CN107365342B - 醛固酮衍生物、免疫原、及合成方法、特异性抗体和检测试剂及制备方法、试剂盒 - Google Patents

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Abstract

一种醛固酮衍生物、免疫原、及合成方法、特异性抗体和检测试剂及制备方法、试剂盒，属于生物技术领域。本发明制备的醛固酮免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗醛固酮特异性抗体，并且与92种常见的干扰物无任何交叉反应；由该抗体制备得到的醛固酮检测试剂，可以精确快速地确定样品中的醛固酮含量。与市场上现有的检测试剂比较，本发明检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低醛固酮检测成本，有利于临床大规模推广使用。

Description

醛固酮衍生物、免疫原、及合成方法、特异性抗体和检测试剂 及制备方法、试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种醛固酮衍生物、免疫原、及合成方法、特异性抗体和检测试剂及制备方法、试剂盒。
背景技术
醛固酮(Aldosterone)，其结构式如下式(Ⅲ)所示。
醛固酮是由肾上腺皮质球状带细胞合成和分泌的一种盐皮质激素。醛固酮主要作用于肾脏远曲小管和肾皮质集合管，可增加对钠离子的重吸收和促进钾离子的排泄。此外，醛固酮还能作用于髓质集合管，促进氢离子的排泄，酸化尿液。醛固酮的分泌是通过肾素－血管紧张素－醛固酮系统实现的。当细胞外液容量下降时，刺激肾小球旁细胞分泌肾素，激活肾素－血管紧张素－醛固酮系统，醛固酮分泌增加，使肾脏重吸收钠增加，进而引起水重吸收增加，细胞外液容量增多。相反，细胞外液容量增多时，通过与上述相反的机制，使醛固酮分泌减少，肾重吸收钠和水减少，细胞外液容量下降。血钠降低，血钾升高同样刺激肾上腺皮质，使醛固酮分泌增加。
醛固酮分泌增加提示可能与以下临床病症有关：1.肾上腺皮质增生等原因引起的原发性醛固酮增多症；2.下丘脑-垂体功能紊乱、异位促肾上腺皮质激素分泌等原因造成的高继发性醛固酮增多症；3.肝硬化、肾性高血压、多发性肾囊肿等原因诱发的醛固酮非特异性增多症。醛固酮病理性降低主要见于原发性肾上腺皮质功能减退症，也称Addison’s病。
肾素－血管紧张素－醛固酮系统通过由身体多个器官合成、分泌的一系列循环激素，在体内起着调节血压、水和电解质平衡，维持机体内环境稳定的作用。其作用机理包括调节全身血容量和控制外周阻力。大量临床试验研究表明，肾素－血管紧张素－醛固酮系统协调作用于心血管系统、泌尿系统、神经系统等多个系统，在维持机体血压和血容量平衡中发挥着重要的生理作用。当机体出现高血压、呼吸系统及泌尿系统疾病时，肾素－血管紧张素－醛固酮水平均出现了一系列异常改变，准确的测量肾素－血管紧张素－醛固酮水平，对相应疾病的诊断和治疗均有着极为重要的意义。
目前，临床上测定血清、血浆或尿液中醛固酮含量的方法较多，主要有酶联免疫吸附法、化学发光法、磁微粒化学发光法、增强化学发光免疫分析法、高效液相色谱法等。但是，现有的醛固酮检测方法都有一定的局限性，如操作复杂、稳定性较差、需要配备专用仪器、检测成本较高等，都不适合大批量临床样品的测定。目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的醛固酮检测试剂，尤其是质量好的自动化检验试剂。因此，研发生产质量达到临床要求、实用性强、性价比高，可应用于全自动生化分析仪的醛固酮测定试剂盒已成为国内外体外诊断试剂行业的热点。
发明内容
在本发明的第一方面，提供了一种醛固酮衍生物及其合成方法。利用本发明提供的醛固酮衍生物可以制备具有高免疫原性的免疫原。
在本发明的第二方面，提供了一种醛固酮免疫原及其制备方法。由所述方法制备的醛固酮免疫原具有免疫原性高的优点，可以诱导得到高效价的抗醛固酮特异性抗体。
在本发明的第三方面，提供了一种利用上述醛固酮免疫原制备的特异性强的抗醛固酮特异性抗体。前述之抗体特异性高，与醛固酮的结合力强。
在本发明的第四方面，提供了一种醛固酮检测试剂及其制备方法。醛固酮检测试剂可以快速、准确地确定样品中的醛固酮含量。
在本发明的第五方面，提供了一种利用上述醛固酮检测试剂的试剂盒。其可应用于全自动生化分析设备，以实现对醛固酮的高通量、快速检测。
本发明是这样实现的：
一种醛固酮衍生物，其结构式如式(Ⅰ)所示：
一种式(Ⅰ)所示的醛固酮衍生物的制备方法，包括：使醛固酮的羧羟基发生卤代反应得到卤化物；以所述卤化物为底物，与4-氨基丁酸叔丁酯发生伯胺卤代反应得到含有仲胺基团的中间产物；对所述中间产物中的仲胺基团进行保护后，在酸性条件下发生酯基水解反应。
其中，在使醛固酮的羧羟基发生卤代反应中，卤代反应使用的卤化试剂为氯化锂和甲磺酰卤；其中，在对所述中间产物中的仲胺基团进行保护时，采用Boc酸酐作为保护剂。
一种醛固酮免疫原，其结构式如式(Ⅱ)所示：
其中，
-NH-(CH2)3-CO-为连接基团；X是载体，且为具有免疫原性的蛋白质或多肽。
所述具有免疫原性的蛋白质包括血清蛋白、血蓝蛋白、以及甲状腺球蛋白中的任一种，优选地，所述具有免疫原性的蛋白质为牛血清白蛋白。
一种上述醛固酮免疫原的合成方法包括：
使半抗原与载体连接。半抗原具有如式(Ⅰ)所示的结构式，
使所述半抗原与所述载体连接的方法包括：以碳化二亚胺类物质为偶联剂，使所述载体中的氨基与所述半抗原中的羧基发生偶联反应，所述碳化二亚胺类物质包括二乙基碳化二亚胺、二苯基碳化二亚胺、二丙基碳化二亚胺、1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺中的一种或多种；
使所述载体中的氨基与所述半抗原中的羧基发生偶联反应的方法包括：提供由所述载体分散于磷酸缓冲液中得到的载体溶液；提供由所述半抗原分散于二甲基甲酰胺、乙醇、磷酸钾缓冲液、1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基) 碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合而成的半抗原混合液；将所述半抗原混合液滴加至所述载体溶液中，在2～8℃下搅拌过夜，纯化。
一种抗醛固酮特异性抗体。所述的抗醛固酮特异性抗体为采用前述的醛固酮免疫原免疫动物后产生的抗体分子、或抗体片段、或抗体衍生物。其中，抗体片段和抗体衍生物均保留与醛固酮进行特异性结合能力。
