CN102553297B - 微型高效克伦特罗免疫亲和层析柱制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微型高效克伦特罗免疫亲和层析柱制备及应用。技术方案是：制备高质量抗体，将高效制备液相色谱纯化的溴乙酰氯克伦特罗与巯基化的血蓝蛋白合成免疫原免疫动物，得到抗血清；将纯化的溴乙酰氯克伦特罗与巯基化的琼脂糖反应得到克伦特罗-琼脂糖填料，装载成抗原亲和层析柱；用抗原亲和层析柱提纯抗血清中的克伦特罗特异性抗体。克伦特罗免疫亲和层析柱的制备：将高质量抗体高密度偶联到过碘酸氧化的琼脂糖上制成抗体亲和填料，取25μl填料装入特制的小柱中制成微型免疫亲和层析柱。本发明所提供的免疫亲和层析柱可高效率、特异性富集待检样品中克伦特罗，与分析仪器、胶体金试纸条联用能提高检测的准确性、可靠性和敏感度。

Description

微型高效克伦特罗免疫亲和层析柱制备及应用

技术领域

本发明涉及一种生物分离和富集技术，尤其是一种微型高效克伦特罗免疫亲和层析柱制备技术及其应用。

背景技术

盐酸克伦特罗是一种β-兴奋剂，可以提高瘦肉率，减少脂肪沉积和促进动物生长，被养殖户或养殖企业作为生长促进剂大量使用，导致畜产品中盐酸克伦特罗大量残留。人食用这类畜产品后，可引发肌肉震颤、心悸、神经过敏、头痛、目眩、恶心、呕吐、发烧、战栗等症状，严重危害消费者的健康。因此，许多国家(包括我国)现已被明令禁止在饲料中添加克伦特罗来增加动物的瘦肉率，畜产品中禁止克伦特罗含量超标。因此，对动物来源的食品中盐酸克伦特罗残留进行严格地检测是非常重要。

目前检测克伦特罗的方法主要有高效液相色谱法(HPLC-UV)、气-质联机法(GC-UV)、酶联免疫法、胶体金快速试纸条检测法等，由于生物样本成分复杂，待测物浓度低，大多数取样量少，而我国明确规定禁止克伦特罗及其衍生物在动物的饲养过程中使用。这就对分析方法的灵敏度、准确度有更高的要求。使用免疫亲和色谱纯化富集样品中的克伦特罗，可以很大程度的提高分析结果的可靠性和分析的极限。所以发明高效可行的克伦特罗免疫亲和柱很有必要。

现有的克伦特罗免疫亲和色谱样品处理柱的技术与工艺存在的缺陷：

目前关于纯化克伦特罗亲和色谱柱的专利和学术报告，仅仅是停留在实验室水平，即仅仅实现了可能性而无法在生产上应用的可行性。原因分析如下：

1)亲和柱重要的原料之一---活化填料。采用商业提供溴化氢(Cyanogen bromide)活化琼脂糖(Agarose).该种活化已知的缺陷是化学性质不稳定，化学反应残余有离子交换性质。这样会导致填料所结合的抗体定期性脱落，使结果不准确性和不可靠。从而限制了该填料的用途。

2)亲和柱重要的原料之二-----抗体。采用的抗体不是抗原特异亲和纯化的高质量抗体，会导致特异性抗体在填料的偶联比率低从而导致亲和柱的效率低下。即使使用单克隆抗体为原料的亲和柱专利，抗体生产成本高，很难实现实用性。

3)抗体偶联技术。采用的是溴化氰(Cyanogen bromide)活化偶联技术。该技术已知缺陷是化学键不稳定，会定期脱落，造成偶联的抗体固定不稳定，偶联抗体后的填料依然具有离子交换特点从而影响效率和分析结果的可靠性。。

非特异亲和纯化抗体制备和不稳定的偶联技术，导致填料的抗原(克伦特罗)结合效率极低。无法用于制备微型化亲和柱。填料的装柱容量多在1毫升左右，与25微升微型柱的水平差异是50倍。

