CN103204925A

CN103204925A - 一种免疫检测用邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的合成方法

Info

Publication number: CN103204925A
Application number: CN2013101034195A
Authority: CN
Inventors: 胥传来; 刘丽强; 王利兵; 匡华; 徐利广; 马伟; 胡拥明
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2013-03-28
Filing date: 2013-03-28
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2033-03-28
Also published as: CN103204925B

Abstract

一种免疫检测用邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明包括如下步骤：邻苯二甲酸与6-(芴甲氧羰酰基-氨基)-1-己醇发生酯化反应，再脱去芴甲氧羰酰基保护基，形成半抗原，再与载体蛋白上的氨基进行偶联，得到邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原。实验结果表明，用本发明的抗原免疫动物得到的抗血清效价可达160000，对DBP、DEHP，DINP的半抑制浓度IC₅₀均小于500ng/mL，产生的抗体通用性好，灵敏度高。本发明的抗原或抗体可用于建立酶联免疫吸附分析方法和胶体金试纸快速检测法，从而用于快速检测食品中的邻苯二甲酸酯类塑化剂残留，具有广阔的应用前景。

Description

一种免疫检测用邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的合成方法

技术领域

一种免疫检测用邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

塑化剂（Plasticizer），是一种增加材料的柔软性或是材料液化的添加剂。其中最常见的塑化剂是邻苯二甲酸酯类物质（Phthalate Esters, PAEs），是邻苯二甲酸的酯化衍生物。

邻苯二甲酸酯塑化剂是具些许芳香气味或无气味的无色液体，中等黏度、高稳定性、低挥发性、成本低廉、低水溶解度，但易溶于多数有机溶剂中。邻苯二甲酸酯类在日常及工业上被广泛使用，以邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）为最大宗，占塑化剂产量的四分之三，其次是邻苯二甲酸二丁酯（DBP）。邻苯二甲酸酯类塑化剂被归类为疑似环境荷尔蒙，其生物毒性主要属雌激素与抗雄激素活性，会造成内分泌失调，阻害生物体生殖机能，包括生殖率降低、流产、天生缺陷、异常的精子数、睪丸损害，还会引发恶性肿瘤、造成畸形儿。

目前我国对邻苯二甲酸酯塑化剂的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、液质联用法（LC/MS）、酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、胶体金试纸条法等。仪器分析方法存在样品须经多步稀释、过滤、提取，制备复杂、繁琐的缺点。尽管仪器分析方法是邻苯二甲酸酯塑化剂检测的确证方法，但是由于其操作繁琐，以及长时间的样本前处理过程，导致检测成本高，周期长，无法满足大批量样本快速筛查，以及现场快速检测的要求。ELISA和胶体金试纸条法属于免疫分析技术，具有较高的灵敏度和特异性，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。

影响免疫分析方法的关键因素在于特异性的抗原和抗体。目前常见的方法是在邻苯二甲酸酯的苯环上引入活性氨基然后与载体蛋白偶联，暴露出邻苯二甲酸酯类的侧链基团为抗原决定簇，此种方法得到的完全抗原通过免疫后，只对特定的邻苯二甲酸酯物质产生较好的抑制效果，交叉反应率较小，得到的抗体无法用于邻苯二甲酸酯类的通用检测。

本发明从邻苯二甲酸酯类分子的侧链着手，合成了邻苯二甲酸酯类通用半抗原，暴露出邻苯二甲酸酯类共同的苯环和部分侧链基团，作为抗原决定簇，将半抗原与载体蛋白偶联最后形成人工抗原。

发明内容

本发明的目的：针对现有邻苯二甲酸酯类抗原合成技术以及相应抗体的不足和缺陷，提供一种新型的邻苯二甲酸酯类半抗原以及人工抗原的合成方法，使得制备通用的、能用于多残留检测的邻苯二甲酸酯类单克隆抗体成为可能。

本发明提供的邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原化合物，具有式I所示分子结构：

（式I）

本发明的技术方案：一种免疫检测用邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的合成方法，合成路线为：

以邻苯二甲酸与6-(芴甲氧羰酰基-氨基)-1-己醇发生酯化反应，再脱去芴甲氧羰酰基保护基，形成半抗原，半抗原通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC与N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化，或者通过三正丁胺与氯甲酸异丁酯活化，再与载体蛋白进行偶联，得到邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原，步骤如下：