所述抗体分子、抗体片段、抗体衍生物均为：采用单一的醛固酮免疫原对动物加强免疫所获得的多克隆抗体；
或者，所述抗体分子、抗体片段、抗体衍生物均为：采用单一的醛固酮免疫原对动物加强免疫后，经所述动物体细胞杂交获得的单克隆抗体，其中，所述动物包括兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠、以及马中的任一种。
一种前述的抗醛固酮特异性抗体的制备方法。制备方法包括：对动物进行注射第一异体溶液，所述第一异体溶液由经稀释后的所述醛固酮免疫原与弗氏完全佐剂混合而成；在经过第一预设时间后，以预设的周期对所述动物进行多次注射第二异体溶液，所述第二异体溶液由经稀释后的所述醛固酮免疫原与弗氏不完全佐剂混合而成；在经过以预设的周期对所述动物多次进行注射第二异体溶液后，对所述动物进行取血，并提取抗体。
其中，所述第一异体溶液由经磷酸盐缓冲液稀释后的所述醛固酮免疫原与弗氏完全佐剂混合而成；
所述第二异体溶液由经磷酸盐缓冲液稀释后的所述醛固酮免疫原与弗氏不完全佐剂混合而成；
优选地，经磷酸盐缓冲液稀释后的所述醛固酮免疫原的含量为 1.0mg/mL，所述第一预设时间为2～3周，所述预设的周期为四周，对所述动物进行四次注射第二异体溶液。
一种醛固酮检测试剂。所述醛固酮检测试剂包括指示试剂、如前述之抗醛固酮特异性抗体。其中，所述指示试剂包括酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂、发光试剂中的任一种，优选为酶试剂。
所述酶试剂由醛固酮酶标偶联物和酶的底物组成，其中，所述酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物，所述酶的底物为葡萄糖-6- 磷酸。
一种前述的醛固酮检测试剂的制备方法，包括分别独立地提供第一试剂和第二试剂；
将氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和葡萄糖-6-磷酸溶解于Tris缓冲液中得到均相酶底物，将均相酶底物与抗醛固酮特异性抗体混合得到第一试剂；
将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物溶解于Tris缓冲液中得到第二试剂；
其中，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物通过如下方法制作而成：
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶室温溶解于含三羟甲基氨基甲烷、氯化镁和氯化钠的溶液中，然后在溶液中加入：葡萄糖-6-磷酸、卡必醇以及还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，再滴加二甲基亚砜得到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；
将无水的醛固酮衍生物溶解于二甲基甲酰胺中、并冷却至-2～-8℃；在 -2～-8℃的条件下，加入三丁胺、氯甲酸异丁酯搅拌混合得到激活的醛固酮衍生物溶液，醛固酮衍生物具有如式(Ⅰ)所示的结构式，
将激活的醛固酮衍生物溶液溶解于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中；2-8℃搅拌过夜以得到含有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和醛固酮衍生物反应得到的偶联物的粗品。
一种试剂盒，用于对生物样本中的醛固酮进行体外检测。所述的试剂盒含有前述的醛固酮检测试剂，所述生物样本包括尿液样本和血液样本，所述尿液样本包括24小时尿和即时尿，所述血液样本包括血清和血浆。
本发明的有益效果：本发明提出了一种全新的醛固酮衍生物，并利用醛固酮衍生物制备免疫原性强的醛固酮免疫原及其抗体。其中，本发明的醛固酮免疫原特异性强、免疫原性高。抗醛固酮特异性抗体特异性强、效价高，并且与常见的92种干扰物无任何交叉反应。用本发明方法制备的抗体制备的醛固酮均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对醛固酮高通量、快速化的检测。检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低醛固酮检测成本，有利于临床推广使用，能有效满足国内日益增长的临床检测需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单介绍。
图1为本发明实施例1中的醛固酮衍生物的合成路线图；
图2是本发明实施例4中的醛固酮的ELISA检测反应曲线；
图3是本发明实施例7中的醛固酮的均相酶免疫检测反应曲线；
图4是本发明实施例9中醛固酮均相酶免疫法与高效液相色谱法相关性分析图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下针对本发明实施例的醛固酮衍生物、免疫原、特异性抗体和检测试剂及制备方法进行具体说明：
一种醛固酮衍生物。醛固酮衍生物的结构如式(Ⅰ)所示，
需要说明的是，本发明中所述的醛固酮衍生物，还可以其药学上可接受的盐形式存在，或者药学上可接受的溶剂化物。其中，"药学上可接受的 "是指适合于药学上使用的化合物。
在本发明的通式中，实心楔形(wedged bond)表示该键在纸面的上面，虚线键(broken bond)表示该键在纸面的下面。
基于上述醛固酮衍生物，本发明提出了一种合成上述醛固酮衍生物的方法。
醛固酮衍生物的合成方法包括：
使醛固酮的羧羟基发生卤代反应得到卤化物。以卤化物为底物，与4- 氨基丁酸叔丁酯发生伯胺卤代反应得到含有仲胺基团的中间产物。对中间产物中的仲胺基团进行保护后，在酸性条件下发生酯基水解反应。
在使醛固酮的羧羟基发生卤代反应中，卤代反应使用的卤化试剂为氯化锂(LiCL)和甲磺酰卤(MsCL)。醛固酮首先和MsCL反应，Ms-取代醛固酮中羧羟基中的羟基氢。然后，在与LiCL进行氯代反应。
在对中间产物中的仲胺基团进行保护时，本发明实施例中采用Boc酸酐作为保护剂。
其中，4-氨基丁酸叔丁酯可以通过发明人已知的手段获得。作为一种示例，本发明提出了一种4-氨基丁酸叔丁酯，以4-氨基丁酸(哌啶酸，CAS： 56-12-2)为起始物，与氯甲酸苄酯(CBZ-Cl)反应对4-氨基丁酸中的伯胺进行保护，再与叔丁醇发生脱水反应，得到酯类物质，然后在钯碳(PdC) 催化加氢还原得到4-氨基丁酸叔丁酯。本发明还提出了一种醛固酮免疫原，其结构式如式(Ⅱ)所示，