4)没有微型化亲和柱。抗体填料的技术和低质量抗体使单位体积的亲和填料与分析物抗原的结合效率低，所以无法微型化。没有微型化，需要填料体积大，导致待测抗原洗脱的体积同样过大，直接影响了分析抗原的富集效应。同时，由于抗体抗原反应是动力学过程，填料中抗体的质量差，直接影响了抗体抗原反应的速率，也影响了富集的效率。富集效率直接影响到抗原分析物的检测极限。这是现有克伦特罗免疫亲和色谱柱最大的缺陷。上述几方面的原因造成制备出来的亲和色谱柱对待测样品中的克伦特罗富集的效率和纯化的能力差，引起检测灵敏度差、准确率低、可靠性低等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备高效、准确、可靠的工具和方法的技术。这样的工具(产品)可以把待检样品中克伦特罗的定量定性的分离纯化和富集起来，以便进一步的分析。

要达到这个目的，需要解决的问题是：

1)高度化学稳定和高效化学偶联的固相活化填料的制备技术。只有化学稳定的固相填料，才能保证所固定的富集物特异抗体的稳定不脱落，才不至于影响和干扰分析的结果和富集的效率，才有实用推广和商业化的价值。

2)大量廉价的高质量克伦特罗特异抗体的制备技术。只有高纯度、高度特异的抗体才可能达到单位体积最大的抗原分析物的富集效果和实现亲和柱微型化的目的。

3)高密度抗体固定技术。只有高密度地将抗体固定于填料，才可能达到单位体积最大的抗原分析物的富集效果和实现亲和柱微型化的目的。

本发明的原理：

克伦特罗亲和纯化和富集技术的基本原理是：把克伦特罗特异抗体通过化学方法固定倒固体琼脂糖小球(Agarose Beads)上。在流体样品中的抗原分析物克伦特罗(Ag)与固相填料中的克伦特罗特异抗体(Ab)产生特异性反应，在固相生成抗原抗体复合物。即：

目标微量的克伦特罗流经固相的分析物特异抗体，被抗体俘获而积累富集，同时流体样品的杂质可以从固相中自由流出而被清洗干净而使得克伦特罗得到纯化。

抗原-抗体反应是可逆的反应。当样品中的克伦特罗在固相积累富集和纯化后，可以被流体的克伦特罗洗脱液洗脱出来。分析样品中的克伦特罗收集在洗脱液中，可以用于仪器分析(如HPLC-MS)，或其他是免疫学检测方法(ELISA，胶体金测试条)进一步定性定量分析。

微型高效克伦特罗(Clenbuterol)免疫亲和层析柱工艺流程：

将盐酸克伦特罗半抗原制成具有强免疫原性的全抗原，免疫动物，产生具有抗克伦特罗的特异性抗血清，同时将克伦特罗半抗原偶联于琼脂糖填料，制成偶联半抗原的免疫亲和色谱柱，再用这种色谱柱提取血清中的抗体，将所得抗体进行脱盐、浓缩。另取琼脂糖填料基质用过碘酸钠活化，与浓缩的克伦特罗特异性抗体反应，从而偶联于这种活化后的填料，得到高效免疫亲和填料，此填料可用于特异性提取待测样品中的克伦特罗，将此填料装入特制的微型柱子里，即得微型高效的克伦特罗免疫亲和层析柱。具体技术如下：

高质量抗体的制备技术：

1)采用新的免疫原制备技术：盐酸克伦特罗与溴乙酰氯(BrCH2COCl)反应，生成稳定的克伦特罗卤代乙酰酯。克伦特罗溴乙酰酯的溴代烷烃(BrCH2-)基团可以迅速与游离巯基(-SH)反应，生成稳定的硫醚键。

克伦特罗溴乙酰衍生物采用反向型高效液相色谱仪(HPLC)纯化出主要溴乙酰克伦特罗衍生物主峰的单一成分(见图1)，将收集的活化组份冻干用于与含游离巯基的蛋白质和填料反应。

采用新产生的巯基衍生强免疫原性的血蓝蛋白(KLH)等常用载体蛋白与克伦特罗溴乙酰酯反应，生成克伦特罗-KLH复合免疫原。利用这种免疫原注射山羊和兔子，可产生产生高滴度，高亲和力的多克隆克伦特罗特异性抗血清。这种技术和现有的采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)缩合或NHS-戊二酸克伦特罗活性脂与免疫原性蛋白结合的制备方法完全不同。

2)采用抗原特异性免疫亲和层析，工业化水平纯化克伦特罗特异性抗体。我们制备高效抗原特异性免疫亲和色谱来大容量(克级)分离纯化克伦特罗-特异性多克隆抗体的技术，与现有的非克伦特罗-特异的蛋白A色谱分离纯化技术完全不同。无论是抗体的质量和产量，前者的克伦特罗特异分离纯化技术比后者高几个数量级。

