CN109627321A - 一种环孢霉素a免疫原的制备方法、环孢霉素a免疫原和抗环孢霉素a特异性抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种环孢霉素A免疫原的制备方法，属于酶联免疫检测技术领域，包括以下步骤：将环孢霉素A与草酰氯在氯仿中反应，得到环孢霉素A羧基衍生物；将得到的环孢霉素A羧基衍生物与碳二亚胺、载体蛋白混合、偶联，得到环孢霉素A免疫原。采用本发明的制备方法得到环孢霉素A免疫原，再将环孢霉素A免疫原制备成抗环孢霉素A特异性抗体，该特异性抗体能够特异性识别环孢霉素A，与去甲环孢素、羟化环孢素和二羟化环孢素等存在极微弱的交叉反应。
Description
技术领域
本发明涉及酶联免疫检测技术领域，具体涉及一种环孢霉素A免疫原的制备方法、环孢霉素A免疫原和抗环孢霉素A特异性抗体。
背景技术
环孢霉素A是一种高效免疫抑制剂，临床主要用于肝、肾、胰、心、肺、皮肤、角膜及骨髓移植，以减轻或防止排斥反应，提高患者的生存率和移植物的存活率。但由于其治疗窗狭窄，药动学参数个体差异大，低于有效浓度易引起排斥反应或诱发自身免疫性疾病，高于有效浓度则易引起感染或肝、肾及中枢神经系统损害。而且，CsA血药浓度水平易受性别、年龄、肥胖、肝功能、胃肠功能、药物相互作用以及饮食等众多因素的影响。因此，监测全血中CsA的血药浓度并调整其浓度在有效范围已成为临床合理使用CsA的重要方法。
目前已知的环孢霉素A(cyclosporine A,CsA)在体内的代谢产物有15种之多，主要以去甲环孢素，羟化环孢素及二羟化环孢素三种代谢物为主。因此在环孢霉素A的血药浓度监测过程中，特异性的测定CsA不受其代谢物的影响，是准确反映CsA药代动力学过程及安全用药的重要前提。
目前，体外测定环孢霉素A的方法主要高效液相色谱法，有放射免疫法(RIA)，化学发光免疫法(CLIA)，荧光偏振法(FPIA)，酶联免疫吸附法(ELISA)，胶乳增强比浊法。其中，高效液相色谱法，能够识别环孢霉素A及其类似物，但其设备昂贵，操作复杂，需要前处理，通量小，不适合在临床推广。而放射免疫法(RIA)，化学发光免疫法(CLIA)，荧光偏振法(FPIA)，酶联免疫吸附法(ELISA)，胶乳增强比浊法，均是基于抗原抗体的免疫反应原理，因此试剂使用的CsA抗体的特异性就决定了检测试剂对CsA药物监测的特异性。然而，目前已知多数商品化CsA测定试剂并不是特异性识别CsA，同CsA的主要代谢物，去甲环孢素、羟化环孢素和二羟化环孢素存在较大的交叉反应。
发明内容
本发明的目的在于提供一种环孢霉素A免疫原的制备方法，采用本发明的制备方法得到环孢霉素A免疫原，再将环孢霉素A免疫原制备成抗环孢霉素A特异性抗体，该特异性抗体能够特异性识别环孢霉素A，与去甲环孢素、羟化环孢素和二羟化环孢素等存在极微弱的交叉反应。
本发明提供了一种环孢霉素A免疫原的制备方法，包括以下步骤：
1)将环孢霉素A与草酰氯在氯仿中反应，得到环孢霉素A羧基衍生物；
2)将所述步骤1)得到的环孢霉素A羧基衍生物与碳二亚胺、载体蛋白混合、偶联，得到环孢霉素A免疫原。
优选的，所述步骤1)环孢霉素A与草酰氯的质量比为(8～12):(7～7.5)。
优选的，所述步骤1)环孢霉素A与草酰氯的质量比为10:7.23。
优选的，所述步骤1)环孢霉素A的质量与氯仿的体积比为(8～12)g:(35～45)ml。
优选的，所述步骤1)反应的时间为4.5～5.5h，所述反应在搅拌下进行，所述搅拌的速度为450～550rpm。
优选的，所述步骤2)环孢霉素A羧基衍生物与碳二亚胺、载体蛋白的质量比为(90～110):(45～55):(90～110)。
优选的，所述步骤2)载体蛋白包括牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、鸡卵清蛋白或血蓝蛋白。