其中，-NH-(CH2)3-CO-为连接基团；X是载体，且为具有免疫原性的蛋白质或多肽。
在本发明的一些示例中，前述具有免疫原性的蛋白质包括血清蛋白、血蓝蛋白、以及甲状腺球蛋白中的任一种。优选地，具有免疫原性的蛋白质为血清蛋白，更优选地为牛血清白蛋白。
前述的醛固酮免疫原的合成方法，包括：使半抗原与载体连接，半抗原具有如式(Ⅰ)所示的结构式，
本发明提出的醛固酮免疫原是一种人工免疫原。其通过半抗原与载体连接而成。通过将半抗原和载体结合后，作为一个整体具有免疫原性，刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞。其中，半抗原是指本身无免疫原性，只具有反应原性的物质。载体通常情况下为大分子物质。
载体可以是蛋白质类物质，其中以白蛋白最为普遍，这是由于白蛋白具有较高的溶解度，免疫原性强，取材方便。常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白等，以牛血清白蛋白最为常用。
载体还可以是多肽聚合物。多肽聚合物是人工合成的，常见的有多聚赖氨酸，分子量可达十几万到几十万，是良好的载体。多肽聚合物和半抗原结合后，可刺激动物产生高滴度、高亲和力的抗体。多聚赖氨酸可与半抗原的-NH2或-COOH结合。
载体还可以是大分子聚合物。所述的大分子聚合物包括羧甲基纤维素、聚乙烯比咯烷酮等。大分子聚合物皆可与半抗原结合，加入弗氏佐剂可诱导动物产生高效价的抗体。
在选择使用载体时，可以优选考虑如下选择因素：(1)带有正电荷的碱性蛋白往往是好的免疫源；(2)大分子聚合物必须经体内酶解后才能诱发反应，不能被分解者如碱性消旋蛋白，阿拉伯胶、D-氨基酸聚合物等不能用做载体；(3)当半抗原接在载体上引起蛋白质结构发生明显改变时，才能诱发半抗原抗体。小分子物质与蛋白质之间以"桥"(spacebridge)的形式连接。在一些示例中，4个碳(C)的"桥"是最合适的C链；(4)载体免疫源性的强弱与产生半抗原抗体的水平有关；(5)半抗原与载体蛋白的分子比对免疫原性具有影响，较佳地两者的比为10～20∶1。
本发明实施中，载体采用蛋白质类物质，半抗原为前述之醛固酮衍生物。如前所述，通过使半抗原与载体连接形成具有免疫原性的物质(醛固酮免疫原)。
其中，如何使半抗原与载体连接，并对载体(本实施中为蛋白质类物质)的结构发生调整，对获得免疫原的性能具有影响。半抗原与载体连接时，应选择合适的方法，结合方式的选择应考虑如下因素：1)半抗原的溶解度和稳定性：在结合反应中应不会导致半抗原活性的改变，同时也不能使载体变性至不溶解的程度。2)结合键的位置：抗体对远离蛋白质联接点的半抗原部分有最好的特异性，故联接时应使联接键远离半抗原的决定簇。 3)选择适合的偶联试剂：不同的半抗原在偶联时，应根据半抗原的化学结构，以及反应方式选择适当的偶联试剂。如小分子肽类有一定的三级结构，在溶液中依靠氨基酸残基来维持其结构的稳定。因此，用双功能的亚氨酸酯不但对氨基酸有选择，而且能代替被取代的每一个ε-氨基的正电荷。蛋白质与偶联剂接触后，使不同蛋白质分子的功能基团交联并凝聚。广泛交联的蛋白质，其溶解度常降低，而这种溶解度差的蛋白质却是有效的免疫源。
本发明实施例中，使半抗原与载体通过偶联试剂进行连接。偶联试剂可以是选择二异氰酸类物质、或碳化二亚胺类物质、或二卤化二硝基苯类物质、或双重氮化物等。较佳地，以碳化二亚胺类物质为偶联剂，使载体中的氨基与半抗原中的羧基发生偶联反应。其中，碳化二亚胺类物质包括二乙基碳化二亚胺、二苯基碳化二亚胺、二丙基碳化二亚胺、1-乙基-3-(-3- 二甲氨丙基)碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺中的一种或多种。
本发明中，半抗原具有位于端部的游离的羧基，可以与载体更直接地连接。
作为一种可选的示例，(1)将载体蛋白200mg溶解于50ml 0.2M，pH 8.5的磷酸缓冲液中；(2)将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：200mg 权利要求1或2所述的醛固酮衍生物、3.5ml二甲基甲酰胺、3.5ml乙醇、7.0ml 10mM，pH 5.0的磷酸钾缓冲液、200mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基) 碳二亚胺、50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30min；(3)将溶解好的溶液滴加至载体蛋白溶液中，并在2～8℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到醛固酮免疫原。
基于前述的醛固酮免疫原，本发明还提出了一种抗醛固酮特异性抗体。抗醛固酮特异性抗体为前述的醛固酮免疫原免疫动物后产生的抗体分子、或抗体片段、或抗体衍生物。其中，抗体片段和抗体衍生物均保留与醛固酮进行特异性结合能力。本发明中所述的利用醛固酮免疫原免疫动物的方法，可以采用发明人已知的各种免疫手段。
进一步地，抗醛固酮特异性抗体为：采用单一的醛固酮免疫原对动物加强免疫所获得的多克隆抗体。
更进一步地，抗醛固酮特异性抗体为：采用单一的醛固酮免疫原对动物加强免疫后，经动物体细胞杂交获得的单克隆抗体。其中，动物包括兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠、以及马中的任一种。
如，1.对小鼠注射(或者，皮下注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼)抗原蛋白，使小鼠产生免疫反应，进而分离得到B淋巴细胞。2.将小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，再用选择培养基进行筛选。3.在前述的选择培养基(如RPMI-1640、DMEM)上，融合的杂种细胞生长，且具有能迅速大量繁殖又能产生专一的抗体的特点。4.对上述获得的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得能分泌目标抗体的细胞；5.将杂交瘤细胞在体外条件下做大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖，从而可以由细胞培养液或小鼠腹水中，提取出适当量的单克隆抗体。
在一些具体的示例中，采用上述方法制作的抗醛固酮特异性抗体的效价比可达到1:30000～50000。
