CN107855115B - 亲和层析柱、制备方法及应用 - Google Patents

亲和层析柱、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物化学纯化领域，具体而言，提供了一种亲和层析柱、制备方法及应用。本发明提供的亲和层析柱的制备方法，将抗原、还原剂与层析柱填料在层析柱空柱中进行孵育反应，得到反应柱，对反应柱进行洗涤，并对反应柱中多余的结合位点进行封闭处理，得到亲和层析柱。该方法是通过还原剂将抗原中的二硫键打开形成自由巯基，抗原中的巯基与层析柱填料进行共价偶联，通过一次性的缓冲液的洗涤即可保存或使用亲和层析柱，不需要进行梯度洗涤的繁琐步骤，节省人力物力，节约时间，该方法适用于各种抗原可用于工业化生产。本发明提供的亲和层析柱，通过上述制备方法制备得到，性能稳定，成分均匀，可以重复使用，特异性好，可以广泛应用于生产。

Description

亲和层析柱、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物化学纯化技术领域，具体而言，涉及一种亲和层析柱、制备方法及应用。
背景技术
现阶段以重组蛋白作为抗原免疫制备抗体，后续要得到高纯度的特异性抗体，都需要利用亲和层析柱进行抗体的纯化。目前市场上的亲和层析柱主要有两种：一种是将细菌的细胞壁蛋白protein A通过基因工程的手段改造后偶联到琼脂糖凝胶上(如商品化的protein A、protein G等填料)，利用该细胞壁蛋白具有与抗体IgG分子的Fc区特异性结合的结构域，从而将抗体纯化下来。另外一种方法是利用蛋白的游离氨基与共价偶联的配体预活化填料进行化学的共价偶联，从而制作成抗原亲和层析柱进行抗体的纯化。
利用市场上的商品化填料(如protein A、protein G等)，在进行抗体亲和纯化时，虽然能达到抗体的富集的目的，仍存在以下缺点：
(1)纯化得到目的抗体的同时，将免疫动物血清中自带的免疫球蛋白也给纯化下来，从而导致后续检测背景的干扰。
(2)该方法对于特殊亚型的抗体，如IgA，IgE，IgY等都无法进行纯化。
此外，利用蛋白的游离氨基进行共价固定偶联到琼脂糖凝胶上，虽然可以避免将免疫动物血清中自带的免疫球蛋白也给纯化下来，减少检测背景的干扰，但是存在一定的局限性，其缺点如下：
(1)该方法需要偶联的蛋白是可溶性的，否则无法进行有效的共价偶联；而在实际的生产中，由于一些蛋白片段较大，通常是以包涵体的形式存在，即使后续经过变复性的处理，仍有很大一部分的蛋白是以沉淀形式存在。
(2)该方法在偶联时，需要排除一些游离氨基酸及带氨基的化学试剂的干扰，如重组蛋白变性常用的尿素等试剂。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种亲和层析柱的制备方法，以缓解现有技术中对偶联抗原部分有要求，亲和层析柱制备步骤复杂繁琐、费时费力、成本较高的技术问题；
本发明的第二目的在于提供上述制备方法制备亲和层析柱中的应用，以降低现有技术中制备亲和层析柱的物料成本、时间成本和人力成本；
本发明的第三个目的在于提供上述制备方法制备得到的亲和层析柱，以缓解现有技术中纯化目标抗体时操作步骤繁琐，费时费力的问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种亲和层析柱的制备方法，包括：将抗原、还原剂与层析柱填料在层析柱空柱中进行孵育反应，得到反应柱，对反应柱进行洗涤，并对反应柱中多余的结合位点进行封闭处理，得到亲和层析柱。
进一步地，所述还原剂为二硫苏糖醇、巯基乙醇或三(2-羧乙基)膦。
进一步地，所述层析柱填料可与巯基偶联；
