CN110865129A - 一种度拉鲁肽中多种修饰水平的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于酿脓链球菌的免疫球蛋白G降解酶(IdeS)酶切的度拉鲁肽中多种修饰水平的分析方法。该方法样品制备过程非常简便,在蛋白天然结构的基础上进行酶切,对酶切产物进行还原后即可进行分析。后续所需的样品分析时间很短,仅需20min甚至更短的时间即可完成1个样品的分析,可用于大批量工艺优化样品的修饰分析以及原研品与仿制药各种修饰的对比分析。此外,酶切后的样品主要包含N‑端GLP‑1结构域肽段、C‑端的Fc/2肽段及未酶切的完整肽链,样品组成非常简单,样品中若存在修饰组分则非常容易在UV谱图或者质谱图中被发现,大大降低了修饰肽段被发现的难度。
Description
技术领域
本发明涉及一种度拉鲁肽中多种修饰水平的检测方法,属于生物技术领域。
背景技术
糖尿病是胰岛素功能缺陷引起的以血糖升高为特征的代谢疾病,患者的血糖浓度如果长期得不到有效控制,可伴发眼睛、心脏和血管等组织或器官的损害,导致残疾甚至死亡,严重威胁到患者的健康和生命。近年来,随着生活水平的提高以及饮食结构及生活方式的改变,全球糖尿病发病率迅速增加,糖尿病现已成为继肿瘤、心血管病变之后的第三大严重威胁人类健康的慢性疾病。中国目前约有1.1亿糖尿病患者,约占中国成年人总数的1/10,糖尿病现状已非常严峻。
糖尿病可分为I型与II型这两类,I型糖尿病主要特点为患者体内无法生成足够的胰岛素,至今病因还不明确,患者需要每天注射胰岛素进行治疗;II型糖尿病患者约占糖尿病患者总数的90%,是身体无法有效利用胰岛素引起的,典型特征是胰岛β细胞功能受损、胰岛素耐受和高血糖素症导致的高血糖,患者需控制饮食及使用降糖药物进行治疗。胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)是肠道L细胞分泌的肠源性激素,可通过与GLP-1受体结合,促进β细胞葡萄糖依赖性分泌胰岛素和抑制餐后α细胞胰高血糖素的释放,促使血糖浓度达到稳态。大量研究表明GLP-1具有降血糖和促进胰岛素分泌的功能,但GLP-1在体内很快会被二肽基肽酶4(Dipeptidyl peptidase IV,DDP-IV)降解而失去活性,半衰期仅为1~2min,因此长效GLP-1受体激动剂是II型糖尿病新药的研发热点。
度拉鲁肽(Dulaglutide,商品名Trulicity)是礼来公司研发的一款长效GLP-1受体激动剂降糖药物,通过将GLP-1类似物多肽序列与人源IgG4Fc段融合表达而成,在人体的半衰期可达90小时,每周仅需给药1次,大大增加了患者用药的依从性。多项针对II型糖尿病的III期头对头临床试验结果表明,每周给药1次的度拉鲁肽非劣效于每天1次的利拉鲁肽,它势必将成为利拉鲁肽的强有力的竞争对手,估计年销售额可达20亿美元。度拉鲁肽序列在中国的专利授权将在2024年到期,必将掀起多家公司开发该药品的生物仿制药的热潮。
相比小分子化学药物,蛋白类生物药物结构复杂,它们在细胞/菌体内被表达后通常会进行各种翻译后修饰(Post-translational modifications,PTMs)。生物仿制药不仅要做到氨基酸序列与原研药相同,其翻译后修饰水平也要做到与原研药尽量相似。在度拉鲁肽中除了常见的糖基化、氧化和脱酰胺修饰外,还存在一些在蛋白生物药中不常见的修饰类型,如磷酸化修饰、羟化修饰、甲醛修饰和乙醛修饰等,在研发过程中,需要测定大量工艺优化相关样品的修饰水平,指导上游工艺部门进行克隆筛选、细胞培养和纯化工艺的优化,将这些修饰的水平尽量控制到与原研药接近,这就迫切需要有一种可以快速检测样品中多种翻译后修饰的方法。