采用新的抗克伦特罗抗体免疫亲和填料制备技术。

1)采用过碘酸钠活化琼脂糖(Agarose)，制备高稳定性的亲和色谱填料：利用活化填料的反应基团醛基与抗体蛋白表面所存在的一级氨基反应，通过还原后形成高度稳定的填料-克伦特罗特异抗体的高效免疫亲和填料。

2)采用经抗原特异免疫亲和层析纯化的高质量抗体制备亲和填料。克伦特罗抗体是利用克伦特罗琼脂糖Agarose亲和柱从抗血清中纯化出来的抗体。使高密度抗体化学固定，高抗原结合效率的免疫亲和填料成为可能，可行。

3)利用上述方法所制备的克伦特罗抗体免疫亲和填料化学稳定性强，抗体固定特异性好，密度高，保存过程中抗体脱落不明显，所以不会干扰分析结果的问题。能与传统的仪器分析，酶联免疫法(ELISA)及胶体金快速检测方法联用，从而改善了检测的敏感度、准确性和可靠性。

微型高效克伦特罗亲和层析柱装柱体积25l，能达到现有亲和柱装柱体积1000L的容量和更敏感的富集效率。采用上述新技术制成的微型高效亲和层析柱具有能浓缩待测样品中克伦特罗浓度，提高检测下限、排除杂质干扰、提高检测准确性和可靠性、减少样品过柱时间达到快速检测的作用。

本发明采取的技术方案：

一种微型高效克伦特罗免疫亲和层析柱制备技术，其特征是：

(1)克伦特罗免疫亲和层析填料是由固相载体琼脂糖Agarose和与其偶联的经免疫亲和提纯的克伦特罗多克隆抗体组成；所述的经免疫亲和提纯的克伦特罗多克隆抗体是以将克伦特罗衍生为半抗原再与载体蛋白偶联为免疫原免疫动物取得抗血清，将抗血清经偶联有克伦特罗半抗原的免疫亲和柱纯化得到的；

(2)活化的溴乙酰克伦特罗制备技术：采用溴乙酰氯与克伦特罗反应，生成溴乙酰克伦特罗，并使用制备型高效液相色谱仪HPLC分离纯化溴乙酰克伦特罗；

(3)克伦特罗免疫原、包被配对抗原制备技术：采用二硫苏糖醇DTT还原已用十二烷基磺酸钠SDS变性了的血蓝蛋白或牛血清蛋白，即KLH或BSA等常用载体蛋白，通过葡聚糖凝胶G25Sephadex脱盐制备巯基化蛋白；将所述经HPLC纯化的溴乙酰克伦特罗与巯基化的KLH或BSA合成免疫原免疫动物，制备抗血清；

(4)制备巯基化琼脂糖Agarose：用过碘酸钠氧化Agarose，再与赖氨酸反应后用硼氢化钠还原，制备氨基化Agarose；用N-羟基琥珀酰亚胺-碘乙酸活化酯NHS-Iodoacetate和氨基化Agarose反应生成NHS-Ioacetylated Agarose然后与过量的DTT反应制备巯基化Agarose；

(5)偶联溴乙酰克伦特罗的亲和柱的制备：将经HPLC纯化的溴乙酰克伦特罗与巯基化Agarose反应，形成溴乙酰克伦特罗-Agarose的化学共价键复合体填料并用于制备偶联溴乙酰克伦特罗的亲和柱；

(6)克伦特罗特异性抗体的分离纯化：采用偶联溴乙酰克伦特罗填料并装配抗原免疫亲和柱，把溴乙酰克伦特罗-KLH/BSA免疫动物所得的抗血清中的克伦特罗特异性抗体分离并纯化，得到高特异性、高亲和力的克伦特罗多克隆抗体；

(7)将所得的高特异性、高亲和力的克伦特罗多克隆抗体高密度偶联于用过碘酸氧化的Agarose上，得到高效克伦特罗免疫亲和层析填料；

(8)将所述高效克伦特罗免疫亲和层析填料装载入微型柱中，制成微型高效免疫亲和层析柱。

所述微型高效克伦特罗免疫亲和层析柱与胶体金测试条联用。

利用亲和色谱柱进行分析样品处理，提高检测的可靠性，敏感性主要针对仪器分析而言。

由于免疫亲和色谱技术、胶体金快速检测测试条的都采用分析物特异的抗体。传统的免疫亲和色谱技术和胶体金联用，在一些条件下会产生相互作用，从而影响分析结果的可靠性及准确性，特别是抗体从亲和柱的脱落，所脱落的抗体和待检分析物产生抗体抗原反应，可以与胶体金测试条的标记抗原或抗体产生竞争反映，会造成假阳性或假阴性，因此直接影响到免疫亲和柱在这些分析手段的准确性/可靠性。本发明的克伦特罗亲和柱制备技术，在与克伦特罗胶体金分析测试的应用上不产生这类干扰反应(见图2，图3结果)。至今没有发现克伦特罗亲和柱与克伦特罗胶体金联用的报道和专利。

