CN109627321A - 一种环孢霉素a免疫原的制备方法、环孢霉素a免疫原和抗环孢霉素a特异性抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种环孢霉素A免疫原的制备方法,属于酶联免疫检测技术领域,包括以下步骤:将环孢霉素A与草酰氯在氯仿中反应,得到环孢霉素A羧基衍生物;将得到的环孢霉素A羧基衍生物与碳二亚胺、载体蛋白混合、偶联,得到环孢霉素A免疫原。采用本发明的制备方法得到环孢霉素A免疫原,再将环孢霉素A免疫原制备成抗环孢霉素A特异性抗体,该特异性抗体能够特异性识别环孢霉素A,与去甲环孢素、羟化环孢素和二羟化环孢素等存在极微弱的交叉反应。
Description
技术领域
本发明涉及酶联免疫检测技术领域,具体涉及一种环孢霉素A免疫原的制备方法、环孢霉素A免疫原和抗环孢霉素A特异性抗体。
背景技术
环孢霉素A是一种高效免疫抑制剂,临床主要用于肝、肾、胰、心、肺、皮肤、角膜及骨髓移植,以减轻或防止排斥反应,提高患者的生存率和移植物的存活率。但由于其治疗窗狭窄,药动学参数个体差异大,低于有效浓度易引起排斥反应或诱发自身免疫性疾病,高于有效浓度则易引起感染或肝、肾及中枢神经系统损害。而且,CsA血药浓度水平易受性别、年龄、肥胖、肝功能、胃肠功能、药物相互作用以及饮食等众多因素的影响。因此,监测全血中CsA的血药浓度并调整其浓度在有效范围已成为临床合理使用CsA的重要方法。
目前已知的环孢霉素A(cyclosporine A,CsA)在体内的代谢产物有15种之多,主要以去甲环孢素,羟化环孢素及二羟化环孢素三种代谢物为主。因此在环孢霉素A的血药浓度监测过程中,特异性的测定CsA不受其代谢物的影响,是准确反映CsA药代动力学过程及安全用药的重要前提。
目前,体外测定环孢霉素A的方法主要高效液相色谱法,有放射免疫法(RIA),化学发光免疫法(CLIA),荧光偏振法(FPIA),酶联免疫吸附法(ELISA),胶乳增强比浊法。其中,高效液相色谱法,能够识别环孢霉素A及其类似物,但其设备昂贵,操作复杂,需要前处理,通量小,不适合在临床推广。而放射免疫法(RIA),化学发光免疫法(CLIA),荧光偏振法(FPIA),酶联免疫吸附法(ELISA),胶乳增强比浊法,均是基于抗原抗体的免疫反应原理,因此试剂使用的CsA抗体的特异性就决定了检测试剂对CsA药物监测的特异性。然而,目前已知多数商品化CsA测定试剂并不是特异性识别CsA,同CsA的主要代谢物,去甲环孢素、羟化环孢素和二羟化环孢素存在较大的交叉反应。
发明内容
本发明的目的在于提供一种环孢霉素A免疫原的制备方法,采用本发明的制备方法得到环孢霉素A免疫原,再将环孢霉素A免疫原制备成抗环孢霉素A特异性抗体,该特异性抗体能够特异性识别环孢霉素A,与去甲环孢素、羟化环孢素和二羟化环孢素等存在极微弱的交叉反应。
本发明提供了一种环孢霉素A免疫原的制备方法,包括以下步骤:
1)将环孢霉素A与草酰氯在氯仿中反应,得到环孢霉素A羧基衍生物;
2)将所述步骤1)得到的环孢霉素A羧基衍生物与碳二亚胺、载体蛋白混合、偶联,得到环孢霉素A免疫原。
优选的,所述步骤1)环孢霉素A与草酰氯的质量比为(8~12):(7~7.5)。
优选的,所述步骤1)环孢霉素A与草酰氯的质量比为10:7.23。
优选的,所述步骤1)环孢霉素A的质量与氯仿的体积比为(8~12)g:(35~45)ml。
优选的,所述步骤1)反应的时间为4.5~5.5h,所述反应在搅拌下进行,所述搅拌的速度为450~550rpm。
优选的,所述步骤2)环孢霉素A羧基衍生物与碳二亚胺、载体蛋白的质量比为(90~110):(45~55):(90~110)。
优选的,所述步骤2)载体蛋白包括牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、鸡卵清蛋白或血蓝蛋白。