肽质量指纹图谱分析是比较常规的测定蛋白药物PTMs的分析方法,样品需首先用尿素/盐酸胍等变性剂处理,并用二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)将蛋白中的二硫键打开,利用碘乙酸(IAA)或碘乙酰胺(IAM)进行烷基化处理后用特异性的蛋白酶(如胰蛋白酶、Lys-C蛋白酶和糜蛋白酶等)将蛋白酶解成肽段,再用反相超高效液相色谱-串联质谱进行分析,通过各修饰肽段的分子量和二级质谱碎片信息对修饰的类型及位点进行确认。该方法样品处理步骤比较复杂(需经过变性、还原、烷基化和酶切等步骤),所需的液相色谱或质谱分析时间较长(通常分析1个样品需要1-2小时),不适合大批量样品分析。
此外,肽质量指纹图谱分析通常将蛋白酶切成含10-30个氨基酸残基的肽段混合物,酶切后的样品肽段组成非常复杂,而翻译后修饰肽段由于含量通常较低,在肽质量指纹图谱分析的TIC图谱上很难被发现,增加了修饰肽段被发现的难度。此外,肽质量指纹图谱分析中修饰位点的鉴定通常需借助相关的数据处理软件,如Mascot(Matrix Science)、Proteinpilot(SCIEX)和Proteome Discoverer(Thermo Fisher Scientific)等,得到的质谱数据需先经这些软件自动处理,检索到可能发生修饰的位点,然后再经人工验证去除假阳性。在进行软件的参数设置时,通常需要首先指定样品中可能发生的修饰类型,如果样品中存在一些不常见的修饰,在进行软件参数设置时这些修饰就可能被遗漏,因而这些修饰类型则必然不会被检索到。
发明内容
本发明针对现有技术的不足,提供了一种基于酿脓链球菌的免疫球蛋白G降解酶(Immunoglobulin G-degrading enzyme of Streptococcus pyogenes,IdeS)酶切的度拉鲁肽中多种修饰水平的分析方法。该方法样品制备过程非常简便,在蛋白天然结构(无需变性、还原和烷基化处理)的基础上进行酶切,对酶切产物进行还原后即可进行分析。后续所需的样品分析时间很短,仅需20min甚至更短的时间即可完成1个样品的分析,可用于大批量工艺优化样品的修饰分析以及原研品与仿制药各种修饰的对比分析。此外,由于每条链上仅包含1个IdeS酶切位点,酶切后的样品主要包含N-端GLP-1结构域肽段、C-端的Fc/2肽段及未酶切的完整肽链,样品组成非常简单,样品中若存在修饰组分则非常容易在UV谱图或者质谱图中被发现,大大降低了修饰肽段被发现的难度。
IdeS能酶切人IgG1-IgG4这4种亚型单克隆抗体及人源抗体Fc融合蛋白。对于IgG1、IgG3和IgG4这3种亚型,IdeS能识别铰链区附近的“-LLGG-”序列,并在两个甘氨酸之间切开;对于IgG2亚型,IdeS能识别铰链区附近的“-PVAG-”,并在丙氨酸与甘氨酸之间切开。目前可检索到的已授权发明专利“抗体的稳定性实验”(专利授权公告号:CN101903401B)中也涉及IdeS酶切方法,该专利中的IdeS酶切方法为普通单克隆抗体酶切方法,并不一定适用于经过改造的抗体分子以及Fc融合蛋白。该专利侧重点在于将IdeS酶切方法应用于在生产、贮存和强制降解过程中产生的抗体降解片段及翻译后修饰分析,如氧化、脱酰胺、硫醚键和截短(抗体片段形成),由于抗体分子比较大(约150kDa),且每条重链的Fc段上各有一个N-糖基化位点,上面连接着多种不同结构的N-糖链,具有很强的结构不均一性,不利于样品分析。为了改善IdeS酶切的样品的分析结果,该专利在对抗体进行IdeS酶切后采用了肽N-糖苷酶F(PNGase F)对N-糖链进行切除。
