CN109651503A - 一种人工抗原的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人工抗原的制备方法及其应用，该制备方法包括通过交联剂将载体蛋白和N1‑乙酰精胺或N‑乙酰半胱氨酸甲酯偶联，得到人工抗原。本发明还公开了由上述制备方法制备的人工抗原，以及由上述人工抗原所产生的抗体在检测N1,N12‑二乙酰精胺中的应用。此外，本发明还公开了上述抗体在ELISA法、胶体金免疫层析法等免疫学检测方法中的应用。

Description

一种人工抗原的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种人工抗原的制备方法。
背景技术
肿瘤标志物(Tumor Marker，TM)是能反映肿瘤发生和发展情况的一类物质。在肿瘤早期筛查、疗效评价、预后监控等方面都具有较大的实用价值。而目前发现的肿瘤标志物均不具有100％的灵敏度，这是由于这些肿瘤标志物大多并非肿瘤细胞所特有，不仅肿瘤发生时表达，在正常或某些良性疾病发生时也会有不同程度的表达，并且这些肿瘤标志物的产生通常会受到机体内多种因素干扰。因此，选择一些高特异性的肿瘤标志物联合使用有利于提高肿瘤诊断的准确性。
多胺广泛存在于生物体内，是代谢过程中产生的低分子量的脂肪族胺类化合物。哺乳动物体内的多胺主要包括：腐胺、尸胺、亚精胺和精胺。亚精胺和精胺又存在单乙酰化和双乙酰化两种形式，包括N1-乙酰亚精胺、N8-乙酰亚精胺、N1,N8-二乙酰亚精胺、N1-乙酰精胺和N1,N12-二乙酰精胺(DiAcSpm)。DiAcSpm是精胺的二乙酰化衍生物，健康人尿液中的DiAcSpm含量占总多胺含量的0.46％。癌症患者尿中DiAcSpm含量也显著升高，并且尿中DiAcSpm含量个体差异较小，以DiAcSpm含量变化来筛查癌症相对于总多胺或其他多胺类，假阴性和假阳性的发生率低。有研究报道泌尿生殖系统癌症患者尿中DiAcSpm含量显著升高，是正常人的15-70倍，某些良性病患者尿DiAcSpm含量也有所升高，但不会超过正常值的3倍。而癌症患者尿液中总多胺、乙酰腐胺、N1-乙酰亚精胺和N8-乙酰亚精胺的含量仅为正常值的4-6倍，并且在一些良性病患者尿液中也有一定升高。
目前，针对DiAcSpm的检测方法主要有HPLC、LC-MS等仪器分析方法和ELISA、胶体金等免疫学分析方法。仪器分析方法设备昂贵、操作复杂，不适合临床样本的大量快速检查。
发明内容
针对相关技术中的问题，本发明研究了一种免疫原性较高的人工抗原的制备方法。
本发明提供的人工抗原的制备方法，包括：通过交联剂将载体蛋白和半抗原N1-乙酰精胺或N-乙酰半胱氨酸甲酯偶联，得到人工抗原。
在上述制备方法中，所述交联剂为辛二酸二琥珀酰亚胺酯类交联剂或戊二醛。
在上述制备方法中，将1-20mg所述载体蛋白、0.5-2.5mg所述辛二酸二琥珀酰亚胺酯类交联剂和1-20mgN1-乙酰精胺溶于2-20mL 0.01M的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌3-5h，得到人工抗原1。
在上述制备方法中，将1-20mg所述载体蛋白溶解到1-5mL0.2-0.8mol/L戊二醛溶液中，然后加入1-20mg N1-乙酰精胺，搅拌4-8h，得到人工抗原2。
在上述制备方法中，将0.5-2.5mg所述辛二酸二琥珀酰亚胺酯类交联剂溶解在磷酸盐缓冲液中，加入到1-20mg所述载体蛋白，将溶解后的N-乙酰半胱氨酸甲酯缓慢滴加到上述溶液中，搅拌，过夜，得到人工抗原3。
一种根据上述制备方法制备的人工抗原。
一种由上述人工抗原产生的抗体。
上述抗体在检测N1,N12-二乙酰精胺中的应用。
上述抗体在免疫学检测中的应用。