本发明的优点或积极效果：

经液相色谱-质谱检测仪器(LC-MS)分析：微型亲和柱(25L)的容量和效率＞100ng，＞90％的回收率。

经胶体金测试条分析：胶体金对其他方法洗脱Agarose(琼脂糖填料)上不稳定的克伦特罗抗体(中和后)阳性。说明若不稳定亲和柱抗体脱落，不能在胶体金测试条上应用。然而，胶体金测试条对含0，0.1，1ng/mL原液样品阴性，对10ng/mL原液样品阳性。说明与胶体金测试条合乎产品特性。胶体金测试条对所有4种样品滤液皆阴性。说明微型亲和柱能有效俘获克伦特罗分子。胶体金测试条对0ng/mL样品洗脱液阴性，对0.1ng/ml，1ng/mL，10ng/mL样品洗脱液阳性，说明：1)微型柱上的抗体稳定，没有脱落，不造成因抗体不稳定脱落所造成的假阳性。2)微型柱能起富集作用，至少从不能检测的10毫升的0.1ng/mL的样品原液阴性(在胶体金的限度下)，经过微型柱纯化富集到150微升后，可以被捡胶体金测试条检测出来。

样品中的杂质影响胶体金测试造成假阳性，经过微型柱纯化后，消除假阳性。

综合上述，本发明的产品可以建立纯化富集克伦特罗的微型亲和柱(25L)，并能实际应用于临床分析化学仪器检测(LC-MS，气相色谱-质谱联用仪)，胶体金测试条的快速测试等。采用上述新技术制成的高效微型亲和色谱柱具有能浓缩待测样品中克伦特罗浓度，提高检测下限、排除杂质干扰、提高检测准确性和可靠性、减少样品过柱时间达到快速检测的作用。

附图说明

图1为经制备型高效液相色谱分离纯化的溴乙酰克伦特罗色谱图，及主要衍生组分收集峰。

图2为用本发明的微型高效亲和柱提纯的克伦特罗经胶体金试纸条测试效果图。说明：1：阴性尿液(-)；2：0.1ng/ml尿液(-)；3：10ml0.1ng/ml尿液过柱后的洗脱液(+)；4：10ml0.1ng/ml尿液过柱后的滤过液(-)。

图3为用本发明的微型高效亲和柱提纯的克伦特罗经胶体金试纸条测试效果图。说明：1：阴性尿液(-)；2：10ng/ml尿液(-)；3：10ml10ng/ml尿液过柱后的滤过液(-)；4：10ml10ng/ml尿液过柱后的洗脱液(+)。

具体实施方式

一、微型高效克伦特罗免疫亲和层析柱制备

一)克伦特罗特异性抗体的制备

1)克伦特罗溴乙酰脂的制备：50毫克的盐酸克伦特罗溶于500L的富马酸二甲酯(DMF)溶液中与50L的溴乙酰氯在60℃反应30分钟。反应后加入500L的50％甲醇。用制备型高效液相色谱仪(C-18HPLC)反向柱色谱分离纯化。分别收集相对于标准克伦特罗峰后移的峰(见图1)，具有克伦特罗紫外光(UV)吸收光谱特征的主要组分(大约20mg)，冻干现用。

2)克伦特罗免疫原、包被配对抗原制备。取50mg血蓝蛋白(KLH)10mL)，加入1％的SDS加热变性，然后加入15-30mg的过量二硫苏糖醇(DTT)煮沸还原10分钟。还原后的KLH经过G25 Sephadex脱盐柱去掉后多余的DTT加入5毫克的经HPLC纯化的克伦特罗溴乙酰酯，调pH＝8.5，室温反应60分钟后，生成克伦特罗-KLH共价键复合体，经G25Sephadex脱盐后得到的为免疫抗原。

