CN105330745A - 一种苏丹红ⅱ多克隆抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于酶联免疫技术领域，具体的说是涉及一种苏丹红Ⅱ多克隆抗体的制备方法。一种苏丹红Ⅱ多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)将制备好的全抗原注射到免疫动物体内；(2)再加强免疫3次后采血，检测血清效价；(3)若血清效价达到要求，则大量采血，离心取上清，得到抗血清；(4)将所得抗血清流过抗原免疫亲和填料，抗血清中的抗苏丹红Ⅱ抗体与偶联在抗原免疫亲和填料上的活性苏丹红Ⅱ特异吸附，洗掉杂质，用弱酸洗脱，即得到抗苏丹红Ⅱ多克隆抗体。本发明的方法制备出的苏丹红Ⅱ多克隆抗体具有高特异性、高亲和力、敏感度高、纯度高的优点。

Description

一种苏丹红Ⅱ多克隆抗体的制备方法

技术领域

本发明属于酶联免疫技术领域，具体的说是涉及一种苏丹红Ⅱ多克隆抗体的制备方法。

背景技术

苏丹红学名苏丹(Sudan)，共分为苏丹红I、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ和苏丹红Ⅳ。苏丹红为亲脂性偶氮染料，主要用于油彩、机油、蜡和鞋油等产品的染色。由于用苏丹红染色后的食品颜色非常鲜艳且不易褪色，能引起人们强烈的食欲，一些不法食品企业把苏丹红添加到食品中。常见的添加苏丹红的食品有辣椒粉、辣椒油、红豆腐，红心禽蛋等。

由于苏丹红是一种人工合成的一种工业染料，1995年欧盟(EU)等国家已禁止其作为色素在食品中进行添加，对此我国也明文禁止。但由于其染色鲜艳，印度等一些国家在加工辣椒粉的过程中还容许添加苏丹红I。EU对从印度进口的红辣椒粉中检出苏丹红，其检出苏丹红I的量为2.8-3500mg/kg。同时在一些其它食品中也检测到这种物质，如一些调味品中苏丹红I的含量达到0.7-170mg/kg。也有一些报道称，在辣椒粉中还可检测到苏丹红Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，如在辣椒粉和辣椒酱中检出苏丹红IV的含量分别为230和380mg/kg，但辣椒粉中一般多以检出苏丹红I为主。英国食品标准局(TheFoodStandardAgency，FSA)就含有添加苏丹红色素的食品向消费者发出警告，并在其网站上公布了可能含有苏丹红I的产品清单。截至2月24日，清单上的产品增加到了474种，包括香肠、泡面、熟肉、馅饼、辣椒粉、调味酱等产品。

欧洲调味品协会专家委员会(theExpertCommitteeonFlavouringsoftheCouncilofEurope)的资料信息显示，欧洲每天红辣椒粉的人均消费量为50-500mg，而红辣椒粉中苏丹红I的检出量为2.8-3500mg/kg，从而推算欧洲人每天苏丹红I的人均可能摄入量为0.14-1750μg。而在法国向欧洲调味品协会专家委员会提交的一份报告中指出，人均每天辣椒(包括红辣椒和辣椒粉)的消费量和最大消费量分别为77和264mg，按辣椒粉中苏丹红I的检出量2.8-3500mg/kg进行推算，则欧洲人每天人均苏丹红I的摄入量为0.2-270μg，最大摄入量为0.7-924μg。

鉴于苏丹红Ⅱ给人类带来健康的潜在风险，开发一种简单、快捷制备用于检测苏丹红Ⅱ的多克隆抗体显得尤为重要。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种苏丹红Ⅱ多克隆抗体的制备方法。

本发明提供的技术方案为：

一种苏丹红Ⅱ多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)将制备好的全抗原注射到免疫动物体内；

(2)再加强免疫3次后采血，检测血清效价；

(3)若血清效价达到要求，则大量采血，离心取上清，得到抗血清；

(4)将所得抗血清流过抗原免疫亲和填料，抗血清中的抗苏丹红Ⅱ抗体与偶联在抗原免疫亲和填料上的活性苏丹红Ⅱ特异吸附，洗掉杂质，用弱酸洗脱，即得到抗苏丹红Ⅱ多克隆抗体。