本发明提供了N1,N12-二乙酰精胺的人工抗原的制备方法，通过交联剂将载体蛋白与N1-乙酰精胺或N-乙酰半胱氨酸甲酯偶联来得到免疫原性较高的人工抗原，该人工抗原的制备方法简单，可在短时间内完成。制备出的人工抗原批次差异小，免疫原性高。该人工抗原可诱导人体/动物产生针对N1,N12-二乙酰精胺的高特异性抗体，进而利用抗体建立不同的免疫学测定方法，从而对人的尿液、血清及其他组织液中N1,N12-二乙酰精胺的含量进行检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是半抗原偶联后的SDS-PAGE图谱。
图2是半抗原偶联后的SDS-PAGE图谱。
图3是ELISA标准曲线。
图4是胶体金试纸条检测结果，图4示出DiAcSpm在不同浓度下的显色结果。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例中的，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：人工抗原的制备和鉴定
实验药品：N1-乙酰精胺(N1-ASpm)、N-乙酰半胱氨酸甲酯、卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)，弗氏佐剂、N1,N12-二乙酰精胺(DiAcSpm)标准品、辛二酸二琥珀酰亚胺酯类交联剂、戊二醛、0.01M磷酸盐缓冲溶液(PBS，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g)。
实验动物：新西兰白兔2～3kg。
人工抗原1的制备：将半抗原N1-乙酰精胺和载体蛋白BSA/OVA进行偶联，具体操作过程如下：将1-20mg载体蛋白、0.5-2.5mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯类交联剂和1-20mg N1-乙酰精胺溶于2-20mL 0.01M PBS中，将上述3种溶液混匀后于室温搅拌反应3-5h得到偶联产物，于PBS中透析3天，即人工抗原1。
人工抗原2的制备：将半抗原N1-乙酰精胺和载体蛋白BSA/OVA，进行偶联，具体操作过程如下：将1-20mg载体蛋白溶解到0.2-0.8mol/L戊二醛溶液中，然后加入1-20mg N1-乙酰精胺室温搅拌4-8h得到偶联产物，于PBS中透析3天，即人工抗原2。
人工抗原3的制备：将N-乙酰半胱氨酸甲酯和载体蛋白BSA/OVA，进行偶联，具体操作过程如下：将1-20mg载体蛋白溶解到5mL 0.01M PBS中,0.5-2.5mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯类交联剂溶解到0.1-1mL的双蒸水中，再加入到载体蛋白溶液中，室温搅拌2h，再将N-乙酰半胱氨酸甲酯用双蒸水溶解，缓慢滴加到上述溶液中，室温搅拌2h，4℃反应过夜，于PBS中透析2天，即人工抗原3。
本发明的半抗原不限于N1-乙酰精胺、N-乙酰半胱氨酸甲酯，也可以通过合成其他N1,N12-二乙酰精胺类似物作为半抗原，并且也可以采用其他交联剂，或其他偶联方法与载体蛋白偶联，本发明的载体蛋白不限于卵清蛋白、牛血清白蛋白，也可以使用其他载体。
人工抗原的鉴定：将载体蛋白和载体蛋白的偶联产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析，结果如图1、图2所示。由图1、图2可以看出，偶联产物人工抗原1、2、3的条带与载体蛋白的条带相比均有明显的滞后现象，初步说明上述抗原偶联成功。
实施例2：动物免疫
用人工抗原1免疫兔子，取一定量免疫原溶于1mL无菌0.9％生理盐水中，与等体积的弗氏完全佐剂(FCA)采用注射器推拉法乳化成油包水状态，然后采用皮下多点注射结合肌肉注射的方法免疫兔子。14天后加强免疫，剂量减半，佐剂改为弗氏不完全佐剂(FIA)。从第3次免疫之后，间隔1周取血耳缘静脉取血测定效价，待效价和特异性达到要求后颈动脉取全血。采集的血液经过3500r/min，离心30min后，小心吸出血清弃去沉淀，分装并置于-80℃冰箱中保存备用。其中，也可以使用氢氧化铝佐剂、明矾佐剂、脂质体等作为免疫佐剂。
实施例3：检测抗血清效价
酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定抗血清效价：将人工抗原2稀释后加到酶标板中，100μL/孔，4℃孵育过夜。用洗涤液PBST，洗3次，拍干。用3％(mg/mL)BSA，200μL/孔，37℃封闭1h，洗板3次，拍干。用PBS将血清梯度稀释，加入孔中，100μL/孔，37℃孵育1h，洗板4次，拍干。加入羊抗兔酶标二抗100μL/孔，37℃孵育30min，洗板5次。加入显色液TMB，100μL/孔，显色20min。加入终止液2mol/L H2SO4，50μL/孔，混匀。在波长450nm处用酶标仪读出各孔的光密度(OD)值。
抗血清敏感性测定：采用ELISA方法测定抗血清的敏感性，具体操作步骤如下：将人工抗原2稀释后加到酶标板中，100μL/孔，4℃孵育过夜。用洗涤液PBST(0.01M PBS，0.05％Tween-20)，洗3次，拍干。用3％(mg/mL)BSA，封闭1h，200μL/孔，洗板3次。将N1,N12-二乙酰精胺(DiAcSpm)从100ng/mL开始3倍梯度稀释，设置6个浓度，分别加入酶标板中，再加入一定倍数稀释的抗血清，37℃孵育1h，洗板4次，拍干。向酶标板中加入稀释后的羊抗兔酶标二抗，37℃孵育30min，洗板5次，拍干。加入四甲基联苯胺显色液(TMB)，100μL/孔，显色20min。加入终止液2mol/L H2SO4，50μL/孔，混匀。在波长450nm处用酶标仪读出各孔的OD值。按照计算式抑制率(％)＝(B0-B)/(B0-Bb)*100％，B0为标准品浓度为0孔的OD450值，B为加入了不同浓度标准品孔的OD450值，Bb为空白孔的OD450值。以抑制率为纵坐标，DiAcSpm浓度的对数值为横坐标，建立标准抑制曲线，以100ng/mL DiAcSpm对抗血清的抑制率衡量其灵敏度。抗血清效价及敏感性测定结果如下表1所示。
表1抗血清效价及敏感性测定
由上表1可以看出，血清中抗体的效价随着免疫程序的推进而不断提高。抗血清的抑制率在不断提高，表明抗体的灵敏度越来越强。
实施例4：抗体纯化与特异性鉴定
抗体的纯化：本实验采用免疫亲合层析法，用金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A)作为亲合层析介质，从抗血清中纯化出抗体，置于-20℃冰箱中保存备用。抗体的纯化方法可以采用饱和硫酸铵盐析法等。
抗体特异性鉴定：本实验采用ELISA法测定该抗体与尿液中以下9种化合物的交叉反应：N1,N12-二乙酰精胺、N-乙酰精胺、N1,N8-二乙酰亚精胺、N1-乙酰亚精胺、N8-乙酰亚精胺、精胺、亚精胺、尸胺、尿素，结果如下表2所示。
表2抗体特异性测定
由上表2可以看出，通过免疫人工抗原得到的抗体与大部分N1,N12-二乙酰精胺类似物或其他尿液中的小分子的交叉反应率均很低，不会影响检测结果。与N-乙酰精胺和N1-乙酰亚精胺有轻微交叉反应，但这两种化合物在尿液中含量微小，不会影响检测结果。因此该抗体可用于后期尿液中的DiAcSpm免疫学检测方法的建立。
实施例5：ELISA检测方法的建立
包被：将人工抗原2稀释后加到酶标板中，100μL/孔，37℃孵育3h。洗板：甩掉孔中液体，加入洗涤液PBST，静置2min后甩干，重复3次，最后将板在吸水纸上拍干。封闭：加入封闭液，200μL/孔，37℃封闭1h，洗板3次。加样：将DiAcSpm从100ng/mL开始3倍梯度稀释，设置6个浓度，分别加入酶标板中，50μL/孔；再加入一定倍数稀释的抗体，50μL/孔；设置阴性对照和空白对照，37℃孵育1h，洗板4次。加酶标二抗：将稀释后的羊抗兔酶标二抗，加入酶标板中，100μL/孔，37℃孵育1h，洗板5次。显色：加入TMB显色液，100μL/孔，37℃显色20min。终止：加入终止液，50μL/孔，混匀。读数：用酶标仪读取450nm波长下各孔OD值，计算抑制率，绘制标准抑制曲线，结果如图3所示。得到线性方程y＝11.703lnx+26.439(R2＝0.9791)