优选地，所述层析柱填料为琼脂糖凝胶；
优选地，所述琼脂糖凝胶为碘乙酰活化的琼脂糖凝胶或环氧基活化的琼脂糖凝胶。
进一步地，所述抗原与还原剂的重量份数比为1-2:2。
进一步地，所述抗原和还原剂体积与层析柱填料体积的体积比为2-3:2。
进一步地，所述孵育反应应包括：将抗原、还原剂和层析柱填料混合均匀后，轻摇反应1-2h。
进一步地，封闭处理中所用封闭液为半胱氨酸溶液。
进一步地，当所述抗原为非水溶性抗原时，先用4-6mol/L的尿素对所述非水溶性抗原进行溶解，再参与孵育反应。
本发明还提供了上述的制备方法在制备亲和层析柱中的应用。
本发明还提供了一种亲和层析柱，应用上述的制备方法制备得到。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种亲和层析柱的制备方法，将抗原、还原剂与层析柱填料在层析柱空柱中进行孵育反应，得到反应柱，对反应柱进行洗涤，并对反应柱中多余的结合位点进行封闭处理，得到亲和层析柱。该方法是通过还原剂将抗原中的二硫键打开形成自由巯基，抗原中的巯基与层析柱填料进行共价偶联，不需要考虑自由氨基的存在对共价偶联的影响，当共价偶联反应结束后，通过一次性的缓冲液的洗涤即可保存或使用亲和层析柱，不需要进行梯度洗涤的繁琐步骤，节省人力物力，节约时间，该方法适用于各种抗原，制备得到的亲和层析柱性能稳定，成分均匀，可以重复使用，可用于工业化生产。本发明提供的亲和层析柱，通过上述制备方法制备得到，该亲和层析柱，性能稳定，成分均匀，可以重复使用，特异性好，可以广泛应用于生产。
附图说明
图1为本发明实施例3中Western-blot检测结果图；
图2为本发明实施例6中Western-blot检测结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
本发明提供了一种亲和层析柱的制备方法，包括：将抗原、还原剂与层析柱填料在层析柱空柱中进行孵育反应，得到反应柱，对反应柱进行洗涤，并对反应柱中多余的结合位点进行封闭处理，得到亲和层析柱。
该方法是通过还原剂将抗原中的二硫键打开形成自由巯基，抗原中的巯基与层析柱填料进行共价偶联，不需要考虑自由氨基的存在对共价偶联的影响，当共价偶联反应结束后，通过一次性的缓冲液的洗涤即可保存或使用亲和层析柱，不需要进行梯度洗涤的繁琐步骤，节省人力物力，节约时间，该方法适用于各种抗原，制备得到的亲和层析柱性能稳定，成分均匀，可以重复使用，可用于工业化生产。
在一个优选地实施方式中，还原剂为二硫苏糖醇、巯基乙醇或三(2-羧乙基)膦。
在一个优选地实施方式中，层析柱填料可与巯基偶联；
二硫苏糖醇、巯基乙醇或三(2-羧乙基)膦都可以将抗原蛋白的二硫键打开形成巯基，抗原上的巯基与层析柱填料上的活性基团进行共价偶联反应，形成共价键，将抗原固定在层析柱填料上。
在一个更优选地实施方式中，层析柱填料为琼脂糖凝胶；
在一个更优选地实施方式中，琼脂糖凝胶为碘乙酰活化的琼脂糖凝胶或环氧基活化的琼脂糖凝胶。巯基与碘乙酰基团发生缩合反应，生成C-S键，同时有HI生成；巯基可以将环氧基打开，形成C-S键和-OH。
进一步地，抗原与还原剂的重量份数比为1-2:2。
抗原与还原剂的重量份数比典型但非限制性的为1:2、1.5:2或2:2。
进一步地，抗原和还原剂体积与层析柱填料体积的体积比为2-3:2。
抗原和还原剂体积与层析柱填料的体积比典型但非限制性的为2:2、2.5:2或3:2。
进一步地，孵育反应包括：将抗原、还原剂和层析柱填料混合均匀后，轻摇反应1-2h。反应时间典型但非限制性的为1h、1.5h或2h。