（1）邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原的制备

取0.5～1g邻苯二甲酸，1mL6-(芴甲氧羰酰基-氨基)-1-己醇，钛酸四丁酯10μL，二环己基碳二亚胺(DCC) 10mg，95℃反应12h，加入1M NaOH水溶液，中和反应液至pH 7.4～8，分层后弃水相，有机相再洗涤一次，减压35℃旋蒸，脱醇。在产物中加入10mL含20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，室温反应20min，脱去芴甲氧羰酰基保护基团，得到邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原（式1）。

（2）邻苯二甲酸酯类塑化剂通用人工抗原的制备

取邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，4℃下加入2.5%戊二醛溶液，半抗原:戊二醛的摩尔比为1:1.5，避光混匀搅拌反应1h，得活化的半抗原溶液；

取牛血清白蛋白，半抗原与牛血清白蛋白的摩尔比为80:1，用0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液溶解,其中溶解后的牛血清白蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的体积比例为5:1；在0℃下，将活化的半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，0℃反应1h，室温下反应6h；用PBS缓冲液透析2天，期间更换PBS缓冲液4次，即得到邻苯二甲酸酯类塑化剂通用人工抗原。

所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH、鸡卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HSA之一种。

所述的邻苯二甲酸，6-(芴甲氧羰酰基-氨基)-1-己醇纯度均大于95%。

上述邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原或人工抗原化合物在制备邻苯二甲酸酯类塑化剂通用抗体中的应用也属于本发明的保护范围。

上述邻苯二甲酸酯类塑化剂通用人工抗原化合物免疫动物得到的抗体也属于本发明的保护范围，所述抗体为多克隆抗体和/或单克隆抗体。

上述邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原或人工抗原化合物或抗体在检测邻苯二甲酸酯类塑化剂中的应用也属于本发明保护的范围，检测食品中的邻苯二甲酸酯类塑化剂残留。

邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原抗原决定簇为：

本发明的有益效果：本发明是新型的邻苯二甲酸酯类塑化剂通用人工抗原的合成方法，人工抗原呈现出的通用性的邻苯二甲酸酯类塑化剂抗原决定簇，使得筛选出通用性的邻苯二甲酸酯类塑化剂单克隆抗体成为可能。

实验结果表明，用本发明的抗原免疫动物得到的抗血清效价可达160000，对DBP、DEHP，DINP的半抑制浓度IC₅₀均小于500ng/mL。产生的抗体通用性好，灵敏度高。本发明的抗原或抗体可用于建立酶联免疫吸附分析方法和胶体金试纸快速检测法，从而用于快速检测食品中的邻苯二甲酸酯类塑化剂残留。

附图说明

图1邻苯二甲酸酯类塑化剂通用人工抗原紫外光谱图。

具体实施方式

下述实例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原的制备

取0.5g邻苯二甲酸，1mL6-(芴甲氧羰酰基-氨基)-1-己醇，钛酸四丁酯10μL，二环己基碳二亚胺(DCC)10mg，95℃反应12h，加入1M NaOH水溶液，中和反应液至pH7.4～8，分层后弃水相，有机相再洗涤一次，减压35℃旋蒸，脱醇。在产物中加入10mL含20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，室温反应20min，脱去芴甲氧羰酰基保护基团，得到邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原。

实施例2、邻苯二甲酸酯类塑化剂通用人工抗原的制备

取25mg（0.0686mmol）邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原，加入2mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，4℃下，加入质量浓度2.5%戊二醛溶液0.5mL（0.1mmol），避光混匀，搅拌反应1h，取58.3mg（0.000857mmol）牛血清白蛋白（半抗原与牛血清白蛋白的摩尔比为80:1），用10mL0.1MpH9.6碳酸盐缓冲液溶解,其中溶解后的牛血清白蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的体积比例为5:1。在0℃下，将活化的半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，0℃反应1h，室温下反应6h。用PBS缓冲液透析2天，期间更换PBS缓冲液4次，即得到邻苯二甲酸酯类塑化剂通用人工抗原。

实施例3、邻苯二甲酸酯类塑化剂抗血清的制备

以实施例2制得的邻苯二甲酸酯类塑化剂通用人工抗原为免疫原，选用6-8周龄，雌性BALB/C小鼠为免疫动物，采用弗氏佐剂进行免疫，免疫小鼠5只。弗氏佐剂免疫方法为：首免取适量免疫原与等体积弗氏完全佐剂混合，乳化好后经颈背部皮下多点注射免疫，每间隔3周加强免疫一次。

