背景技术
苯环利定(pHencycliding,PCP)为一种对中枢神经系统有抑制、兴奋、镇痛和致幻作用的精神活性药物,化学名为1-(1-苯基环己烷)哌啶,其结构式为:
PCP是一种解离性药物,曾被麻醉师当作麻醉剂使用,具有迷幻和毒害神经的效应。它常常被称为天使粉,常导致定向障碍、激越和谵妄构成的急性综合征。虽然PCP的初步对神经的作用只持续几个小时,但完全从体内血浆排除会延长,经常会延续数周。PCP对神经系统有潜在的作用,会改变感知功能(幻觉,错觉,谵妄或精神混乱)、运动功能(步态蹒跚,无协调性,眼球运动混乱或眼球震颤)和植物神经系统调节(心率过快,温度调节改变)。PCP会以一种无法预测的方式改变人的情绪状态,导致一些人人格分离,而另一些人则变得生气勃勃,精力旺盛。目前已被国家和国际禁毒公约列入麻醉药品的规范中进行严格管制。
目前,对苯环利定的检测主要依靠高效液相色谱法(HPLC),气相色谱(GC),薄层色谱(TLC),质谱(MS)等,但是存在仪器昂贵,检测费时,并且需要专业技术人员进行操作,不能达到现代检测对快速,准确的要求。而免疫分析法可以弥补以上所有缺点,免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法, 该方法的前提就是需要提供特异性的抗原和抗体。因此有必要提供一种有效的苯环利定人工抗原的制备方法,制备的苯环利定人工抗原可用于免疫制备具有特异性的苯环利定抗体,进一步用于检测。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足,提供一种苯环利定人工抗原的制备方法,所制备的苯环利定人工抗原可进行动物免疫,取得相应的苯环利定抗体,可用于各种苯环利定类免疫分析法的研究,为苯环利定的检测提供更加方便快速准确的途径。
一种苯环利定人工抗原的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1) 制备人工半抗原:
(a) 将1-苯基环己醇与叠氮钠、三氟乙酸以摩尔比为1:2:5.7溶于氯仿中,室温搅拌反应5小时;反应结束后用浓氨水调至碱性,有机相经双蒸水和饱和食盐水溶液洗涤后,减压蒸馏得到含叠氮基化合物
;TLC:层析液为正己烷:乙酸乙酯=4:1,产物R
f =0.7~0.8;
(b) 将含叠氮基化合物
与氢化铝锂以摩尔比为1:1.5溶于无水乙醚中, 冰浴反应1小时后,再室温搅拌反应5小时;反应结束后加入双蒸水和氢氧化钠水溶液,氯仿萃取,有机相减压蒸馏后经薄层层析法纯化得到产物
1-苯基环己胺;TLC:层析液为石油醚:乙酸乙酯=2:1,产物R
f =0.2~0.3;
(c) 将产物
1-苯基环己胺与戊二酸酐以摩尔比为1:1.2溶于无水吡啶中,100℃反应5小时;反应结束后进行减压蒸馏, 得到的粗产物经薄层层析法纯化得到苯环利定半抗原
;TLC:层析液为为95%乙醇,产物R
f =0.5~0.6;
(2) 制备苯环利定人工抗原:
(d) 将半抗原
与N-羟基琥珀酰亚胺、环己基碳酰二亚胺以摩尔比为1:1.5:1.5溶于N,N-二甲基甲酰胺中,室温搅拌反应18小时,反应结束后离心取上清液记为A液;
(e) 将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78.3:4.2:1溶于双蒸水中,制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液,pH为7.2~7.4;
(f) 将牛血清蛋白溶于PBS缓冲液中,得到浓度为20mg/ml的B液;
(g) 将A液缓慢滴加到B液,A液与B液的体积比为1:5,得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜,得到人工抗原混合液;
(h) 将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析,透析结束后离心取上清液即得到人工抗原:苯环利定-牛血清蛋白。