作为一种可选的示例，上述利用醛固酮免疫原免疫动物后产生的抗体分子、或抗体片段、或抗体衍生物的方法可以通过如下方式实现。
对动物进行注射第一异体溶液，第一异体溶液由经稀释后的醛固酮免疫原与弗氏完全佐剂混合而成。在经过第一预设时间后，以预设的周期对动物进行多次注射第二异体溶液，第二异体溶液由经稀释后的醛固酮免疫原与弗氏不完全佐剂混合而成。在经过以预设的周期对动物多次进行注射第二异体溶液后，对动物进行取血，并提取抗体。第一异体溶液和第二异体溶液中的异体均指的是采用人工合成和提取的物质经过配制得到的溶液，其不是直接来源于动物体本身产生的体液或分泌物。
其中，第一异体溶液由经磷酸盐缓冲液稀释后的醛固酮免疫原与弗氏完全佐剂混合而成。第二异体溶液由经磷酸盐缓冲液稀释后的醛固酮免疫原与弗氏不完全佐剂混合而成。优选地，经磷酸盐缓冲液稀释后的醛固酮免疫原的含量为1.0mg/mL，第一预设时间为2～3周，预设的周期为四周，对动物进行四次注射第二异体溶液。
例如，步骤一、用PBS(磷酸盐缓冲液)将连接有牛血清白蛋白的醛固酮免疫原稀释至1.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用1.0ml抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射。步骤二、2～3周后，再用1.0ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上述实验动物注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射4次；步骤三、对步骤二的实验动物取血，分离纯化。不完全弗氏佐剂是液体石蜡与羊毛脂混合而成，组分比为1～5：1，可根据需要而定，通常为2：1。不完全佐剂中加卡介苗(最终浓度为2～20mg/ml) 或死的结核分枝杆菌，即为完全弗氏佐剂。
本发明所述的佐剂(adjuvant)是指能够增强免疫应答或改变免疫应答类型的物质，应用时可与抗原同时或预先注射于机体。所述的佐剂优选通过如下方式进行选择。所选择的佐剂能够增加抗原的表面积，并改变抗原的活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性。佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间，减低抗原的分解速度，使抗原缓慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴度的抗体。佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并使之增生，从而增强了体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能。佐剂无毒性或副作用低。
本发明还提出了一种醛固酮检测试剂。其可以用于体外特异性地检测醛固酮。醛固酮检测试剂包括指示试剂、前述制备的抗醛固酮特异性抗体。其中，指示试剂包括酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂、发光试剂中的任一种。
较佳地，本发明实施例中，采用酶试剂。采用酶试剂可以实现非放射免疫标记，其以酶标记的半抗原作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合。将酶与半抗原结合成酶标偶联物，此偶联物既保留半抗原的免疫学活性，又保留酶对底物的催化活性。通过在酶标半抗原与抗体的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应或酶催化后辅酶的吸光度变化，对小分子半抗原进行定位、定性或定量的测定分析。采用酶标记免疫分析技术可提高抗体反应的敏感性，且具有敏感、特异、精确、酶标记物的有效期长等优点。
一种可选的示例是，酶试剂由醛固酮酶标偶联物和酶的底物组成。
其中，酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物；酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。
上述的醛固酮检测试剂，其包括被分别独立地提供的第一试剂和第二试剂。在未被使用于检测醛固酮时，第一试剂和第二试剂被分别独立地保存；在检测时，第一试剂和第二试剂以适当的时机和方式被混合，以达到检测目的。
其中，第一试剂包括混合的酶底物、如上述的抗醛固酮特异性抗体；
其中，第二试剂包括混合的醛固酮酶标偶联物、Tris缓冲液，醛固酮酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物。
作为一种更进一步地的说明，前述的醛固酮检测试剂的制备方法包括：
将氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和葡萄糖-6-磷酸溶解于Tris缓冲液中得到均相酶底物，将均相酶底物与抗醛固酮特异性抗体混合得到第一试剂。
将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物溶解于Tris缓冲液中得到第二试剂。
其中，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物通过如下方法制作而成：
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶室温溶解于含三羟甲基氨基甲烷、氯化镁和氯化钠的溶液中，然后在溶液中加入：葡萄糖-6-磷酸、卡必醇以及还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，再滴加二甲基亚砜得到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；
将无水的醛固酮衍生物溶解于二甲基甲酰胺中，并冷却至-2～-8℃；在 -2～-8℃的条件下，加入三丁胺、氯甲酸异丁酯搅拌混合得到激活的醛固酮衍生物溶液，醛固酮衍生物具有如式(Ⅰ)所示的结构式，
将激活的醛固酮衍生物溶液溶解于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中；2-8℃搅拌过夜以得到含有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和醛固酮衍生物反应得到的连接体的粗品。
更进一步而言，前述的醛固酮检测试剂(包括试剂A和试剂B)的制备方法如下：