作为优选，步骤(1)中所述的全抗原包括苏丹红Ⅱ-KLH和苏丹红Ⅱ-BSA。

作为优选，所述的全抗原，其制备方法包括以下步骤：

(1)先用十二烷基硫酸钠分别变性钥孔血蓝蛋白或牛血清蛋白；

(2)再分别用热的二硫苏糖醇对变性后的钥孔血蓝蛋白或牛血清蛋白进行还原，然后分别用葡聚糖凝胶脱盐后，得到巯基化的钥孔血蓝蛋白或牛血清蛋白；

(3)分别再用饱和碳酸钠溶液调pH＝8.5，然后滴入已制备好的3/8体积的活性苏丹红Ⅱ组分与钥孔血蓝蛋白，室温反应1h，再经葡聚糖凝胶脱盐后，即制得苏丹红Ⅱ-KLH全抗原，已制备好的1/8体积的活性苏丹红Ⅱ组分与牛血清蛋白同样操作反应即制得苏丹红Ⅱ-BSA全抗原。

作为优选，所述的全抗原苏丹红Ⅱ-KLH做注射用；所述的全抗原苏丹红Ⅱ-BSA做检测包被用。

作为优选，所述的活性苏丹红Ⅱ组分，其制备方法包括以下步骤：

(1)将苏丹红Ⅱ标准品溶解于无水氯仿中，在无水氯化铝的作用下与溴乙酰氯反应，得到具有活性的溴乙酰氯苏丹红Ⅱ混合物；

(2)将得到具有活性的溴乙酰氯苏丹红Ⅱ混合物用制备型高效液相反向柱色谱分离纯化，收集具有苏丹红Ⅱ标准品紫外光吸收光谱特征的活性苏丹红Ⅱ组分；

(3)将所收集的活性苏丹红Ⅱ组分重新萃取到氯仿中，经旋转蒸发后再用丙酮复溶后备用。

作为优选，所述的活性苏丹红Ⅱ组分按体积分为2等份，一份用于制备全抗原，另一份用于制备抗原免疫亲和填料。

作为优选，步骤(1)中所述的免疫动物为新西兰大白兔。

作为优选，步骤(4)中所述的抗原免疫亲和填料的制备方法包括以下步骤：

(1)取2g赖氨酸溶于10mL0.1mol/L碳酸钠，充分溶解后加入到25mL过碘酸钠氧化的琼脂糖填料中混匀，60℃反应5min，摇匀再次反应10min，转4℃静置20min，然后加入硼氢化钠100mg混匀还原，室温摇床上摇动过夜，得到赖氨酸琼脂糖填料；

(2)将25mL的赖氨酸琼脂糖填料转移到50mL洁净的空柱子，用500mL蒸馏水漂洗；

(3)先用50mL50％的冷丙酮洗1次，当溶液即将完全进入赖氨酸琼脂糖填料层时，再加入50mL75％的冷丙酮洗1次，当溶液即将完全进入赖氨酸琼脂糖填料层时，再次加入100mL100％冷丙酮洗1次；溶液即将完全进入赖氨酸琼脂糖填料层时，加入含有0.2mL三乙胺的20mL丙酮溶液，当溶液还剩1/3在赖氨酸琼脂糖填料层上时，反复震荡重悬琼脂糖珠，即得到重悬好的赖氨酸琼脂糖填料；

(4)取现配的150mgNHS-碘乙酸活性酯，边振荡边加入至步骤(3)得到的重悬好的赖氨酸琼脂糖填料，盖紧，室温避光反应60min；

(5)去除赖氨酸琼脂糖填料中的液体，再用100mL100％丙酮洗1次，当溶液即将完全进入琼脂糖珠层时，用含有0.1mol/LHCL的50mL75％的冷丙酮洗1次，溶液即将完全进入琼脂糖珠层时，用含有0.1mol/LHCL的50mL50％的冷丙酮洗1次，当溶液还剩1/3在琼脂糖填料层上时，反复震荡重悬琼脂糖珠；