优选的，所述步骤2)偶联的时间为2.5～3.5h。
本发明还提供了一种环孢霉素A免疫原，所述环孢霉素A免疫原由上述技术方案所述的制备方法制备得到。
本发明还提供了一种抗环孢霉素A特异性抗体，将上述技术方案所述的环孢霉素A免疫原免疫动物后得到。
本发明提供了一种环孢霉素A免疫原的制备方法，将环孢霉素A与草酰氯在氯仿中反应，将得到的环孢霉素A羧基衍生物与碳二亚胺、载体蛋白偶联，得到环孢霉素A免疫原。本发明在制备环孢霉素A免疫原的过程中引入的连接臂能够很好的暴露环孢霉素A分子，能够更好地呈现环孢霉素A的特征基团，再将免疫原制备成特异性抗体，能够与环孢霉素A特异性结合，实现检测环孢霉素A。
本发明实施例的结果显示：采用本发明的制备方法得到环孢霉素A免疫原，再将环孢霉素A免疫原制备成抗环孢霉素A特异性抗体，该特异性抗体能够特异性识别环孢霉素A，与去甲环孢素、羟化环孢素和二羟化环孢素等存在极微弱的交叉反应。
附图说明
图1为环孢霉素A的结构式；
图2为环孢霉素A羧基衍生物的结构式；
图3为环孢霉素A免疫原合成路线；
图4为本发明构建的环孢霉素A化学发光法同质谱法测定CSA样本的相关性。
具体实施方式
本发明提供了一种环孢霉素A免疫原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将环孢霉素A与草酰氯在氯仿中反应，得到环孢霉素A羧基衍生物；
2)将所述步骤1)得到的环孢霉素A羧基衍生物与碳二亚胺、载体蛋白混合、偶联，得到环孢霉素A免疫原。
本发明将环孢霉素A与草酰氯在氯仿中反应，得到环孢霉素A羧基衍生物。
在本发明中，所述环孢霉素A羧基衍生物引入的4原子长度的含酯键的连接臂能够很好的暴露环孢霉素A分子，能够更好地呈现环孢霉素A的特征基团。
在本发明中，所述环孢霉素A与草酰氯的质量比优选为(8～12):(7～7.5)，更优选为(9～11):(7.1～7.3)，最优选为10:7.23。
在本发明中，所述环孢霉素A的质量与氯仿的体积比优选为(8～12)g:(35～45)ml，更优选为10g:40ml。
本发明优选将所述环孢霉素A溶于氯仿后，再将草酰氯以滴加的方式缓慢加入。
在本发明中，所述反应的时间优选为4.5～5.5h，更优选为5h；所述反应优选在搅拌下进行，所述搅拌的速度优选为450～550rpm，更优选为500rpm。
本发明将得到的环孢霉素A羧基衍生物与碳二亚胺、载体蛋白混合、偶联，得到环孢霉素A免疫原。
在本发明中，所述环孢霉素A羧基衍生物与碳二亚胺、载体蛋白的质量比优选为(90～110):(45～55):(90～110)，更优选为100:50:100。
在本发明中，所述载体蛋白优选包括牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、鸡卵清蛋白或血蓝蛋白。
在本发明中，所述混合优选包括：
将所述载体蛋白溶于MES缓冲液，得到载体蛋白溶液；
将所述碳二亚胺溶于水中，得到碳二亚胺溶液；
将所述环孢霉素A羧基衍生物溶于氯仿中，得到环孢霉素A羧基衍生物溶液；
将所述载体蛋白溶液与环孢霉素A羧基衍生物溶液混合后，再与碳二亚胺溶液混合。
在本发明中，所述载体蛋白的质量与MES缓冲液的体积比优选为(90～110)mg:(8～12)ml，更优选为100mg:10ml。在本发明中，所述MES缓冲液的浓度优选为0.1M；所述MES缓冲液的pH值优选为4.5。
在本发明中，所述碳二亚胺的质量与水的体积比优选为(45～55)mg:(4～6)ml，更优选为50mg:5ml。在本发明中，所述水优选为超纯水。
在本发明中，所述环孢霉素A羧基衍生物的质量与氯仿的体积比优选为(90～110)mg:(4～6)ml，更优选为100mg:5ml。
在本发明中，所述偶联的时间优选为2.5～3.5h，更优选为3h。在本发明中，所述偶联优选在搅拌下进行，所述搅拌的速度优选为1000rpm/min。