(1)试剂A由抗醛固酮特异性抗体和均相酶底物混合而成，具体制备步骤如下：
(1.1)将4.036g(11.25mM)氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、 1.711g(11.25mM)葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)用1L 55mM、pH＝8.0的Tris 缓冲液溶解制成均相酶底物。
(1.2)将本发明制备的抗醛固酮特异性抗体加到上述均相酶底物中。抗醛固酮特异性抗体与均相酶底物的体积比为1:100～1:10000。优选地，抗醛固酮特异性抗体与均相酶底物的体积比为1:200，或1:400，或1:600，或 1:800，或1:2000，或1:4000，或1:6000。更优选地，两者的比例为1:625。
(2)试剂B由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与Tris缓冲液混合而成，制备方法如下：
(2.1)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)溶液的制备：
(2.1.1)称取15mg规格为100KU的G6PDH，室温溶解于12mL含有 72.6mg(0.05M)Tris、8mg MgCl2(3.3mM)和100mg NaCl的溶液中，该溶液pH＝9.0。
(2.1.2)加入225mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，135 mg葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)以及0.75mL卡必醇。
(2.1.3)逐滴加入2mL二甲基亚砜。
(2.2)醛固酮衍生物的激活：
(2.2.1)在无水状态下称取10mg本发明合成的醛固酮衍生物，溶解于600μL DMF中。
(2.2.2)使上述溶液温度降到-2～-8℃。
(2.2.3)加入3μL三丁胺。
(2.2.4)加入1.5μL氯甲酸异丁酯。
(2.2.5)-2～-8℃搅拌30分钟。
(2.3)G6PDH与醛固酮衍生物的连接：
(2.3.1)将上述激活的醛固酮衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的 G6PDH溶液中。
(2.3.2)2-8℃搅拌过夜。
(2.4)纯化产物：
(2.4.1)通过G-25凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物，于2-8℃下储存。
(2.5)将制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物加到120mM、 pH＝8.2的Tris缓冲液中，上述醛固酮酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为 1:100～1:10000。所述的醛固酮酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比还可以为 1:300，或1:700，或1:1200，或1:3000，或1:5000，更优选为1:1250。
基于上述的醛固酮检测试剂，本发明还提出了一种试剂盒，用于对生物样本中的醛固酮进行体外检测。所述生物样本包括尿液样本和血液样本，所述尿液样本包括24小时尿和即时尿，所述血液样本包括血清和血浆。
基于上述分析，为了克服现有技术存在的缺陷，发明人采用全新的醛固酮衍生物制备免疫原性强的醛固酮免疫原及其抗体。用前述之抗体制备的醛固酮均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对醛固酮高通量、快速化的检测。检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低醛固酮检测成本，有利于临床推广使用。
以下结合实施例对本发明的醛固酮衍生物、免疫原、特异性抗体和检测试剂及制备方法作进一步的详细描述。
实施例1
1.醛固酮衍生物的合成。
醛固酮衍生物的合成路线如图1所示。
其中，化合物2的合成如下。
10℃条件下，在溶解有30克化合物1(4-氨基丁酸)的2N当量浓度(2mol/L)的氢氧化钠溶液中一次性加入55克催化剂(Cbz-Cl，氯甲酸苄酯)。混合物在室温下搅拌过夜。期间，通过TLC监控反应过程直至反应完全。反应后的混合物利用乙酸乙酯萃取(3x300mL， 3次，每次用量300mL)。水层用1N当量浓度的盐酸调整pH＝3，用二氯甲烷萃取(3x300mL)。合并有机层，用清水(200mL)、盐水 (200mL)洗涤，真空干燥，浓缩得到白色固体的化合物2(33g，产率48.8％)。
其中，化合物3的合成如下。
10℃条件下，在由500mL二氯甲烷溶解33克的化合物2、17克的4-二甲氨基吡啶(DMAP)、41mL的叔丁醇的溶液中一次性加入 87克的二环己基碳二亚胺(DCC)。混合物在室温下搅拌过夜。期间，通过TLC监控反应过程直至反应完全。反应后的溶液经过滤收集滤液。滤液用水稀释后，用1N当量浓度的盐酸调节pH＝3。得到的混合物利用二氯甲烷(3x500mL)萃取，合并有机层，并用水(300mL)、盐水(300mL)洗涤。经过洗涤后，真空干燥、浓缩得到粗品。对粗品进行硅胶柱层析纯化，得到白色固体的化合物3(26g，产率62.4％)
其中，Amine1(其中，Amine指胺)的合成如下。
在由26克的化合物3溶解于250mL的甲醇的溶液中，加入8克钯碳(Pd/C)，得到混合物。以氢气为保护气，使混合物在50℃下搅拌过夜。TLC控制反应进程，直至起始反应物消失，得到的溶液被过滤。滤液经过真空干燥、浓缩得到粗品。粗品通过硅胶柱层析纯化，得到白色固体的Amine1(14g，产率99.2％)。
其中，化合物5的合成如下。
在0℃的条件下，将4.1克的甲磺酰卤(MsCl)滴加入由200mL 的二氯甲烷溶解10克的化合物4、0.34克的4-二甲氨基吡啶、5.6克的三乙基胺(TEA)得到的溶液中制备混合物。混合物在室温下搅拌 1小时。TLC控制反应进程，直至反应完全，然后用50mL的甲醇冷却反应体系，并真空干燥、浓缩得到黄色油状物。用150mL的二甲基甲酰胺(DMF)溶解黄色油状物，并加入1.53克氯化锂(LiCl)，混合物，在60℃下搅拌2小时后将反应物加入水中，过滤收集沉淀，既得白色固体的化合物5(8.5克，产率80.9％)。
其中，化合物6的合成如下。