优选的,所述步骤2)偶联的时间为2.5~3.5h。
本发明还提供了一种环孢霉素A免疫原,所述环孢霉素A免疫原由上述技术方案所述的制备方法制备得到。
本发明还提供了一种抗环孢霉素A特异性抗体,将上述技术方案所述的环孢霉素A免疫原免疫动物后得到。
本发明提供了一种环孢霉素A免疫原的制备方法,将环孢霉素A与草酰氯在氯仿中反应,将得到的环孢霉素A羧基衍生物与碳二亚胺、载体蛋白偶联,得到环孢霉素A免疫原。本发明在制备环孢霉素A免疫原的过程中引入的连接臂能够很好的暴露环孢霉素A分子,能够更好地呈现环孢霉素A的特征基团,再将免疫原制备成特异性抗体,能够与环孢霉素A特异性结合,实现检测环孢霉素A。
本发明实施例的结果显示:采用本发明的制备方法得到环孢霉素A免疫原,再将环孢霉素A免疫原制备成抗环孢霉素A特异性抗体,该特异性抗体能够特异性识别环孢霉素A,与去甲环孢素、羟化环孢素和二羟化环孢素等存在极微弱的交叉反应。
附图说明
图1为环孢霉素A的结构式;
图2为环孢霉素A羧基衍生物的结构式;
图3为环孢霉素A免疫原合成路线;
图4为本发明构建的环孢霉素A化学发光法同质谱法测定CSA样本的相关性。
具体实施方式
本发明提供了一种环孢霉素A免疫原的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)将环孢霉素A与草酰氯在氯仿中反应,得到环孢霉素A羧基衍生物;
2)将所述步骤1)得到的环孢霉素A羧基衍生物与碳二亚胺、载体蛋白混合、偶联,得到环孢霉素A免疫原。
本发明将环孢霉素A与草酰氯在氯仿中反应,得到环孢霉素A羧基衍生物。
在本发明中,所述环孢霉素A羧基衍生物引入的4原子长度的含酯键的连接臂能够很好的暴露环孢霉素A分子,能够更好地呈现环孢霉素A的特征基团。
在本发明中,所述环孢霉素A与草酰氯的质量比优选为(8~12):(7~7.5),更优选为(9~11):(7.1~7.3),最优选为10:7.23。
在本发明中,所述环孢霉素A的质量与氯仿的体积比优选为(8~12)g:(35~45)ml,更优选为10g:40ml。
本发明优选将所述环孢霉素A溶于氯仿后,再将草酰氯以滴加的方式缓慢加入。
在本发明中,所述反应的时间优选为4.5~5.5h,更优选为5h;所述反应优选在搅拌下进行,所述搅拌的速度优选为450~550rpm,更优选为500rpm。
本发明将得到的环孢霉素A羧基衍生物与碳二亚胺、载体蛋白混合、偶联,得到环孢霉素A免疫原。
在本发明中,所述环孢霉素A羧基衍生物与碳二亚胺、载体蛋白的质量比优选为(90~110):(45~55):(90~110),更优选为100:50:100。
在本发明中,所述载体蛋白优选包括牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、鸡卵清蛋白或血蓝蛋白。
在本发明中,所述混合优选包括:
将所述载体蛋白溶于MES缓冲液,得到载体蛋白溶液;
将所述碳二亚胺溶于水中,得到碳二亚胺溶液;
将所述环孢霉素A羧基衍生物溶于氯仿中,得到环孢霉素A羧基衍生物溶液;
将所述载体蛋白溶液与环孢霉素A羧基衍生物溶液混合后,再与碳二亚胺溶液混合。
在本发明中,所述载体蛋白的质量与MES缓冲液的体积比优选为(90~110)mg:(8~12)ml,更优选为100mg:10ml。在本发明中,所述MES缓冲液的浓度优选为0.1M;所述MES缓冲液的pH值优选为4.5。
在本发明中,所述碳二亚胺的质量与水的体积比优选为(45~55)mg:(4~6)ml,更优选为50mg:5ml。在本发明中,所述水优选为超纯水。
在本发明中,所述环孢霉素A羧基衍生物的质量与氯仿的体积比优选为(90~110)mg:(4~6)ml,更优选为100mg:5ml。