本发明优选将偶联后，得到的偶联物透析到0.01M的PBS缓冲液中，得到环孢霉素A免疫原。
本发明还提供了一种环孢霉素A免疫原，所述环孢霉素A免疫原由上述技术方案所述的制备方法制备得到。
本发明还提供了一种抗环孢霉素A特异性抗体，将上述技术方案所述的环孢霉素A免疫原免疫动物后得到。
在本发明中，所述动物优选包括兔、鸡、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马。
本发明对所述免疫的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规免疫的方法即可。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种环孢霉素A免疫原的制备方法、环孢霉素A免疫原和抗环孢霉素A特异性抗体做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
1)称取10.0g的环孢霉素A溶于40ml氯仿中，缓慢滴加入7.23g草酰氯，室温500rpm/min搅拌5小时，得到合成溶液。
2)将上述合成溶液用水稀释后，分成上下两层，有机相在下层，分出有机层，使用100ml水洗涤有机层，减压蒸馏，去除溶剂，加入40ml 10(W/V)％的K2CO3溶液中搅拌洗涤，再滴加10ml 10％(V/V)的HCL溶液，酸化处理，有固体析出，过滤固体，用水淋洗。真空干燥烘干，得到环孢霉素A羧基衍生物，结构式如图2所示，质量为9.82g，收率92.7％，m.p：198～202℃。
实施例2
1)将100mg牛甲状腺球蛋白溶解于10ml 0.1M，pH4.5MES缓冲液中，得到溶液A；
2)将100mg实施例1制备的环孢霉素A羧基衍生物溶解于5ml氯仿溶液中，得到溶液B，将溶液B加入到A溶液中，得到混合液；
3)将50mg碳二亚胺溶于5ml的超纯水中，立即加入到上述混合液中，室温搅拌反应3小时；
4)将得到的反应产物透析到0.01M PBS中，得到环孢霉素A免疫原。
实施例3
1)用生理盐水将实施例2制备的环孢霉素A免疫原稀释到1mg/ml，取1ml免疫原溶液与1ml弗氏完全佐剂混合，采用摇床2000rp/min 2h震荡乳化，并对实验室兔进行免疫，可选择颈部皮下多点免疫。
2)3～4周后，取1ml免疫原溶液同弗氏不完全佐剂混合乳化，对实验兔进行免疫，之后每三周免疫一次，均为免疫原溶液和弗氏不完全佐剂的混合物，共免疫4次。
3)四免后7～10天，对上述实验兔采血，离心取上清并用proteinA柱分离纯化得到抗环孢霉素A特异性抗体。
通过间接ELISA测定抗环孢霉素A特异性抗体的效价，该抗体效价为1:512000。
实施例4
对实施例3制备的抗环孢霉素A抗体特异性分析
利用竞争ELISA的方法对抗环孢霉素A特异性抗体的特异性进行测试。
选取了3种环孢霉素A在体内的主要代谢产物，去甲环孢素、羟化环孢素、二羟化环孢素，2种常见衍生物环孢素17和环孢素18及10个临床常用药物。采用竞争ELISA的方法测定制备的抗环孢霉素A抗体对上述化合物的交叉反应率。结果见表1。
表1测试结果
从表1可以看出，抗环孢霉素A抗体仅对环孢霉素A高度相似物存在微弱的交叉反应；对其它的一些临床常用药物无交叉反应，证实了本发明制备的是高度特异性的抗环孢霉素A抗体，对于测定临床复杂样本具有重要意义。
实施例5
化学发光法测定血浆样本中环孢霉素A含量
采用本发明中实施例2中的环孢霉素A免疫原和实施例3中的抗环孢霉素A特异性抗体构建板式化学发光法，测定临床血浆样本中的环孢霉素A含量。
1)包被板的准备：环孢霉素A免疫原用PBS稀释到1ug/mL，加入到聚苯乙烯96孔板中，放入37℃烘箱干燥2h，包被到板中，加入1％的BSA溶液，37℃烘箱干燥2h，封闭板上多余的位点，用含0.1％TW20的PBS洗涤3次，烘干，密封4℃保存。