(6)然后加入200mg的二硫苏糖醇，即得到巯基化琼脂糖填料；

(7)取1/2体积的活性苏丹红Ⅱ组分加入100uL饱和碳酸钠，然后和悬浮在丙酮的巯基琼脂糖珠填料室温反应过夜；

(8)用100mL丙酮清洗，再用400mL含0.05％吐温20的磷酸缓冲液PBSt清洗，即得到的抗原免疫亲和填料。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的方法制备出的苏丹红Ⅱ多克隆抗体具有高特异性、高亲和力的优点。

(2)本发明的方法在制备半抗原时，衍生苏丹红Ⅱ标准品后用高效液相进行了纯化，然后才制备全抗原，因此，本发明制备出来的多克隆抗体特异性高，敏感度高。

(3)传统方法是用硫酸铵沉淀或其它方法来纯化抗体，而本发明的方法是用抗原免疫亲和填料来纯化多克隆抗体，得到的多克隆抗体纯度更高。

附图说明

图1为苏丹红Ⅱ标准品的色谱图；

图2为经制备型高效液相色谱分离纯化的苏丹红Ⅱ色谱图及主要衍生组分收集峰图；

图3为抗苏丹红Ⅱ多克隆抗体间接ELISA的效价图；

图4为抗苏丹红Ⅱ多克隆抗体间接竞争ELISA的IC50图；

有关附图标记的说明：

1-苏丹红Ⅱ标准品；2-苏丹红Ⅱ主要衍生组分。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

实施例1：抗苏丹红Ⅱ多克隆抗体的制备

1.1苏丹红Ⅱ抗原的制备

1.1.1取20mg苏丹红Ⅱ溶解于1.5mL无水氯仿中，加入50-100mg无水氯化铝粉末，摇匀10min；

1.1.2加入40uL溴乙酰氯，摇匀室温反应30min后离心，取上清转移到一个10mL试管；

1.1.3缓慢加入5mL水，摇匀，慢慢放气，再激烈摇匀，静置10min后取底部红色氯仿层于5mL试管；

1.1.4加入0.5mL95％的甲醇(HPLC初始液)，离心取上清，用HPLC进行分离纯化；

1.1.5苏丹红Ⅱ衍生物-溴乙酰氯苏丹红Ⅱ用HPLC纯化条件是：流动相为95％甲醇+5％的2％HCL，流速3mL/分钟；收集7.7-8min和9min的峰；

1.1.6在收集到的液体中加入同等体积的氯仿，激烈摇匀，取氯仿层用旋转蒸发仪器抽干后，用分别用0.5ml，0.25ml，0.25ml丙酮分3次复溶回收活性苏丹红Ⅱ组分，于-20℃避光保存备用(尽量在2h内使用)；

1.1.7用十二烷基硫酸钠(SDS)分别变性钥孔血蓝蛋白(KLH)或牛血清蛋白(BSA)，再分别用热的二流苏糖醇(DTT)还原，分别经葡聚糖凝胶(G25Sephadex)脱盐后，得到巯基化的KLH或BSA，分别加入无水碳酸钠调pH＝8.5，然后取巯基化的KLH慢慢滴入制备好3/8的活性苏丹红Ⅱ组分中，室温反应60min，经G25Sephadex脱盐后,制得的苏丹红Ⅱ-KLH全抗原。换取巯基化BSA与1/8的活性苏丹红Ⅱ组分同样操作反应，制得的苏丹红Ⅱ-BSA全抗原做包被用。

1.2苏丹红Ⅱ抗原免疫亲和填料的制备

1.2.1取2g赖氨酸溶于10mL0.1mol/L碳酸钠，充分溶解后加入到25mL过碘酸钠氧化的琼脂糖填料(OX-Agarose)中混匀，60℃反应5min，摇匀再次反应10min，转4℃静置20min，然后加入硼氢化钠100mg混匀还原，室温摇床上摇动过夜，得到赖氨酸琼脂糖填料(Lys-agarose)；

1.2.2将25mL的Lys-Agarose转移到50mL洁净的空柱子，用500mL蒸馏水漂洗；

1.2.3用50mL50％的冷丙酮洗1次，溶液即将完全进入琼脂糖填料层时，加入50mL75％的冷丙酮洗1次，溶液即将完全进入琼脂糖填料层时，再加入100mL100％冷丙酮洗1次；溶液即将完全进入琼脂糖填料层时，加入含有0.2mL三乙胺的20mL丙酮溶液，当溶液还剩1/3在琼脂糖填料层上时，反复震荡重悬琼脂糖珠；