由于苯环利定的分子量较小,单独作用时不具有免疫原性或免疫原性较弱,因此必须将其与大分子载体比如牛血清蛋白连接形成苯环利定抗原后,才能刺激机体产生相应的苯环利定抗体。本发明在制备苯环利定人工抗原过程中,所选的位点和交联方法都没有明显改变其结构,保留了抗原决定簇。在苯环利定半抗原和牛血清蛋白之间引入桥结构,暴露抗原决定簇,所获得的苯环利定人工抗原保持了苯环利定的结构特异性,有利于相应苯环利定抗体的产生。
本发明的技术方案分为两步,,第一步为半抗原的制备及检测:以1-苯基环己醇为原料,利用叠氮钠引入叠氮基,再利用氢化铝锂还原叠氮基制得1-苯基环己胺,然后和戊二酸酐反应得到含羧基的半抗原;第二步为人工抗原的制备与检测:通过碳二亚胺法使之与牛血清蛋白(BSA)结合制备苯环利定人工抗原即苯环利定-牛血清蛋白。其反应过程为:
本发明制备得到的苯环利定人工抗原可通过以下方法进行鉴定:
偶联比测定:估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法虽然很多,但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与小分子偶联物中,两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱,并表现出光谱迭加的性质。
摩尔吸收系数ε:配制苯环利定半抗原浓度为0, 5, 10, 20, 30, 40ug/ml的PBS溶液,通过紫外扫面图可知苯环利定半抗原的最大吸收波长为278nm,在278nm处测吸光值,每个浓度做平行样。摩尔吸光系数计算为ε=吸光值/摩尔浓度。本发明计算得ε=6412.24L/mol
偶联物蛋白浓度的测定:配制浓度为0, 40, 60, 80, 100, 120,160, 200ug/ml的牛血清蛋白PBS溶液1ml,加入3ml考马斯亮蓝染色液,立即混匀,30℃水浴温热5分钟,每个浓度做平行样,在655nm处测吸光值,绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例吸收,在655nm处测得抗原的吸光值,从曲线上得到抗原溶液的相应蛋白浓度值。本发明计算得苯环利定抗原的蛋白浓度为8.772mg/ml。
偶联比测定:配制100ug/ml的牛血清蛋白PBS溶液,将偶联物用PBS稀释到100ug/ml,在277nm处测得吸光值,以PBS为空白,测得吸光值A1, A2,则偶联比率γ为:γ=[(A1-A2)/ε]/(100×10-3/65000),本发明计算得γ≈15。
其中ε为摩尔吸光系数(L/mol),65000为牛血清蛋白的分子量,100×10-3 为牛血清蛋白浓度(ug/ml)。
本发明的有益效果:本发明合成了苯环利定的人工抗原,合成工艺先进,特异性强,得到的苯环利定人工抗原用于免疫新西兰白兔,检测结果表明,苯环利定人工抗原的免疫血清的效价为1:60000,完全可用于免疫分析中,为苯环利定的检测提供更加方便快速准确的途径。
具体实施方式
苯环利定人工抗原制备分为两步,第一步为半抗原的制备及检测:以1-苯基环己醇为原料,利用叠氮钠引入叠氮基,再利用氢化铝锂还原叠氮基制得1-苯基环己胺,然后和戊二酸酐反应得到含羧基的半抗原;第二步为人工抗原的制备与检测:通过碳二亚胺法使之与牛血清蛋白(BSA)结合制备苯环利定人工抗原即苯环利定-牛血清蛋白。
实施例1
(1) 人工半抗原的制备:
(a) 称取2.024g(11.5mmol)1-苯基环己醇于100ml三颈圆底烧瓶中,加入40ml氯仿,室温下搅拌至固体完全溶解;另称取1.740g(23mmol)叠氮钠加入到上述反应液中,用冰浴冷却到0℃左右,开始缓慢加入5ml三氟乙酸,加毕后撤去冰浴,室温搅拌反应5小时。反应结束后用浓氨水调pH=9左右,静置分层后,有机相用双蒸水和饱和氯化钠水溶液洗涤,取有机层进行减压蒸馏得到2.023g(10mmol)含叠氮基化合物。TLC:层析液为正己烷:乙酸乙酯=4:1,产物Rf =0.7~0.8。
(b) 称取0.570g氢化铝锂粉末于100ml三颈圆底烧瓶中,用冰浴冷却到0℃左右,加入50ml无水乙醚搅拌;含叠氮基化合物