由15mL二甲基亚砜溶解1克的化合物5和0.68克的N，N-二异丙基乙胺(DIEA)得到溶液，然后，在室温条件下，向溶液中加入0.84克的Amine1。混合物在40℃的条件下搅拌3小时。通过液质联用(LC/MS)监控反应进程，直至反应完全。反应后的溶液用100mL 水骤冷，然后用乙酸乙酯(3x300mL)萃取，并合并有机层。有机相被用水(100mL)、盐水(100mL)洗涤。经过洗涤后，真空干燥、浓缩得到粗品。粗品用硅胶柱层析纯化得到黄色固体的化合物6(0.41克，产率30.8％)。
其中，化合物7的合成如下。
将6.3克的化合物6、2.54克的三乙基胺(TEA)用60mL的二氯甲烷溶解得到溶液。在10℃的条件下，将5.5克的Boc酸酐(Boc2O) 滴加入前述的溶液中。混合物在室温下搅拌1小时。TLC控制反应进程，直至反应完全。反应后的溶液通过真空干燥、浓缩得到粗品。粗品通过硅胶柱层析纯化得到黄色固体的化合物7(6克，产率79.4％)。
醛固酮衍生物的合成如下。
将3.5克的化合物7溶解在6N当量浓度的盐酸/二氧己环(80mL) 的溶液中，在室温下搅拌5小时。通过液质联用(LC/MS)监控反应进程，直至起始反应物消失。反应后的混合物用200mL的甲基叔丁基醚(MTBE)稀释，过滤沉淀得到白色固体的目标化合物(醛固酮衍生物，2.3克，产率82.1％)。
2.醛固酮衍生物(目标化合物)的确认。
利用Bruker Avance III plus 400MHz和VARIAN MERCURY plus 300M对上述白色固体化合物(目标化合物)进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果如下：1H NMR(DMSO_d6，400 MHz):δ0.95(s，3H)，1.30-1.85(m，20H)，2.05-2.08(d，J＝11.6， 2H)，2.32-2.35(t，2H)，2.50(s，2H)，2.80-2.93(m，3H)， 3.56-3.61(d，J＝17.2，1H)，3.61-3.84(t，2H)，4.27-4.28(d，J＝1.6， 1H)，6.07(s，1H)，8.80-8.83(m，1H)。利用色谱/质谱技术(LC/MS) 对得到的醛固酮衍生物进行分析鉴定，MS Calcd.:449；MS Found: 450(M+1)。
通过以上分析测试，确定该最终所得化合物为式(Ⅰ)所示的醛固酮衍生物。
实施例2
醛固酮免疫原的合成。
醛固酮免疫原由牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA) 与式(Ⅰ)所示的醛固酮衍生物的-NH-(CH2)3-CO-基团连接而成。醛固酮免疫原的合成方法具体步骤如下：
1.将牛血清白蛋白200mg溶解于50ml 0.2M，pH 8.5的磷酸缓冲液中。
2.将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：200mg实施例1合成的醛固酮衍生物、3.5ml二甲基甲酰胺、3.5ml乙醇、7.0ml 10mM，pH 5.0的磷酸钾缓冲液、200mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基) 碳二亚胺、50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30min。
3.将溶解好的溶液滴加至BSA溶液中，并在2～8℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到醛固酮免疫原。
实施例3
抗醛固酮特异性抗体的制备.
将实施例2制备得到的醛固酮免疫原采用常规方法接种实验动物兔，加强免疫后取抗血清，具体步骤如下：
1.用PBS将上述合成的醛固酮免疫原稀释至1.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用1.0ml抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔进行注射。
2.2～3周后，再用1.0ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上述实验动物兔注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射4次。
3.对步骤2的实验动物兔取血，分离纯化得到效价为 1:30000-1:50000的抗醛固酮特异性抗体。
实施例4
醛固酮ELISA检验
1.醛固酮ELISA检测标准曲线的建立
(1)标准品的制备
将醛固酮粉末(购于Sigma公司)溶解于甲醇溶液，制备成1 mg/ml的储存液。用ELISA缓冲液将储存液依次稀释为1600.00 pg/mL、800.00pg/mL、400.00pg/mL、200.00pg/mL、100.00pg/mL和 0.00pg/mL的标准溶液。其中，ELISA缓冲液含有50.0mM Tris， 145mMNaCl和0.25％的BSA。
(2)利用醛固酮的ELISA检验方法制备标准曲线
用PBS将实施例3中所制备的抗醛固酮抗体稀释成1:9000的终浓度溶液，100μL/孔包被在96孔酶联板上，4℃放置12-24h；用PBS将上述包被有抗醛固酮抗体的96孔酶联板洗涤3次后，加入 200μL/孔的0.5％的BSA溶液，4℃封闭放置8-16h。然后用PBS 洗涤3次，加入20μL/孔的标准品。再加入100μL/孔工作浓度的 HRP-醛固酮偶联物；室温下孵育30min后PBS洗板5次；然后每孔加入100μL TMB底物，室温孵育30min。再每孔加入100μL 终止液(2M硫酸)。测定450nm的吸光值。根据各标准品所对应的 450nm的吸光值定标，制作标准曲线，结果如附图1所示。
2.待测样品中醛固酮含量的检测
(1)制作待测样品
制备方法：将醛固酮粉末(购于Sigma公司)溶解于甲醇溶液制成1μg/mL的储存液，并将此储存液稀释于空白血浆中，至终浓度分别为0.00，10.00，200.00，1000.00pg/mL，形成空白、低、中、高浓度的血浆样本。该空白血浆为不含醛固酮的健康人血浆。
(2)测试方法
利用上述醛固酮的ELISA检验方法，将上述空白、低、中、高浓度的血浆样本代替标准品，测试上述空白、低、中、高浓度的血浆样本在450nm的吸光值。
(3)测试结果
对照图2中所示的醛固酮ELISA检验的标准曲线，计算每个样本中醛固酮含量，并对每个样本进行3个复孔测定，根据上述样本中醛固酮的实际含量计算回收率，结果如表1所示。