2)抗环孢霉素A抗体-辣根过氧化物酶偶联物制备：
A.称取5mg HRP溶于1ml 0.1M PB pH6.0，加入2mg NaIO4，室温搅拌反应1h；
B.加入100ul乙二醇，室温搅拌反应1h；
C.反应物用G25脱盐到PH8.00.1MNaHCO3溶液，立即加入2mg抗环孢霉素A抗体，室温搅拌反应1h。
D.反应产物用G25脱盐到PBS，用20mM Tris 0.1％BSA 0.1％TW20，0.9％NaCl，0.05％NaN3pH7.4缓冲液稀释到0.5ug/mL。
3)样本处理
100ul环孢霉素A血浆样本，加入900ul甲醇，混合1min，离心12000rpm/min，取上清，加入等体积的PBS，混合均匀。
4)样本测定
之前准备好的包被有环孢霉素A抗原的96孔板，加入50ul上述处理好的样本，再加入50ul稀释后的抗环孢霉素A抗体-辣根过氧化物酶溶液，37℃静止30min，用含0.1％TW20的PBS洗涤2次，加入100ul的鲁米洛化学法底物，并在化学发光检测仪中检测。
选取20例样本，同时用本发明实例的化学发光法和质谱法测定，并计算相关性，结果如图4所示。
从图4可以得出，相关性系数r＝0.99，表明化学发光法测定准确，说明本发明制备的抗环孢霉素A抗体性能优异，能够满足临床的需求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种环孢霉素A免疫原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将环孢霉素A与草酰氯在氯仿中反应，得到环孢霉素A羧基衍生物；
2)将所述步骤1)得到的环孢霉素A羧基衍生物与碳二亚胺、载体蛋白混合、偶联，得到环孢霉素A免疫原。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)环孢霉素A与草酰氯的质量比为(8～12):(7～7.5)。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)环孢霉素A与草酰氯的质量比为10:7.23。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)环孢霉素A的质量与氯仿的体积比为(8～12)g:(35～45)ml。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)反应的时间为4.5～5.5h，所述反应在搅拌下进行，所述搅拌的速度为450～550rpm。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)环孢霉素A羧基衍生物与碳二亚胺、载体蛋白的质量比为(90～110):(45～55):(90～110)。
7.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)载体蛋白包括牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、鸡卵清蛋白或血蓝蛋白。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)偶联的时间为2.5～3.5h。
9.一种环孢霉素A免疫原，其特征在于，所述环孢霉素A免疫原由权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到。
10.一种抗环孢霉素A特异性抗体，其特征在于，将权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到的环孢霉素A免疫原或权利要求9所述的环孢霉素A免疫原免疫动物后得到。
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