实施例4、邻苯二甲酸酯类塑化剂抗血清的测定

一、采用间接ELISA方法检测血清效价，具体操作步骤如下：

1)包被：将实施例2中制得的邻苯二甲酸酯类塑化剂通用人工抗原用0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液从10μg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h。

2)洗涤：将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min。

3)封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。

4)加样：将实施例3制得的邻苯二甲酸酯类塑化剂抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应1h；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应1h。

5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min。

6)终止和测定：每孔加入100μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD₄₅₀值。

7)结果判读：以OD₄₅₀值大于或等于阴性对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。

二、最低检测限、半数抑制以及特异性的检测

具体操作步骤如下：

1)用上述的间接ELISA方阵滴定法确定包被原和抗体的工作浓度，以OD₄₅₀值在1.5左右时所对应的抗原和抗体浓度为最适工作浓度。

2)包被：将包被原用包被缓冲液稀释至最适工作浓度，100μL/孔，37℃反应2h。

3)洗涤和封闭：方法操作同上述间接ELISA法。

4)配制DBP、DEHP、DINP标准溶液：将DBP、DEHP、DINP标准品用甲醇溶液配制成1mg/mL的母液，然后，在加样前，再用0.01mol/L，pH7.4的PBS溶液倍比稀释成需要浓度。

5)加样：每孔加入50μL倍比稀释的DBP、DEHP、DINP各浓度标准品，然后再加入50μL /孔最适稀释倍数的抗血清，37℃反应1h。充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应1h。

6)显色反应：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min。

7）终止和测定：每孔加入100μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD₄₅₀值。

8）数据处理：以DBP、DEHP、DINP各浓度的对数为横坐标，以DBP、DEHP、DINP各浓度对应的OD值为纵坐标，绘制标准曲线，计算半数抑制浓度（IC₅₀，即OD₄₅₀值从零标准溶液对应的A0下降到50%时所对应的标准品浓度），从而判定抗血清对DBP、DEHP、DINP是否具有特异性。

结果显示，四免后，小鼠抗血清效价可达160000，对DBP、DEHP，DINP的半抑制浓度均小于500ng/mL，产生的抗体通用性好，灵敏度高。

Claims

1.一种免疫检测用邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的合成方法，其特征在于：以邻苯二甲酸与6-(芴甲氧羰酰基-氨基)-1-己醇发生酯化反应，再脱去芴甲氧羰酰基保护基，形成半抗原，半抗原通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC与N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化，或者通过三正丁胺与氯甲酸异丁酯活化，再与载体蛋白进行偶联，得到邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原，步骤如下：

（1）邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原的制备

取0.5～1g邻苯二甲酸，1mL6-(芴甲氧羰酰基-氨基)-1-己醇，钛酸四丁酯10μL，二环己基碳二亚胺DCC10mg，95℃反应12h，加入NaOH水溶液，中和反应液至pH7.4～8，分层后弃水相，有机相再洗涤一次，减压35℃旋蒸脱醇；在产物中加入10mL含20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺DMF溶液，室温反应20min，脱去芴甲氧羰酰基保护基团，得到邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原；

（2）邻苯二甲酸酯类塑化剂通用人工抗原的制备

取邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原加入N,N-二甲基甲酰胺DMF溶解，4℃下加入2.5%戊二醛溶液，半抗原:戊二醛的摩尔比为1:1.5，避光混匀搅拌反应1h，得活化的半抗原溶液；

取牛血清白蛋白，半抗原与牛血清白蛋白的摩尔比为80:1，用0.1M pH9.6碳酸盐缓冲液溶解,其中溶解后的牛血清白蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与N,N-二甲基甲酰胺DMF的体积比例为5:1；在0℃下，将活化的半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，0℃反应1h，室温下反应6h；用PBS缓冲液透析2天，期间更换PBS缓冲液4次，即得到邻苯二甲酸酯类塑化剂通用人工抗原。

2.根据权利要求1所述免疫检测用邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的合成方法，其特征在于：所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、匙孔血蓝蛋白KLH、血蓝蛋白LPH、鸡卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HSA之一种。

3.根据权利要求1所述免疫检测用邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的合成方法，其特征在于：邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原的分子结构式如式I所示：

式I。

4.用权利要求1所述方法合成的邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的应用，其特征在于制备邻苯二甲酸酯塑化剂通用抗体，所述抗体为多克隆抗体和/或单克隆抗体。

5.用权利要求1所述方法合成的邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的应用，其特征在于在检测邻苯二甲酸酯类塑化剂中的应用，检测食品中的邻苯二甲酸酯类塑化剂残留。