表1醛固酮的ELISA检测回收实验
血清样品 空白 低 中 高
样品浓度(pg/mL) 0.00 10.00 200.00 1000.00
测试1 0.03 10.35 210.83 962.68
测试2 0.01 9.59 202.27 997.52
测试3 0.02 10.11 199.05 1009.00
平均值(pg/mL) 0.02 10.02 204.05 989.73
回收率(％) - 100.20 102.03 98.97
由表1中结果可知：采用本发明醛固酮ELISA检测试剂测定不同浓度样品中的醛固酮回收率都较高，均＞95％，说明本发明所述的抗醛固酮特异性抗体可以用于样本中醛固酮的检测，并且结果准确度高。
实施例5
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的制备。
1.葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)溶液的制备：
(1)准确称取15mg规格为100KU的G6PDH，室温溶解于12mL含有72.6mg(0.05M)Tris、8mg MgCl2(3.3mM)和100mg NaCl的溶液中，该溶液pH＝9.0，本步骤在烧杯C中进行。
(2)在上述烧杯C中加入225mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，135mg葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)以及0.75mL卡必醇(Carbitol)。
(3)在上述烧杯C中再逐滴加入2mL二甲基亚砜(dimethy sulfoxide，DMSO)。
2.醛固酮衍生物的激活：
(1)在无水状态下称取10mg实施例1合成的醛固酮衍生物，溶解于600μL DMF中。
(2)使上述溶液温度降到-2～-8℃。
(3)加入3μL三丁胺(tributylamine)。
(4)加入1.5μL氯甲酸异丁酯(isobutylchloroformate)。
(5)-2～-8℃搅拌30分钟。
3.G6PDH与醛固酮衍生物的连接：
(1)将上述激活的醛固酮衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的 G6PDH溶液中。
(2)2-8℃搅拌过夜。
4.纯化产物：
通过G-25凝胶层析柱纯化步骤3中的溶液，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物，于2-8℃下储存。
实施例6
醛固酮均相酶免疫检测试剂的制备。
1.试剂A的制备：将4.036g(11.25mM)氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、1.711g(11.25mM)葡萄糖-6-磷酸(G-6-P) 置于烧杯D中，用1L 55mM、pH＝8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将上述制备的抗醛固酮特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底物的体积比可以为1:100～1:10000，在本实施例中的比例为1:625。
2.试剂B的制备：将实施例5制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物加到120mM、pH＝8.2的Tris缓冲液中，上述偶联物与Tris 缓冲液的体积比可以为1:100～1:10000，在本实施例中的比例为 1:1250。
实施例7
醛固酮均相酶免疫检验及结果
1.获得标准曲线：
(1)设置迈瑞BS480全自动生化分析仪反应参数(见表2)。
(2)操作步骤为：先加试剂A，再加入标准品，最后加入试剂 B。加入试剂B后，测定不同时间点的OD340吸光值，算出不同标准品浓度时的反应速率，实际操作过程中需不断调整试剂A和试剂B 的体积比例，同时调整测光点，最后得出较理想的反应标准曲线图，如图3所示。
表2迈瑞BS480全自动生化分析仪反应参数
2.样本检测：通过本发明的均相酶免疫检测试剂得到的标准曲线，重复测定低、中、高浓度质控
样本10次，上述质控样本为：将醛固酮标准品溶解于人血浆中，至浓度分别为20.00，250.00，900.00pg/ml。检测数据及数据分析见表3。
表3样品测定及精密度和回收率评估
血液样品 低 中 高
样品浓度(pg/ml) 20.00 250.00 900.00
1 20.93 252.09 900.03
2 20.75 255.17 889.15
3 20.07 250.03 895.26
4 19.56 251.25 887.00
5 21.00 247.00 909.01
6 20.05 249.41 912.34
7 20.90 253.99 890.98
8 19.79 253.24 899.19
9 20.55 246.80 898.07
10 20.81 251.11 901.45
平均值(pg/ml) 20.44 251.01 898.25
标准差(SD) 0.527 2.783 8.164
精密度(CV％) 2.58％ 1.11％ 0.91％
回收率％ 102.20 100.40 99.81
检测结果：本发明的均相酶免疫检测试剂测定的准确度高，回收率达到95％-105％，精密度高，CV均低于3％。
实施例8
药物与激素干扰试验。
选取62种常见药物与30种常见激素及激素代谢物进行干扰检测，调整浓度至1.00μg/ml，采用实施例7的均相酶免疫方法进行测定：
1.将待测干扰物与实施例6制备的试剂A接触反应，再加入试剂B。
2.检测上述混合溶液的OD340吸光值，根据实施例7的标准曲线得到相应物质的浓度。
62种常见药物与30种常见激素及激素代谢物名称以及测定结果具体参见表4。
表4常见干扰物测定结果
测定结果显示：上述62种常见药物与30种常见激素及激素代谢物等价于醛固酮的浓度均小于10.0pg/ml。由此可见，本发明的抗体是抗醛固酮的特异性抗体，与常见干扰物无交叉反应。
实施例9
相关性分析。
对100例临床标本分别使用高效液相色谱法和本发明的均相酶免疫试剂进行相关性分析，测定的数据参见表5。
表5临床样本测定值
对上述数据作图，参见图4，得到的线性方程为：y＝1.0026x+ 1.1236，相关系数R2＝0.9994，表明本发明的检测试剂测定醛固酮临床标本的准确度高。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (11)

