル、又は置換されていてもよい飽和若しくは不飽和Ｃ２－Ｃ２０アルキニルであり、
    各Ｒ３は、独立して、置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキルであるか、又は前記Ｒ３基は、一緒になって、結合している酸素原子を架橋して５若しくは６員環を形成する、置換されていてもよいエチレン若しくはプロピレン基を形成し、
    Ｒ５は、置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキルであり、
    Ｒ１０は、置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキルである]
    を有する化合物又はその同位体標識化合物。
  43. 消化管酸（ＧＴＡ）の合成における、請求項４２に記載の化合物の使用。
  44. ＧＴＡが、式Ｎ若しくはＳ：
    の化合物、その塩又は同位体標識化合物である、請求項４３に記載の使用
    [式中、Ｒ２は、置換されていてもよい飽和若しくは不飽和Ｃ１－Ｃ２０アルキル、置換されていてもよい飽和若しくは不飽和Ｃ２－Ｃ２０アルケニル、又は置換されていてもよい飽和若しくは不飽和Ｃ２－Ｃ２０アルキニルであり、Ｒ６は、置換されていてもよい飽和若しくは不飽和Ｃ１－Ｃ２０アルキル、置換されていてもよい飽和若しくは不飽和Ｃ２－Ｃ２０アルケニル、又は置換されていてもよい飽和若しくは不飽和Ｃ２－Ｃ２０アルキニルである]。
  45. 請求項４４に記載の式Ｎ若しくはＳの化合物又はその式Ｎ若しくはＳの同位体標識化合物を合成するための方法であって、
    請求項４２に記載の化合物を用意するステップと、
    Ｒ１基を、置換されていてもよい飽和若しくは不飽和アルキル、置換されていてもよい飽和若しくは不飽和アルケニル又は置換されていてもよい飽和若しくは不飽和アルキニルで置きかえるために、カップリング反応を行い、更に必要に応じて還元を行ってもよいステップと、
    Ｒ５含有エステルをヒドロキシル基に変換するステップと、
    前記ヒドロキシル基を脱離基に変換するステップと、
    前記脱離基をマロン酸ジアルキルで置きかえるステップと、
    アセタール加水分解、エステル加水分解及び脱炭酸を行って、アルデヒドを形成するステップと、
    前記アルデヒドにおいてカップリング反応を行って、式Ｎ若しくはＳの化合物又はその同位体標識化合物を生成するステップとを含み、
    前記請求項４２に記載の化合物又は前記方法における少なくとも１つの反応物質が、式Ｎ又はＳの同位体標識化合物が合成される場合に、得られた式Ｎ若しくはＳの化合物に組み込まれる少なくとも１個の同位体標識原子を含む、
    前記方法。

  46. 若しくはそれらの任意の組合せ、
    その塩又は同位体標識化合物
    である、請求項１～１０のいずれかに記載の化合物。
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