CN107759663B - 一种鉴别尼罗罗非鱼皮胶原蛋白的方法 - Google Patents

一种鉴别尼罗罗非鱼皮胶原蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种使用专属性肽段组鉴别尼罗罗非鱼鱼皮胶原蛋白的方法，其中肽段组包含有序列为SEQ ID NO:1‑10的多肽。本发明通过对胶原蛋白进行前处理，进行液相色谱‑串联质谱检测分析，得到酶解后肽段的序列。通过与数据库中尼罗罗非鱼皮胶原蛋白氨基酸序列比对，证明本方法能够识别出其中的绝大部分肽段序列。多次实验结果表明，SEQ ID NO.1～10肽段序列存在于尼罗罗非鱼皮胶原蛋白中。因此，本发明得到了尼罗罗非鱼皮胶原蛋白的专属性肽段组，解决了以往胶原蛋白来源难以鉴别的问题。

Description

一种鉴别尼罗罗非鱼皮胶原蛋白的方法
技术领域
本发明属于蛋白分析技术领域，具体涉及一种鉴别尼罗罗非鱼皮胶原蛋白的方法。
背景技术
胶原蛋白以不溶性纤维形式存在多细胞动物体的皮肤、骨骼、血管中，它具有生物相容性、生物降解性、低抗原性，其提取制品已广泛应用于医药、保健、食品加工、化妆品等众多领域。长期以来，胶原蛋白主要从一些陆生哺乳动物如牛、猪等的皮肤中提取。近年来，人们逐渐将关注点转移到鱼类胶原蛋白的研究上来。鱼皮是水产品副产物中胶原蛋白含量比较多的部位，以Ⅰ型胶原为主，可以作为一种安全的美容和医用生物材料。
不同来源的鱼皮胶原蛋白相比较，有的热稳定性好、机械强度高，有的生物相容性好，抗原性低，有的含有多种活性肽段，如抗光老化活性，增加骨密度活性，降血压活性等，使得应用方向各有差异。因此对相关产品的区分和鉴别就显得十分重要。
尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)是我国的主要养殖经济品种，从其皮肤里提取的胶原蛋白具有较好的生物安全性，较高的热稳定性，是医用材料原料的良好来源，与其他来源的水产胶原蛋白具有较大差异。
目前由于采用传统的电泳、氨基酸分析、红外光谱以及X-射线衍射等分析方法都无法区别不同来源的胶原蛋白，对相关产品的快速检测缺乏技术水平的支持，导致不少不良商人以次充好，欺骗消费者，因此需要一种高效准确的鉴定不同来源胶原蛋白的方法。
发明内容
本发明对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)鱼皮胶原蛋白进行了研究，建立了从多肽水平对尼罗罗非鱼皮胶原蛋白来源进行鉴别的技术，从而有效的弥补现有技术的不足。
本发明首先提供用于检测尼罗罗非鱼皮胶原蛋白的多肽组合，包含有如下序列的多肽：
SEQ ID NO.1:GEPGDNGAK、
SEQ ID NO.2:GEPGHSGPQGPPGPQGEEGK、
SEQ ID NO.3:GLAGDPGIQGVK、
SEQ ID NO.4:GPPGPDGNNGATGATGVAGGPGEK、
SEQ ID NO.5:EGPAGPSGQDGR、
SEQ ID NO.6:GEPGPAGIQGLPGPSGEEGK、
SEQ ID NO.7:QGPSGPSGER、
SEQ ID NO.8:GEAGAPGVQGPPGPPGEEGK、
SEQ ID NO.9:GESGDSGPK、
SEQ ID NO.10:GSAGSDGAPGAPGIPGPQGIAGQR；
上述的肽段组用于检测尼罗罗非鱼皮胶原蛋白；
本发明还涉及一种鉴别鱼皮胶原蛋白来源的方法，包括如下步骤：
1)取待检测的冻干胶原蛋白用0.05～0.25mol/L的醋酸溶解制成浓度为2～4mg/mL的溶液，
优选采用超声波辅助溶解法，频率25～40KHz，时间5～10min；
2)将胶原蛋白溶液与0.05～0.25mol/L NH4HCO3溶液按照体积比1:1的比例混合均匀，在50～55℃条件下处理2～3h，然后12000×g离心10～20min，去掉不溶性胶原；
3)取100～500μL离心后的上清液，加入胰蛋白酶溶液，在37℃下酶解反应15～22h；
4)酶解液采用0.22μm的微孔滤膜过滤后进行微量层析柱脱盐浓缩，然后进行液相色谱-串联质谱联用分析；
5)液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测分析，分析条件如下：
流动相A：0.1％甲酸-乙腈，流动相B：0.1％甲酸-水；
流速：0.3mL/min；
进样量：20μL；
TOF扫描范围：350-1500Da；
正离子反应模式；
将待测样本的质谱结果对比SEQ ID NO.1～10的各条特异性多肽的序列，同时出现上述任意4条及以上的特异性多肽序列时，即可判定该样本为尼罗罗非鱼皮胶原蛋白。
本发明通过对胶原蛋白进行前处理，进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测分析，得到酶解后肽段的序列。通过与数据库中尼罗罗非鱼皮胶原蛋白氨基酸序列比对，证明本方法能够识别出其中的绝大部分肽段序列。多次实验结果表明，SEQ ID NO.1～10肽段序列存在于尼罗罗非鱼皮胶原蛋白中。因此，本发明得到了尼罗罗非鱼皮胶原蛋白的专属性肽段组，解决了以往胶原蛋白来源难以鉴别的问题。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1尼罗罗非鱼皮胶原蛋白的专属性肽段组的获得
1)取提取纯化后的尼罗罗非鱼皮胶原蛋白用0.25mol/L的醋酸溶解，浓度为4mg/mL，并采用超声波辅助溶解法，频率25～40KHz，时间10min；
2)将胶原蛋白溶液与0.25mol/L NH4HCO3溶液按照体积比1:1的比例混合均匀，在50℃条件下处理3h，然后12000×g离心20min，去掉不溶性胶原；
3)取100μL离心后的上清液，加入1mg/mL的胰蛋白酶溶液(酶：底物＝1:25，w/w)，在37℃下酶解反应20h；
4)酶解液采用0.22μm的微孔滤膜过滤后用Zip
Figure BDA0001455324650000041
微量层析柱脱盐浓缩，待进行液相色谱-串联质谱联用分析；
5)液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测分析，分析条件如下：
流动相A：0.1％甲酸-乙腈，流动相B：0.1％甲酸-水；
洗脱条件：梯度洗脱，0～39min(乙腈:5％～80％)-42min(乙腈:80％)-42.5min(乙腈:80％～5％)-46min(乙腈:5％)；
流速：0.3mL/min；
进样量：20μL；
TOF扫描范围：350-1500Da；
正离子反应模式。
将质谱采集得到的wiff图谱文件采用AB SCIEX公司的ProteinPilotTM Software5.0.1软件进行数据的处理和分析，选用uniprot的胶原蛋白数据库(uniport‐COLLAGEN.fasta)进行数据的检索。ProteinPilot软件参数设置如下：搜库方法：Paragonmethod；消化：Trypsin；仪器：TripleTOF 5600；物种：None；ID Focus：Amino acidSubtitutions，Biological modifications；Search Effort：Thorough ID；检测蛋白质阈值(Unused Protscore(conf))：>0.05％(10.0％)；提交错误发现率(False Discoveryrate analysis，FDR)分析报告。筛选得到的多肽必须在每次实验结果分析中都出现，且置信区间在95％，将筛选得到的多肽序列使用BLAST‐NCBI进行序列比对。SEQ ID NO.1～10的各条肽段存在于尼罗罗非鱼皮胶原蛋白中，且其它来源胶原蛋白中不会存在其中的任意4条及以上的肽段，因此，这10条肽段组成了尼罗罗非鱼皮胶原蛋白的专属性肽段组。