在本发明中,所述偶联的时间优选为2.5~3.5h,更优选为3h。在本发明中,所述偶联优选在搅拌下进行,所述搅拌的速度优选为1000rpm/min。
本发明优选将偶联后,得到的偶联物透析到0.01M的PBS缓冲液中,得到环孢霉素A免疫原。
本发明还提供了一种环孢霉素A免疫原,所述环孢霉素A免疫原由上述技术方案所述的制备方法制备得到。
本发明还提供了一种抗环孢霉素A特异性抗体,将上述技术方案所述的环孢霉素A免疫原免疫动物后得到。
在本发明中,所述动物优选包括兔、鸡、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马。
本发明对所述免疫的方法没有特殊限定,采用本领域技术人员常规免疫的方法即可。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种环孢霉素A免疫原的制备方法、环孢霉素A免疫原和抗环孢霉素A特异性抗体做进一步详细的介绍,本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
1)称取10.0g的环孢霉素A溶于40ml氯仿中,缓慢滴加入7.23g草酰氯,室温500rpm/min搅拌5小时,得到合成溶液。
2)将上述合成溶液用水稀释后,分成上下两层,有机相在下层,分出有机层,使用100ml水洗涤有机层,减压蒸馏,去除溶剂,加入40ml 10(W/V)%的K2CO3溶液中搅拌洗涤,再滴加10ml 10%(V/V)的HCL溶液,酸化处理,有固体析出,过滤固体,用水淋洗。真空干燥烘干,得到环孢霉素A羧基衍生物,结构式如图2所示,质量为9.82g,收率92.7%,m.p:198~202℃。
实施例2
1)将100mg牛甲状腺球蛋白溶解于10ml 0.1M,pH4.5MES缓冲液中,得到溶液A;
2)将100mg实施例1制备的环孢霉素A羧基衍生物溶解于5ml氯仿溶液中,得到溶液B,将溶液B加入到A溶液中,得到混合液;
3)将50mg碳二亚胺溶于5ml的超纯水中,立即加入到上述混合液中,室温搅拌反应3小时;
4)将得到的反应产物透析到0.01M PBS中,得到环孢霉素A免疫原。
实施例3
1)用生理盐水将实施例2制备的环孢霉素A免疫原稀释到1mg/ml,取1ml免疫原溶液与1ml弗氏完全佐剂混合,采用摇床2000rp/min 2h震荡乳化,并对实验室兔进行免疫,可选择颈部皮下多点免疫。
2)3~4周后,取1ml免疫原溶液同弗氏不完全佐剂混合乳化,对实验兔进行免疫,之后每三周免疫一次,均为免疫原溶液和弗氏不完全佐剂的混合物,共免疫4次。
3)四免后7~10天,对上述实验兔采血,离心取上清并用proteinA柱分离纯化得到抗环孢霉素A特异性抗体。
通过间接ELISA测定抗环孢霉素A特异性抗体的效价,该抗体效价为1:512000。
实施例4
对实施例3制备的抗环孢霉素A抗体特异性分析
利用竞争ELISA的方法对抗环孢霉素A特异性抗体的特异性进行测试。
选取了3种环孢霉素A在体内的主要代谢产物,去甲环孢素、羟化环孢素、二羟化环孢素,2种常见衍生物环孢素17和环孢素18及10个临床常用药物。采用竞争ELISA的方法测定制备的抗环孢霉素A抗体对上述化合物的交叉反应率。结果见表1。
表1测试结果
从表1可以看出,抗环孢霉素A抗体仅对环孢霉素A高度相似物存在微弱的交叉反应;对其它的一些临床常用药物无交叉反应,证实了本发明制备的是高度特异性的抗环孢霉素A抗体,对于测定临床复杂样本具有重要意义。
实施例5
化学发光法测定血浆样本中环孢霉素A含量
采用本发明中实施例2中的环孢霉素A免疫原和实施例3中的抗环孢霉素A特异性抗体构建板式化学发光法,测定临床血浆样本中的环孢霉素A含量。
1)包被板的准备:环孢霉素A免疫原用PBS稀释到1ug/mL,加入到聚苯乙烯96孔板中,放入37℃烘箱干燥2h,包被到板中,加入1%的BSA溶液,37℃烘箱干燥2h,封闭板上多余的位点,用含0.1%TW20的PBS洗涤3次,烘干,密封4℃保存。