3)克伦特罗多克隆抗血清制备：用新西兰大白兔为免疫动物，疫苗浓度为1mg/ml，首次免疫用0.5ml疫苗加1ml完全佐剂混匀多点注射，加强免疫用0.25ml疫苗加0.75ml磷酸缓冲液加1ml不完全佐剂混匀分2点注射，首次免疫后，每间隔2周加强免疫一次，35-40天采集血清检测滴度，血清滴度达到1∶6400后进行生产性血清制备。

4)溴乙酰克伦特罗Agarose亲和柱制备。取20mL过碘酸钠活化Agarose于50毫克的过量赖氨酸反应30分钟。用20毫克硼氢化钠还原30分钟，把过量的赖氨酸清洗干净，然后与20毫克的NHS-Iodoacetate室温反应30分钟。清洗后加入40毫克过量的DTT生成巯基化Agarose。清洗掉过量的DTT然后用磷酸缓冲液(PBS)悬浮，分别加入10mg经HPLC制备纯化的克伦特罗溴乙酰酯，室温反应过夜。用0.05％吐温磷酸盐缓冲液(PBSt)洗脱后装柱，

5)抗克伦特罗特异性抗体制备：将500mL的免疫血清流过步骤4)所制的亲和色谱填料柱。经PBSt清洗后，柱上的特异性抗克伦特罗抗体用2％乙酸洗脱。洗脱的抗体用透析袋透析去掉乙酸，冻干备用。

二)高密度高纯度克伦特罗特异性抗体Agarose填料制备。

1)用0.1M碳酸钠溶解1g克伦罗特异性多克隆抗体，与40mL的已经过碘酸钠活化的琼脂糖填料在室温下反应30分钟。然后4℃冰箱静置30分钟后加入50mg硼氢化钠还原稳定，清洗后，检测未结合抗体蛋白为150mg，实际偶联抗体蛋白＞800mg，抗体密度＞20mg/mL。即得到高效克伦罗特异性抗体-agarose。

三)微型克伦特罗免疫亲和层析柱的制备。

取25μL高效克伦罗特异性抗体-agarose装入容量为1mL的亲和层析塑料柱中，填料两头分别加上1个孔径为50μm的筛板，压紧后即可得到微型高效克伦特罗免疫亲和层析柱。

该微型克伦特罗免疫亲和层析柱的贮藏条件：用含有0.01％叠氮钠和0.1％BSA的磷酸缓冲液，3-8℃下保存，不能冷冻。该产品的有效期为12个月。

四)微型高效亲和柱的克伦特罗结合效价测定：

定性测定：

分别装10支25L微型高效克伦罗特异性抗体-agarose亲和柱。随机抽样4支柱子分别过1毫升含0，0.1，1，10ng/mL含克伦罗特罗标准品的尿液样品。用150L的2％乙酸洗脱液洗脱，用磷酸三钠中和到pH＝7.0-7.5

将样品原液、样品流出滤液、和亲和柱洗脱液分别用克伦罗特罗胶体金测试条测试，胶体金试纸条敏感度5ng/mL，测试结果如图二所示，说明经过本发明的微型高效免疫亲和柱富集后，检测下限可达0.1ng/ml。

定量测定：

分别装10支25L微型高效克伦罗特异性抗体-agarose亲和柱，随机取4支柱子。2支过12ml的1ng/ml，另2支过12ml的10ng/ml的含克伦罗特罗标准品的尿液样品。用1.2ml的2％乙酸20％甲醇洗脱液洗脱。

样品原液、样品流出滤液和亲和柱洗脱液分别用高效液相色谱分析。

结果分析：

a)本专利技术的产品可以建立纯化富集克伦特罗的微型亲和柱(25L)，并能将微型亲和柱应用于临床分析化学仪器检测(LC-MS，液相色谱-质谱联用仪)，胶体金测试条的快速测试。

b)经LC-MS(液相色谱-质谱联用仪)分析：微型亲和柱(25L)的容量和效率＞100ng，＞90％的回收率。

c)经胶体金测试条分析：胶体金测试条对含0，0.1，1ng/mL原液样品阴性，对10ng/mL原液样品阳性，说明与胶体金测试条合乎产品特性。胶体金测试条对所有4种样品过柱后的滤过液皆呈阴性。说明微型亲和柱能有效俘获克伦特罗分子。胶体金测试条对0ng/mL样品洗脱液阴性，对0.1ng/ml、1ng/mL，10ng/mL样品洗脱液阳性，说明：1)微型柱上的抗体稳定，没有脱落，不造成因抗体不稳定脱落的假阳性。2)微型柱能起富集作用，10毫升的0.1ng/mL的样品原液阴性(在胶体金的限度下)，经过微型柱纯化富集到150微升后，可以被捡胶体金测试条检测出来。