进一步地，封闭处理中所用封闭液为半胱氨酸溶液。半胱氨酸中的巯基可以与层析柱填料中多余的活性基团进行共价偶联，封闭层析柱填料中的活性基团，减少亲和层析柱的非特异性结合。
进一步地，当抗原为非水溶性抗原时，先用4-6mol/L的尿素对非水溶性抗原进行溶解，再参与孵育反应。尿素可以溶解非水溶性抗原，并且直接参与孵育反应，无需透析除去尿素，同时不会对整个制备过程造成影响，本发明提供的制备方法，不管抗原是水溶性还是非水溶性的，都可以通过该方法制备亲和层析柱，不受抗原种类的限制，可以应用于各种目标抗体的亲和层析柱的制备当中。尿素浓度典型但非限制性的为4mol/L、5mol/L或6mol/L。
本发明还提供了上述的制备方法在制备亲和层析柱中的应用。
本发明还提供了一种亲和层析柱，应用上述的制备方法制备得到。本发明提供的亲和层析柱，通过上述制备方法制备得到，该亲和层析柱，性能稳定，成分均匀，可以重复使用，特异性好，可以广泛应用于生产。
为了有助于进一步理解本发明，现结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1亲和层析柱的制备
(a)柱子的准备：取3ml的层析柱空柱，塞入垫片，下部端口用塞子塞紧。取2ml碘乙酰活化的琼脂糖凝胶于柱内静置30min，待填料沉降之后，让液体自由流出，再用3个柱体积的偶联缓冲液(称取Tris 0.91g；EDTA0.30g溶解至150mL超纯水中即可)清洗凝胶柱，塞上下端的封口塞。
(b)抗原二硫键的打开及共价偶联：称取2mg还原剂三(2-羧乙基)膦和1mg抗原HSP27，全部溶于1ml偶联缓冲液中。将上述混匀后的溶液加入上述偶联填料柱内，塞上上端的橡胶塞，并用手指轻轻在管壁上弹几下使填料散开并与蛋白混合后，置于摇床上轻摇反应1h。
(c)柱子的洗涤：将上述反应柱取下静置30min后，拔出上下端塞子，将上清收集到干净的15ml离心管中，对上清中的蛋白量进行检测，从而得出蛋白结合率，若结合率偏低，可以适当延长反应时间。之后用3个柱体积的偶联缓冲液清洗柱子。
(d)多余位点的封闭：将1ml 0.1M半胱氨酸溶液加入柱中，与填料混合，摇匀轻轻震荡45min，封闭多余的巯基结合位点。
(e)柱子的清洗：将柱子从摇床取下静置30min，用3个柱体积的1M NaCl溶液清洗凝胶柱，然后用3个柱体积的1×PBS溶液(135mM NaCl,2.7mM KCl,1.5mM KH2PO4,and 8mMK2HPO4，pH 7.2)清洗凝胶柱。
(f)柱子的保存：在做好的凝胶柱里加入1ml 20％的乙醇，4℃保存备用。
实施例2抗体纯化
(a)柱子平衡：将亲和层析柱用20ml平衡缓冲液(0.01M PBS：135mM NaCl,2.7mMKCl,1.5mM KH2PO4,and 8mM K2HPO4，pH 7.2)，流速70ml/h清洗。
(b)样本处理：取待纯化的兔血清8ml于离心管中，12000rpm/min，离心5min，取上清于50ml离心管中，用平衡缓冲液稀释至15ml。
(c)上样：将稀释过的血清样品以40ml/h流速上样，柱子下端用干净的离心管收集过柱液，重复过柱一次。
(d)抗体收集：用40ml平衡缓冲液以70ml/h的流速清洗柱子，连接蛋白检测仪。待图谱基线跑至平稳，停止洗涤，并将柱子转至装有洗脱缓冲液(pH 2.7，0.2M甘氨酸)的注射器上，以40ml/h的速度洗脱抗体，当仪器的示数开始升高时开始收集兔多克隆抗体。
(e)调pH：在抗体收集过程中以1M的碳酸氢钠及时调节抗体的pH值至7.5。兔多克隆抗体收集完后，调节pH值至7.5，放在4℃保存。
(f)清洗亲和层析柱并保存：用20ml平衡缓冲液以70ml/h的速度清洗亲和层析柱，用3个柱体积的1M NaCl清洗柱子，然后用3个柱体积的平衡缓冲液清洗亲和层析柱，之后加入1ml 20％乙醇，封口，4℃冰箱保存柱子。