1.2.4用150mg现制的NHS-碘乙酸活性酯，边振荡边逐滴加入步骤(1.2.3)中重悬好的Agarose，盖紧，室温避光反应60min；

1.2.5滴干Lys-agarose中的液体，用100mL100％丙酮洗1次，溶液即将完全进入琼脂糖珠层层时，用含有0.1mol/LHCl的50mL75％的冷丙酮洗1次，溶液即将完全进入琼脂糖珠层时，用含有0.1mol/LHCL的50mL50％的冷丙酮洗1次，当溶液还剩1/3在琼脂糖填料层上时，反复震荡重悬琼脂糖珠。然后加入200mg的DTT，得到巯基化(-SH)琼脂糖填料；

1.2.6取一份活性苏丹红Ⅱ组分加入100uL饱和碳酸钠，然后和悬浮在丙酮的巯基(-SH)琼脂糖珠填料室温反应过夜；

1.2.7用100mL丙酮清洗，再用400mL含0.05％吐温20的磷酸缓冲液PBSt清洗备用。

1.3抗苏丹Ⅱ多克隆抗血清制备

以新西兰大白兔为免疫动物，疫苗浓度配称为1mg/mL,首次免疫用0.5mL疫苗加0.5mLPBS加1mL完全佐剂混匀多点注射，加强免疫用0.25mL疫苗加0.75mLPBS加1mL不完全佐剂混匀分2点注射，首次免疫后，每间隔2周加强免疫1次，35-40天采集0.5mL血清检测滴度，用配对检测抗原包被做血清的间接ELISA检测，血清滴度达到1:6400后进行大量血清制备。

1.4抗苏丹红Ⅱ抗体提取、纯化

将150mL的免疫血清流过步骤1.2所制的苏丹红Ⅱ抗原免疫亲和填料装成的亲和柱，依次用10倍填料体积的PBSt、10倍填料体积的1mol/L氯化钠冲洗掉杂质后，用1.5％乙酸洗脱柱上的特异性苏丹Ⅱ抗体。

实施例2：抗苏丹红Ⅱ多克隆抗体的检测

2.1效价检测

用间接ELISA法对抗体进行检测。所用二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，阴性对照为PBSt溶液。以阴性OD值不大于0.15，以最大OD值的一半对应的抗体浓度为抗体效价。检测结果如表1、图3。

表1间接ELISA检测抗苏丹Ⅱ抗体效价结果

从表1检测结果可以看出，本发明的方法制备的抗苏丹红Ⅱ多克隆抗体效价较高，达到12.8ng/mL。

2.2抗体敏感度测定

用间接竞争ELISA法对抗体敏感度进行测定。所用二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，用苏丹红Ⅱ标准品浓度从低到高去竞争酶标孔中的抗体，其OD值与所加入的苏丹红Ⅱ标准品浓度呈负相关。以OD信号抑制率为50％所对应的标准品浓度为敏感度的判断依据。检测数据如表2，图4。

表2间接竞争ELISA检测抗苏丹Ⅱ抗体敏感度结果

从表2可以看出，本发明的方法制备的抗苏丹红Ⅱ多克隆抗体敏感性很好，达到20.7ng/mL。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (8)

1.一种苏丹红Ⅱ多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将制备好的全抗原注射到免疫动物体内；

(2)再加强免疫3次后采血，检测血清效价；

(3)若血清效价达到要求，则大量采血，离心取上清，得到抗血清；

(4)将所得抗血清流过抗原免疫亲和填料，抗血清中的抗苏丹红Ⅱ抗体与偶联在抗原免疫亲和填料上的活性苏丹红Ⅱ特异吸附，洗掉杂质，用弱酸洗脱，即得到抗苏丹红Ⅱ多克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的苏丹红Ⅱ多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的全抗原包括苏丹红Ⅱ-KLH和苏丹红Ⅱ-BSA。

3.根据权利要求2所述的苏丹红Ⅱ多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述的全抗原，其制备方法包括以下步骤：