2)抗环孢霉素A抗体-辣根过氧化物酶偶联物制备:
A.称取5mg HRP溶于1ml 0.1M PB pH6.0,加入2mg NaIO4,室温搅拌反应1h;
B.加入100ul乙二醇,室温搅拌反应1h;
C.反应物用G25脱盐到PH8.00.1MNaHCO3溶液,立即加入2mg抗环孢霉素A抗体,室温搅拌反应1h。
D.反应产物用G25脱盐到PBS,用20mM Tris 0.1%BSA 0.1%TW20,0.9%NaCl,0.05%NaN3pH7.4缓冲液稀释到0.5ug/mL。
3)样本处理
100ul环孢霉素A血浆样本,加入900ul甲醇,混合1min,离心12000rpm/min,取上清,加入等体积的PBS,混合均匀。
4)样本测定
之前准备好的包被有环孢霉素A抗原的96孔板,加入50ul上述处理好的样本,再加入50ul稀释后的抗环孢霉素A抗体-辣根过氧化物酶溶液,37℃静止30min,用含0.1%TW20的PBS洗涤2次,加入100ul的鲁米洛化学法底物,并在化学发光检测仪中检测。
选取20例样本,同时用本发明实例的化学发光法和质谱法测定,并计算相关性,结果如图4所示。
从图4可以得出,相关性系数r=0.99,表明化学发光法测定准确,说明本发明制备的抗环孢霉素A抗体性能优异,能够满足临床的需求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种环孢霉素A免疫原的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)将环孢霉素A与草酰氯在氯仿中反应,得到环孢霉素A羧基衍生物;
2)将所述步骤1)得到的环孢霉素A羧基衍生物与碳二亚胺、载体蛋白混合、偶联,得到环孢霉素A免疫原。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤1)环孢霉素A与草酰氯的质量比为(8~12):(7~7.5)。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤1)环孢霉素A与草酰氯的质量比为10:7.23。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤1)环孢霉素A的质量与氯仿的体积比为(8~12)g:(35~45)ml。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤1)反应的时间为4.5~5.5h,所述反应在搅拌下进行,所述搅拌的速度为450~550rpm。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤2)环孢霉素A羧基衍生物与碳二亚胺、载体蛋白的质量比为(90~110):(45~55):(90~110)。
7.根据权利要求1或6所述的制备方法,其特征在于,所述步骤2)载体蛋白包括牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、鸡卵清蛋白或血蓝蛋白。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤2)偶联的时间为2.5~3.5h。
9.一种环孢霉素A免疫原,其特征在于,所述环孢霉素A免疫原由权利要求1~8任一项所述的制备方法制备得到。
10.一种抗环孢霉素A特异性抗体,其特征在于,将权利要求1~8任一项所述的制备方法制备得到的环孢霉素A免疫原或权利要求9所述的环孢霉素A免疫原免疫动物后得到。
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