二、微型克伦特罗免疫亲和层析柱的使用方法：

a)样品的前处理：

动物尿样：将样品用PBS(磷酸缓冲液)稀释至所需体积。动物组织：在样品匀浆中，加入0.01mol/ml盐酸溶液，涡动3分钟，5000转/分离心10分钟，将得到上清液经0.2μm的滤膜过滤后，用磷酸缓冲液(PBS)稀释至所需体积，得到样品溶液。

b)将免疫亲和层析柱从4℃冰箱移到室温(22～25℃)，平衡10分钟后，取出上方塞子，并拔掉下方堵头，用10mL磷酸缓冲液(PBS)洗涤2次。

c)将步骤a)所得的样品溶液过柱。

d)待液体完全排干后，用磷酸缓冲液(PBS)洗涤2次，每次10mL。

e)待液体完全排干后，用洗脱液A(仪器分析用，洗脱后可直接用于HPLC(高效液相色谱分析)或洗脱液B(ELSIA测试盒和胶体金试纸条测试用，洗脱后用饱和碳酸钠调节PH 7-8)进行洗脱，得到纯化的克伦特罗溶液。

f)用洗脱液A洗脱得到的纯化的克伦特罗溶液可直接用于HPLC(高效液相色谱)分析，得出检测结果。

J)洗脱液B洗脱得到的纯化的克伦特罗溶液，需要用饱和碳酸钠调节PH到pH＝7-8后，用ELSIA测试盒或胶体金试纸条测试，得出检测结果。

Claims (2)

1.一种微型克伦特罗免疫亲和层析柱制备的方法，其特征是：

克伦特罗免疫亲和层析填料是由固相载体琼脂糖Agarose和与其偶联的经免疫亲和提纯的克伦特罗多克隆抗体组成；所述的经免疫亲和提纯的克伦特罗多克隆抗体是以将克伦特罗衍生为半抗原再与载体蛋白偶联为免疫原免疫动物取得抗血清，将抗血清经偶联有克伦特罗半抗原的免疫亲和柱纯化得到的；

(1)活化的溴乙酰克伦特罗制备技术：采用溴乙酰氯与克伦特罗反应，生成溴乙酰克伦特罗，并使用制备型高效液相色谱仪HPLC分离纯化溴乙酰克伦特罗；

(2)克伦特罗免疫原、包被配对抗原制备技术：采用二硫苏糖醇DTT还原已用十二烷基磺酸钠变性了的钥孔血蓝蛋白或牛血清蛋白，即KLH或BSA，通过G25Sephadex脱盐制备巯基化蛋白；将所述经HPLC分离纯化的溴乙酰克伦特罗与巯基化的KLH或BSA合成免疫原免疫动物，制备抗血清；

(3)制备巯基化Agarose：用过碘酸钠氧化Agarose，再与赖氨酸反应后用硼氢化钠还原，制备氨基化Agarose；用N-羟基琥珀酰亚胺-碘乙酸活化酯和氨基化Agarose反应生成碘乙酰化Agarose，然后与过量的DTT反应制备巯基化Agarose；

(4)偶联溴乙酰克伦特罗的亲和柱的制备：将经HPLC分离纯化的溴乙酰克伦特罗与巯基化Agarose反应，形成溴乙酰克伦特罗-Agarose的化学共价键复合体填料并用于制备偶联溴乙酰克伦特罗的亲和柱；

(5)克伦特罗特异性抗体的分离纯化：采用偶联溴乙酰克伦特罗填料并装配抗原免疫亲和柱，把溴乙酰克伦特罗-KLH/BSA免疫动物所得的抗血清中的克伦特罗特异性抗体分离并纯化，得到高特异性、高亲和力的克伦特罗多克隆抗体；

(6)将所得的高特异性、高亲和力的克伦特罗多克隆抗体高密度偶联于用过碘酸钠氧化的Agarose上，得到高效克伦特罗免疫亲和层析填料；

(7)将所述高效克伦特罗免疫亲和层析填料装载入微型柱中，制成微型高效免疫亲和层析柱。

2.如权利要求1所述的方法制备的微型克伦特罗免疫亲和层析柱，其特征在于微型克伦特罗免疫亲和层析柱与胶体金测试条联用。