(1)先用十二烷基硫酸钠分别变性钥孔血蓝蛋白或牛血清蛋白；

(2)再分别用热的二硫苏糖醇对变性后的钥孔血蓝蛋白或牛血清蛋白进行还原，然后分别用葡聚糖凝胶脱盐后，得到巯基化的钥孔血蓝蛋白或牛血清蛋白；

(3)分别再用饱和碳酸钠溶液调pH＝8.5，然后滴入已制备好的3/8体积的活性苏丹红Ⅱ组分与钥孔血蓝蛋白，室温反应1h，再经葡聚糖凝胶脱盐后，即制得苏丹红Ⅱ-KLH全抗原，已制备好的1/8体积的活性苏丹红Ⅱ组分与牛血清蛋白同样操作反应即制得苏丹红Ⅱ-BSA全抗原。

4.根据权利要求3所述的苏丹红Ⅱ多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述的全抗原苏丹红Ⅱ-KLH做注射用；所述的全抗原苏丹红Ⅱ-BSA做检测包被用。

5.根据权利要求3所述的苏丹红Ⅱ多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述的活性苏丹红Ⅱ组分，其制备方法包括以下步骤：

(1)将苏丹红Ⅱ标准品溶解于无水氯仿中，在无水氯化铝的作用下与溴乙酰氯反应，得到具有活性的溴乙酰氯苏丹红Ⅱ混合物；

(2)将得到具有活性的溴乙酰氯苏丹红Ⅱ混合物用制备型高效液相反向柱色谱分离纯化，收集具有苏丹红Ⅱ标准品紫外光吸收光谱特征的活性苏丹红Ⅱ组分；

(3)将所收集的活性苏丹红Ⅱ组分重新萃取到氯仿中，经旋转蒸发后再用丙酮复溶后备用。

6.根据权利要求5所述的苏丹红Ⅱ多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述的活性苏丹红Ⅱ组分按体积分为2等份，一份用于制备全抗原，另一份用于制备抗原免疫亲和填料。

7.根据权利要求1所述的苏丹红Ⅱ多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的免疫动物为新西兰大白兔。

8.根据权利要求1所述的苏丹红Ⅱ多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的抗原免疫亲和填料的制备方法包括以下步骤：

(1)取2g赖氨酸溶于10mL0.1mol/L碳酸钠，充分溶解后加入到25mL过碘酸钠氧化的琼脂糖填料中混匀，60℃反应5min，摇匀再次反应10min，转4℃静置20min，然后加入硼氢化钠100mg混匀还原，室温摇床上摇动过夜，得到赖氨酸琼脂糖填料；

(2)将25mL的赖氨酸琼脂糖填料转移到50mL洁净的空柱子，用500mL蒸馏水漂洗；

(3)先用50mL50％的冷丙酮洗1次，当溶液即将完全进入赖氨酸琼脂糖填料层时，再加入50mL75％的冷丙酮洗1次，当溶液即将完全进入赖氨酸琼脂糖填料层时，再次加入100mL100％冷丙酮洗1次；溶液即将完全进入赖氨酸琼脂糖填料层时，加入含有0.2mL三乙胺的20mL丙酮溶液，当溶液还剩1/3在赖氨酸琼脂糖填料层上时，反复震荡重悬琼脂糖珠，即得到重悬好的赖氨酸琼脂糖填料；

(4)取现配的150mgNHS-碘乙酸活性酯，边振荡边加入至步骤(3)得到的重悬好的赖氨酸琼脂糖填料，盖紧，室温避光反应60min；

(5)去除赖氨酸琼脂糖填料中的液体，再用100mL100％丙酮洗1次，当溶液即将完全进入琼脂糖珠层时，用含有0.1mol/LHCL的50mL75％的冷丙酮洗1次，溶液即将完全进入琼脂糖珠层时，用含有0.1mol/LHCL的50mL50％的冷丙酮洗1次，当溶液还剩1/3在琼脂糖填料层上时，反复震荡重悬琼脂糖珠；

(6)然后加入200mg的二硫苏糖醇，即得到巯基化琼脂糖填料；

(7)取1/2体积的活性苏丹红Ⅱ组分加入100uL饱和碳酸钠，然后和悬浮在丙酮的巯基琼脂糖珠填料室温反应过夜；

(8)用100mL丙酮清洗，再用400mL含0.05％吐温20的磷酸缓冲液PBSt清洗，即得到的抗原免疫亲和填料。