度拉鲁肽是GLP-1类似物多肽与人源IgG4Fc段的融合蛋白,其Fc段序列中包含了IdeS的酶切位点。为了进一步降低抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)及补体依赖的细胞毒作用(CDC)等效应子功能活性,度拉鲁肽Fc段的234位及235位(按抗体氨基酸残基EU编码系统进行编号)的亮氨酸被突变成丙氨酸(专利授权公告号:CN1802386B)。第235位的亮氨酸紧邻IdeS酶切位点(酶切位点两侧的甘氨酸分别为第236位和237位),它对于IdeS的活性至关重要,突变成其他氨基酸会明显降低IdeS蛋白酶的酶切活性(Novarra et al.,mAbs.8(6):1118-1125(2016)),由此推测,普通单抗的IdeS酶切条件(每微克单抗加入1Unit IdeS,于37℃酶切0.5h-1.0h)不一定适于度拉鲁肽。因此,本发明首先对度拉鲁肽的IdeS酶切条件,包括底物浓度、酶切时间及酶量等进行了优化,并采用优化后的IdeS方法对样品进行酶切,进而对该蛋白中的丝氨酸磷酸化修饰、赖氨酸羟化修饰、葡萄糖基半乳糖羟赖氨酸修饰、甲醛修饰和乙醛修饰等进行分析,常规的脱酰胺修饰和氧化修饰等并不是本发明专利关注的重点。由于这些关注的修饰位点均位于N-端GLP-1结构域肽段上,Fc段的N-糖基化修饰对分析结果无影响,因此本专利在样品制备过程中未进行PNGase F酶切N-糖处理,进一步简化了样品前处理步骤。
发明概述
本发明采用IdeS蛋白酶对度拉鲁肽进行酶切,该蛋白酶能识别度拉鲁肽铰链区下方的-AAGG-序列,并在两个甘氨酸之间切开,将每条链酶切成两条肽段,即包含GLP-1及连接肽段的N-端GLP-1结构域肽段(该肽段中包含磷酸化修饰、羟化修饰、甲醛修饰和乙醛修饰等多种修饰的位点)和C-端的Fc/2肽段(酶切样品处理过程示意图如图1所示),样品经巯基还原试剂还原后,用C4等反相色谱柱或二联苯基柱等将GLP-1结构域肽段和Fc/2肽段分开,然后分别进行质谱分析,通过GLP-1结构域肽段的修饰肽段和未修饰肽段(以下称原生肽段)的UV峰面积或提取离子流色谱图(XIC)峰面积,能对该肽段上的多种修饰比例进行计算。
发明详述
一种基于IdeS酶切的度拉鲁肽中多种修饰水平的分析方法,步骤如下:
(1)在待测度拉鲁肽样品中加入酶切缓冲液,混匀后加入IdeS蛋白酶进行酶切;
(2)酶切完毕后加入巯基还原试剂对样品中的二硫键进行还原;
(3)采用液相色谱法或液相色谱串联质谱法对样品进行分析。
优选地,所述步骤(1)中酶切体系中度拉鲁肽的终浓度为0.02μg/μL-5μg/μL。
优选地,所述步骤(1)中酶切缓冲液为50mM磷酸盐+150mM NaCl(pH6.6)等适于IdeS酶切的缓冲盐溶液。
优选地,所述步骤(1)中IdeS酶量为1μg度拉鲁肽加入0.1Unit-10Unit。
优选地,所述步骤(1)中IdeS的酶切温度为20℃-45℃,酶切时间为10min-24h。
优选地,所述步骤(2)中巯基还原试剂为二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP),终浓度为5mM-500mM,处理温度为20℃-50℃,处理时间为5min-5h。
优选地,所述步骤(3)中所采用的液相色谱柱为C3-C8反相色谱柱或二联苯基柱,检测器为UV/DAD检测器。
优选地,所述步骤(3)中所使用的串联质谱为Waters公司的ESI-Q-TOF,关键质谱参数设定如下:采用正离子模式进行采集;毛细管电压:+2.5kV;锥孔电压:60V;离子源温度:120℃;去溶剂气温度:400℃;锥孔气流速:50L/h;去溶剂气流速:800L/h;所得数据采用UNIFI 1.8工作站进行处理。
有益效果
本发明可以简单快速地测定度拉鲁肽样品中多种修饰的水平,解决了常用蛋白药物翻译后修饰方法样品处理繁琐及耗费机时较长的不足,对于加快度拉鲁肽生物仿制药物的研发速度、保障生物药物的安全性及有效性具有较大的实用价值。