实施例2尼罗罗非鱼皮鱼皮胶原蛋白的检测分析
1)取3份尼罗罗非鱼鱼皮胶原蛋白分别进行实验，取冻干胶原蛋白用0.01mol/L的醋酸溶解，浓度为4mg/mL，并采用超声波辅助溶解法，频率25～40KHz，时间5min；
2)将胶原蛋白溶液与0.1mol/L NH4HCO3溶液按照体积比1:1的比例混合均匀，在50℃条件下处理2～3h，然后12000×g离心10～20min，去掉不溶性胶原；
3)取100～500μL离心后的上清液，加入1mg/mL的胰蛋白酶溶液(酶：底物＝1:50，w/w)，在37℃下酶解反应18h；
4)酶解液采用0.22μm的微孔滤膜过滤后用Zip
Figure BDA0001455324650000051
微量层析柱脱盐浓缩，待进行液相色谱-串联质谱联用分析；
5)液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测分析，分析条件如下：
流动相A：0.1％甲酸-乙腈，流动相B：0.1％甲酸-水；
洗脱条件：梯度洗脱，0～39min(乙腈:5％～80％)-42min(乙腈:80％)-42.5min(乙腈:80％～5％)-46min(乙腈:5％)；
流速：0.3mL/min；
进样量：20μL；
TOF扫描范围：350-1500Da；
正离子反应模式。
将3份尼罗罗非鱼鱼皮胶原蛋白检测分析得到的多肽序列与SEQ ID NO.1～10中的各条特异性多肽的序列进行对比，都出现了上述特异性肽段组的多肽序列，经验证这10条多肽序列可用于太平洋鳕鱼皮胶原蛋白的判定。
实施例3鳕鱼皮胶原蛋白的检测分析
1)取冻干鳕鱼皮胶原蛋白用0.05mol/L的醋酸溶解，浓度为2mg/mL，并采用超声波辅助溶解法，频率25～40KHz，时间5min；
2)将胶原溶液与0.05mol/L NH4HCO3溶液按照体积比1:1的比例混合均匀，在50℃条件下处理3h，然后12000×g离心10min，去掉不溶性胶原；
3)取100μL离心后的上清液，加入1mg/mL的胰蛋白酶溶液(酶：底物＝1:25，w/w)，在37℃下酶解反应16h；
4)酶解液采用0.22μm的微孔滤膜过滤后用Zip
Figure BDA0001455324650000061
微量层析柱脱盐浓缩，待进行液相色谱-串联质谱联用分析；
5)液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测分析，分析条件如下：
流动相A：0.1％甲酸-乙腈，流动相B：0.1％甲酸-水；
洗脱条件：梯度洗脱，0～39min(乙腈:5％～80％)-42min(乙腈:80％)-42.5min(乙腈:80％～5％)-46min(乙腈:5％)；
流速：0.3mL/min；
进样量：20μL；
TOF扫描范围：350-1500Da；
正离子反应模式。
将分析得到的多肽序列与SEQ ID NO.1～10中的各条特异性多肽的序列进行对比，并未出现上述的肽段组的多肽序列，从而判定该样本不是尼罗罗非鱼皮来源胶原蛋白。
上述结果表明序列为SEQ ID NO.1～10的各条肽段能够有效的判定尼罗罗非鱼鱼皮胶原蛋白，而不会产生假阳性或假阴性。
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> 一种鉴别尼罗罗非鱼皮胶原蛋白的方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 1
<400> 1
Gly Glu Pro Gly Asp Asn Gly Ala Lys
1 5
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 2
<400> 2
Gly Glu Pro Gly His Ser Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly
1 5 10 15
Glu Glu Gly Lys
20
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 3
<400> 3
Gly Leu Ala Gly Asp Pro Gly Ile Gln Gly Val Lys
1 5 10
<210> 4
<211> 24
<212> PRT
<213> 4
<400> 4
Gly Pro Pro Gly Pro Asp Gly Asn Asn Gly Ala Thr Gly Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val Ala Gly Gly Pro Gly Glu Lys
20
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 5
<400> 5
Glu Gly Pro Ala Gly Pro Ser Gly Gln Asp Gly Arg
1 5 10
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> 6
<400> 6
Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly Ile Gln Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly
1 5 10 15
Glu Glu Gly Lys
20
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 7
<400> 7
Gln Gly Pro Ser Gly Pro Ser Gly Glu Arg
1 5 10
<210> 8
<211> 20
<212> PRT
<213> 8
<400> 8
Gly Glu Ala Gly Ala Pro Gly Val Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Glu Glu Gly Lys
20
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 9
<400> 9
Gly Glu Ser Gly Asp Ser Gly Pro Lys
1 5
<210> 10
<211> 24
<212> PRT
<213> 10
<400> 10
Gly Ser Ala Gly Ser Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ile Pro Gly
1 5 10 15
Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg
20