实施例3纯化抗体的Western-blot检测
(a)总蛋白的提取：将养好的hela细胞皿用滴管加适量4℃预冷的1×PBS(注意要沿壁缓慢加)洗涤细胞，然后弃去洗液，重复以上操作两次。按1ml RIPA裂解液(强)加10μlPMSF(100mM)配好所需的量(4-5×106细胞量加200μl RIPA裂解液)，摇匀置于冰上裂解30min。裂解后，转移到离心管中并4℃，5000rpm/min，离心10min，取上清备用。
(b)蛋白的变性处理：5×上样缓冲液稀释上述上清，100℃沸水煮10min，-20℃保存。
(c)SDS-PAGE电泳：按照每孔25μg的总蛋白量进行上样，并进行SDS-PAGE凝胶电泳(电泳时间以溴酚蓝指示剂跑到凝胶下边缘停止)。电泳结束，电泳胶用1×电转液中平衡。
(d)转印：以电压75v，转印40min，将蛋白转印到PVDF膜(孔径0.22μm)上。
(e)膜的封闭：转印结束之后，用5％脱脂奶粉覆盖PVDF膜，于室温下水平摇床上封闭1h以上。封闭结束后再用去离子水洗涤两遍，每次5min。
(f)Western-blot检测：用上述实施例2纯化得到的兔多克隆抗体作为一抗，一抗以1:100和1:500的稀释度稀释后进行检测，于室温孵育1h，之后用TBST在水平摇床上洗涤3次，每次5min。随后加入1:5000稀释的羊抗兔-HRP进行反应1h，并同样以TBST在水平摇床上洗涤3次，每次5min。洗涤结束后，PVDF膜上加ECL底物，并在暗室胶片曝光显色，洗片，扫描。结果如图1所示。通道1表示一抗以1:100稀释度稀释后检测的实验结果，通道2表示一抗以1:500稀释度稀释后检测的实验结果，从图中可以看出，上述亲和层析柱纯化得到的兔多克隆抗体纯度高，特异性好，成分均匀、稳定，性能好，不会对实验结果产生背景干扰。
实施例4亲和层析柱的制备
(a)柱子的准备：取4ml的层析柱空柱，塞入垫片，下部端口用塞子塞紧。取2ml环氧基活化的琼脂糖凝胶于柱内静置30min，待填料沉降之后，让液体自由流出，再用3个柱体积的偶联缓冲液(称取Tris 0.91g；EDTA0.30g溶解至150mL超纯水中即可)清洗凝胶柱，塞上下端的封口塞。
(b)抗原二硫键的打开及共价偶联：称取2mg还原剂巯基乙醇和2mg抗原HSP27，全部溶于3ml偶联缓冲液中。将上述混匀后的溶液加入上述偶联填料柱内，塞上上端的橡胶塞，并用手指轻轻在管壁上弹几下使填料散开并与蛋白混合后，置于摇床上轻摇反应2h。
(c)柱子的洗涤：将上述反应柱取下静置30min后，拔出上下端塞子，将上清收集到干净的15ml离心管中，对上清中的蛋白量进行检测，从而得出蛋白结合率，若结合率偏低，可以适当延长反应时间。之后用3个柱体积的偶联缓冲液清洗柱子。
(d)多余位点的封闭：将1ml 0.1M半胱氨酸溶液加入柱中，与填料混合，摇匀轻轻震荡45min，封闭多余的巯基结合位点。
(e)柱子的清洗：将柱子从摇床取下静置30min，用3个柱体积的1M NaCl溶液清洗凝胶柱，然后用3个柱体积的1×PBS溶液(135mM NaCl,2.7mM KCl,1.5mM KH2PO4,and 8mMK2HPO4，pH 7.2)清洗凝胶柱。
(f)柱子的保存：在做好的凝胶柱里加入1ml 20％的乙醇，4℃保存备用。
实施例5抗体纯化
参照实施例2所述的步骤，利用实施例4制备的亲和层析柱纯化兔多克隆抗体。
实施例6纯化抗体的Western-blot检测