由实验结果所建立标准抑制曲线，根据曲线的线性方程求出IC50值(抑制为50％所对应的DiAcSpm的浓度)和IC15值(抑制为15％所对应的DiAcSpm的浓度)。以IC50值作为该方法的灵敏度，以IC15值作为该方法的最低检测限(LOD)。同时精密度测定结果也证明该方法可重复性良好。
实施例6：胶体金免疫层析法的建立
胶体金标记抗体：用0.1mol/L K2CO3将1mL粒径为25nm的胶体金调至最适pH。混匀。加入适量的抗体，混匀，室温静置15min。加入BSA封闭液，混匀后室温静置15min，于3500r/min，4℃离心15min，吸取上清液，于10000r/min，4℃离心30min，弃去上清，将沉淀用胶体金复溶液重悬。
铺金：将重悬后的金标抗溶液按10-30μL/cm用移液枪平均铺满硝酸纤维素膜(金标垫)。于37℃干燥3h。
划膜：将人工抗原2或人工抗原3固定在试纸条的T线上，二抗稀释液固定在试纸条的C线上。将硝酸纤维素膜(NC膜)粘到试纸条背板中间位置上，用划膜机在NC膜上将两溶液固定，于37℃干燥3h。
组装：在试纸条背板上依次粘贴吸水纸、金标垫、样品垫，然后用全自动斩切机切成宽度为4mm试纸条，密封干燥保存。
样品检测：用PBS溶液将标准品DiAcSpm从100ng/mL进行3倍梯度稀释，取100μL依次滴于试纸条的样品垫上，阴性对照为等体积的PBS溶液。一段时间后观察T、C线显色。同一样品设置两次实验，同一批试纸条进行三次不同时间的实验，组装三批不同批次的试纸条进行同样的重复实验。
本发明实例与阴性对照有明显差距的标准品DiAcSpm浓度为1.1ng/mL，消线浓度为33.3ng/mL(如图4所示)。批间批内重复实验结果均一致。
本发明实例中，在标准品浓度为0-12ng/mL范围时，随着样品浓度增加，OD值呈现明显增加趋势。此检测方法可通过生化分析仪对N1,N12-二乙酰精胺的含量进行测定。
本发明制备特异性DiAcSpm抗体，进而利用制备的抗体建立了用于DiAcSpm定量检测的ELISA方法和胶体金免疫层析法。然而免疫学检测方法除了上述方法之外，还包括免疫荧光法、化学发光免疫分析法、免疫比浊法等其他与免疫学相关的，需要借助抗原抗体特异性结合反应的检测方法。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种人工抗原的制备方法，其特征在于，包括：通过交联剂将载体蛋白和半抗原N1-乙酰精胺或N-乙酰半胱氨酸甲酯偶联，得到人工抗原。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述交联剂为辛二酸二琥珀酰亚胺酯类交联剂或戊二醛。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将1-20mg所述载体蛋白、0.5-2.5mg所述辛二酸二琥珀酰亚胺酯类交联剂和1-20mgN1-乙酰精胺溶于2-20mL 0.01M的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌3-5h，得到人工抗原1。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将1-20mg所述载体蛋白溶解到1-5mL0.2-0.8mol/L戊二醛溶液中，然后加入1-20mg N1-乙酰精胺，搅拌4-8h，得到人工抗原2。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将0.5-2.5mg所述辛二酸二琥珀酰亚胺酯类交联剂溶解在磷酸盐缓冲液中，加入到1-20mg所述载体蛋白，将溶解后的N-乙酰半胱氨酸甲酯缓慢滴加到上述溶液中，搅拌，过夜，得到人工抗原3。
6.一种根据权利要求1-5任一项所述的制备方法制备的人工抗原。
7.一种由权利要求6所述的人工抗原产生的抗体。
8.权利要求7所述的抗体在检测N1,N12-二乙酰精胺中的应用。
9.权利要求7所述的抗体在免疫学检测中的应用。
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