溶于7.5ml无水乙醚,缓慢加入到上述反应液,加毕后撤去冰浴,室温搅拌反应5小时。反应结束后用冰浴冷却到10℃左右,缓慢加入475ul水,反应平稳后再缓慢加入0.95ml1N氢氧化钠水溶液,然后用硅藻土过滤,滤液用15%稀盐酸萃取,水相再用氯仿萃取,取有机层进行减压蒸馏得到粗产物,薄层层析法纯化得到700mg(4mmol)1-苯基环己胺
。TLC:层析液为石油醚:乙酸乙酯=2:1,产物R
f =0.1~0.3。
(c) 称取200mg(1.14mmol)1-苯基环己胺
于50ml三颈圆底烧瓶中,加入20ml无水吡啶,再加入156mg(1.368mmol)戊二酸酐搅拌溶解,反应温度逐渐提高至100℃反应5小时。反应结束后自然冷却,进行减压蒸馏得到粗产物,薄层层析法纯化得到330mg(1.11mmol) 苯环利定半抗原
。TLC:层析液为二氯甲烷:95%乙醇:浓氨水:1,4-二氧六环=10:8:1:1,产物R
f=0.5~0.6。图1是苯环利定人工半抗原的液相色谱图。图2是苯环利定人工半抗原的质谱图。
(2) 苯环利定人工抗原的制备:
(d) 称取330mg(1.11mmol) 半抗原
于50ml圆底烧瓶中,加入16.5mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF),再加入191mg(1.665mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 和343mg(1.665mmol)环己基碳酰二亚胺(DCC) ,室温搅拌反应过夜,反应结束离心取上清液记为A液。
(e) 称取14.5g十二水磷酸氢二钠,43.875g氯化钠,1.495g二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L,得到PBS缓冲液,pH为7.2~7.4。
(f) 称取1.65g牛血清蛋白溶于82.5mlPBS缓冲液中,得到的溶液记为B液。
(g) 在快速搅拌下,将A液缓慢滴加到B液,A液与B液的体积比为1:5,得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜,既得到人工抗原混合液。
(h) 将人工抗原混合液移入透析袋中,用上述PBS缓冲液透析9次,透析结束后离心取上清液即得到人工抗原:苯环利定-牛血清蛋白。图3是苯环利定人工抗原制备前后的紫外扫描图。
(3) 苯环利定人工抗原的鉴定:
偶联比测定:估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法虽然很多,但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与小分子偶联物中,两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱,并表现出光谱迭加的性质。
摩尔吸收系数ε:配制苯环利定半抗原浓度为0, 5, 10, 20, 30, 40ug/ml的PBS溶液,通过紫外扫面图可知苯环利定半抗原的最大吸收波长为278nm,在278nm处测吸光值,每个浓度做平行样。摩尔吸光系数计算为ε=吸光值/摩尔浓度。计算得ε=6412.24L/mol
偶联物蛋白浓度的测定:配制浓度为0, 40, 60, 80, 100, 120, 160, 200ug/ml的牛血清蛋白PBS溶液1ml,加入3ml考马斯亮蓝染色液,立即混匀,30℃水浴温热5分钟,每个浓度做平行样,在655nm处测吸光值,绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例吸收,在655nm处测得抗原的吸光值,从曲线上得到抗原溶液的相应蛋白浓度值。计算得苯环利定抗原的蛋白浓度为8.772mg/ml。
偶联比测定:配制100ug/ml的牛血清蛋白PBS溶液,将偶联物用PBS稀释到100ug/ml,在277nm处测得吸光值,以PBS为空白,测得吸光值A1, A2,则偶联比率γ为:γ=[(A1-A2)/ε]/(100×10-3/65000),计算得γ≈15。
其中ε为摩尔吸光系数(L/mol),65000为牛血清蛋白的分子量,100×10-3 为牛血清蛋白浓度(ug/ml)。