1.一种醛固酮衍生物，其特征在于，所述醛固酮衍生物的结构如式(Ⅰ)所示，
2.一种如权利要求1所述的醛固酮衍生物的合成方法，其特征在于，包括：
使醛固酮的羧羟基发生卤代反应得到卤化物；
以所述卤化物为底物，与4-氨基丁酸叔丁酯发生伯胺卤代反应得到含有仲胺基团的中间产物；
对所述中间产物中的仲胺基团进行保护后，在酸性条件下发生酯基水解反应；
其中，在使醛固酮的羧羟基发生卤代反应中，卤代反应使用的卤化试剂为氯化锂和甲磺酰卤；
其中，在对所述中间产物中的仲胺基团进行保护时，采用Boc酸酐作为保护剂。
3.一种醛固酮免疫原，其结构式如式(Ⅱ)所示，
其中，-NH-(CH2)3-CO-为连接基团；X是载体，且为具有免疫原性的蛋白质或多肽；
所述具有免疫原性的蛋白质包括血清蛋白、血蓝蛋白、以及甲状腺球蛋白中的任一种。
4.根据权利要求3所述的醛固酮免疫原，其特征在于，所述具有免疫原性的蛋白质为牛血清白蛋白。
5.一种如权利要求3或4所述的醛固酮免疫原的合成方法，其特征在于，包括：
使半抗原与所述载体连接，所述半抗原具有如式(Ⅰ)所示的结构式，
使所述半抗原与所述载体连接的方法包括：
以碳化二亚胺类物质为偶联剂，使所述载体中的氨基与所述半抗原中的羧基发生偶联反应，所述碳化二亚胺类物质包括二乙基碳化二亚胺、二苯基碳化二亚胺、二丙基碳化二亚胺、1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺中的一种或多种；
使所述载体中的氨基与所述半抗原中的羧基发生偶联反应的方法包括：提供由所述载体分散于磷酸缓冲液中得到的载体溶液；提供由所述半抗原分散于二甲基甲酰胺、乙醇、磷酸钾缓冲液、1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺混合而成的半抗原混合液；将所述半抗原混合液滴加至所述载体溶液中，在2～8℃下搅拌过夜，纯化。
6.一种抗醛固酮特异性抗体，其特征在于，所述抗醛固酮特异性抗体为采用如权利要求3或4所述的醛固酮免疫原免疫动物后产生的抗体分子、或抗体片段、或抗体衍生物，所述抗体片段和抗体衍生物均保留与醛固酮进行特异性结合能力。
7.根据权利要求6所述的抗醛固酮特异性抗体，其特征在于，所述抗体分子、抗体片段、抗体衍生物均为：采用单一的醛固酮免疫原对动物加强免疫所获得的多克隆抗体；
或者，所述抗体分子、抗体片段、抗体衍生物均为：采用单一的醛固酮免疫原对动物加强免疫后，经所述动物体细胞杂交获得的单克隆抗体，其中，所述动物包括兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠、以及马中的任一种。
8.一种如权利要求5或6或7所述的抗醛固酮特异性抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
对动物进行注射第一异体溶液，所述第一异体溶液由经稀释后的所述醛固酮免疫原与弗氏完全佐剂混合而成；
在经过第一预设时间后，以预设的周期对所述动物进行多次注射第二异体溶液，所述第二异体溶液由经稀释后的所述醛固酮免疫原与弗氏不完全佐剂混合而成；
在经过以预设的周期对所述动物多次进行注射第二异体溶液后，对所述动物进行取血，并提取抗体；
其中，所述第一异体溶液由经磷酸盐缓冲液稀释后的所述醛固酮免疫原与弗氏完全佐剂混合而成；
所述第二异体溶液由经磷酸盐缓冲液稀释后的所述醛固酮免疫原与弗氏不完全佐剂混合而成；
经磷酸盐缓冲液稀释后的所述醛固酮免疫原的含量为1.0mg/mL，所述第一预设时间为2～3周，所述预设的周期为四周，对所述动物进行四次注射第二异体溶液。
9.一种醛固酮检测试剂，其特征在于，所述醛固酮检测试剂包括指示试剂、如权利要求5或6或7所述的抗醛固酮特异性抗体；
所述指示试剂包括酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂、发光试剂中的任一种；
所述酶试剂由醛固酮酶标偶联物和酶的底物组成，其中，所述酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物，所述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。
10.一种如权利要求9所述的醛固酮检测试剂的制备方法，其特征在于，包括分别独立地提供第一试剂和第二试剂，
将氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和葡萄糖-6-磷酸溶解于Tris缓冲液中得到均相酶底物，将所述均相酶底物与所述抗醛固酮特异性抗体混合得到所述第一试剂；
将所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物溶解于Tris缓冲液中得到所述第二试剂；
其中，所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物通过如下方法制作而成：
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶室温溶解于含三羟甲基氨基甲烷、氯化镁和氯化钠的溶液中，然后在溶液中加入：葡萄糖-6-磷酸、卡必醇以及还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，再滴加二甲基亚砜得到葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；
将无水的醛固酮衍生物溶解于二甲基甲酰胺中、并冷却至-2～-8℃；在-2～-8℃的条件下，加入三丁胺、氯甲酸异丁酯搅拌混合得到激活的醛固酮衍生物溶液，所述醛固酮衍生物具有如式(Ⅰ)所示的结构式，
将所述激活的醛固酮衍生物溶液溶解于所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中；2-8℃搅拌过夜以得到含有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和醛固酮衍生物反应得到的偶联物的粗品。
11.一种试剂盒，用于对生物样本中的醛固酮进行体外检测，其特征在于，所述试剂盒含有如权利要求9所述的醛固酮检测试剂，所述生物样本包括尿液样本和血液样本，所述尿液样本包括24小时尿和即时尿，所述血液样本包括血清和血浆。
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