(a)总蛋白的提取：将养好的HepG2细胞皿用滴管加适量4℃预冷的1×PBS(注意要沿壁缓慢加)洗涤细胞，然后弃去洗液，重复以上操作两次。按1ml RIPA裂解液(强)加10μlPMSF(100mM)配好所需的量(4-5×106细胞量加200μl RIPA裂解液)，摇匀置于冰上裂解30min。裂解后，转移到离心管中并4℃，5000rpm/min，离心10min，取上清备用。
(b)蛋白的变性处理：5×上样缓冲液稀释上述上清，100℃沸水煮10min，-20℃保存。
(c)SDS-PAGE电泳：按照每孔25μg的总蛋白量进行上样，并进行SDS-PAGE凝胶电泳(电泳时间以溴酚蓝指示剂跑到凝胶下边缘停止)。电泳结束，电泳胶用1×电转液中平衡。
(d)转印：以电压75v，转印40min，将蛋白转印到PVDF膜(孔径0.22μm)上。
(e)膜的封闭：转印结束之后，用5％脱脂奶粉覆盖PVDF膜，于室温下水平摇床上封闭1h以上。封闭结束后再用去离子水洗涤两遍，每次5min。
(f)Western-blot检测：用上述实施例2纯化得到的兔多克隆抗体作为一抗，一抗以1:100和1:500的稀释度稀释后进行检测，于室温孵育1h，之后用TBST在水平摇床上洗涤3次，每次5min。随后加入1:5000稀释的羊抗兔-HRP进行反应1h，并同样以TBST在水平摇床上洗涤3次，每次5min。洗涤结束后，PVDF膜上加ECL底物，并在暗室胶片曝光显色，洗片，扫描。结果如图2所示，通道1表示一抗以1:100稀释度稀释后检测的实验结果，通道2表示一抗以1:500稀释度稀释后检测的实验结果，从图中可以看出，上述亲和层析柱纯化得到的兔多克隆抗体纯度高，特异性好，成分均匀、稳定，性能好，不会对实验结果产生背景干扰。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (9)

1.一种亲和层析柱的制备方法，其特征在于，包括：将抗原、还原剂与层析柱填料在层析柱空柱中进行孵育反应，得到反应柱，对反应柱进行洗涤，并对反应柱中多余的结合位点进行封闭处理，得到亲和层析柱；
抗原为HSP27，还原剂为二硫苏糖醇、巯基乙醇或三(2-羧乙基)膦，层析填料为琼脂糖凝胶，层析柱填料可与巯基偶联。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶为碘乙酰活化的琼脂糖凝胶或环氧基活化的琼脂糖凝胶。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗原与还原剂的重量份数比为1-2:2。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗原和还原剂体积与层析柱填料体积的体积比为2-3:2。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述孵育反应包括：将抗原、还原剂和层析柱填料混合均匀后，轻摇反应1-2h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，封闭处理中所用封闭液为半胱氨酸溶液。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，当所述抗原为非水溶性抗原时，先用4-6mol/L的尿素对所述非水溶性抗原进行溶解，再参与孵育反应。
8.如权利要求1-7任一项所述的制备方法在制备亲和层析柱中的应用。
9.一种亲和层析柱，其特征在于，应用权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到。
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