Claims (4)

1.一种用于检测尼罗罗非鱼皮胶原蛋白的多肽组合，其特征在于，所述的组合包含有氨基酸序列为SEQ ID NO:1-10中的任意四种或以上的多肽。
2.一种鉴别鱼皮胶原蛋白来源的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的多肽组合来检测鱼皮胶原蛋白是否为尼罗罗非鱼皮胶原蛋白。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)取待检测的冻干胶原蛋白用0.05～0.25mol/L的醋酸溶解制成浓度为2～4mg/mL的溶液，
2)将胶原蛋白溶液与0.05～0.25mol/L NH4HCO3溶液按照体积比1:1的比例混合均匀，在50～55℃条件下处理2～3h，然后12000×g离心10～20min，去掉不溶性胶原；
3)取100～500μL离心后的上清液，加入胰蛋白酶溶液，在37℃下酶解反应15～22h；
4)酶解液采用0.22μm的微孔滤膜过滤后进行微量层析柱脱盐浓缩，然后进行液相色谱-串联质谱联用分析；
5)液相色谱-串联质谱检测分析，分析条件如下：
流动相A：0.1％甲酸-乙腈，流动相B：0.1％甲酸-水；
流速：0.3mL/min；
进样量：20μL；
TOF扫描范围：350-1500Da；
正离子反应模式；
将待测样本的质谱结果对比SEQ ID NO.1～10的各条特异性多肽的序列，同时出现上述任意4条及以上的特异性多肽序列时，即可判定该样本为尼罗罗非鱼皮胶原蛋白。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中的采用超声波辅助溶解，频率25～40KHz，时间5～10min。
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