附图说明
图1度拉鲁肽IdeS酶切样品处理方法示意图;
图2度拉鲁肽终浓度为0.5μg/μL时每微克蛋白加入1Unit IdeS酶切不同时间样品的HPLC-UV图;
图3度拉鲁肽终浓度为0.5μg/μL时每微克蛋白加入2Unit IdeS酶切不同时间样品的HPLC-UV图;
图4度拉鲁肽终浓度为1.0μg/μL时每微克蛋白加入2Unit IdeS酶切2.0h样品的HPLC-UV图;
图5度拉鲁肽IdeS酶切样品HPLC-UV典型图谱;
图6度拉鲁肽GLP-1结构域肽段的原生肽段和各种修饰肽段的XIC图;
图7度拉鲁肽GLP-1结构域肽段的原生肽段和各种修饰肽段的一级质谱图;
图8磷酸化修饰(+80Da)所在修饰肽段及原生肽段的XIC图及二级质谱图;
图9羟化修饰(+16Da)所在修饰肽段及原生肽段的XIC图及二级质谱图;
图10葡萄糖基半乳糖羟赖氨酸修饰(+340Da)所在修饰肽段XIC图及二级质谱图;
图11甲醛(+12Da)和乙醛(+26Da)修饰所在修饰肽段及原生肽段的XIC图及修饰肽段的二级质谱图;
图12+70Da和+149Da修饰所在修饰肽段及原生肽段的XIC图及二级质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明,这些实施例不应作为本发明的限制。
在实施例中如未注明具体条件的实验方法,均按照常规条件或者生产商所建议的操作方法进行操作。
实施例1:度拉鲁肽IdeS酶切方法的优化
本实施例对度拉鲁肽IdeS酶切的底物浓度、酶切时间和酶量等条件进行了优化,具体操作方法如下:
1.采用色谱级纯水将度拉鲁肽样品稀释至1.5μg/μL,取4份10μL稀释后的样品,各加入20μL 50mM磷酸盐+150mM NaCl(pH6.6)缓冲液混匀(度拉鲁肽终浓度为0.5μg/μL),然后各加入15Unit IdeS,分别于37℃酶切0.5h、1.0h、1.5h和酶切过夜;
2.采用色谱级纯水将度拉鲁肽样品稀释至1.5μg/μL,取3份10μL稀释后的样品,各加入20μL 50mM磷酸盐+150mM NaCl(pH6.6)缓冲液混匀(度拉鲁肽终浓度为0.5μg/μL),然后各加入30Unit IdeS,分别于37℃酶切2.0h、4.0h和6.0h;
3.采用色谱级纯水将度拉鲁肽样品稀释至3.0μg/μL,取10μL稀释后的样品,加入20μL50mM磷酸盐+150mM NaCl(pH6.6)缓冲液混匀(度拉鲁肽终浓度为1.0μg/μL),然后加入60Unit IdeS,于37℃酶切2.0h;
4.酶切结束后,在步骤1-3的样品中各加入终浓度为10mM的TCEP,于37℃孵育15min,12000rpm离心10min后取上清上样分析;
5.对样品进行HPLC-UV分析,所采用的色谱条件和质谱条件如下:
色谱条件:
6.当酶切体系中度拉鲁肽终浓度为0.5μg/μL时,按每微克蛋白加入1Unit IdeS进行酶切,随着酶切时间的延长底物浓度逐渐降低,但过夜酶切仍不能将度拉鲁肽酶切完全,不同酶切时间样品的UV谱图如图2所示。
7.当酶切体系中度拉鲁肽终浓度为0.5μg/μL时,将IdeS酶量加倍(每微克蛋白加入2Unit IdeS),发现酶切效果未见明显改善,不同酶切时间样品的UV谱图如图3所示。
8.当酶切体系中度拉鲁肽终浓度增加至1.0μg/μL时,按每微克蛋白加入2UnitIdeS进行酶切,发现增加酶切体系中的底物浓度,酶切效果未见明显改善,酶切样品的UV谱图如图4所示。
9.综合6-8的分析结果发现,度拉鲁肽终浓度为0.5μg/μL时按每微克蛋白加入1Unit IdeS酶切过夜是较佳的酶切条件,后续IdeS酶切均采用该条件进行酶切。虽然经优化后的IdeS酶切条件仍然不能将样品酶切完全,但对样品分析无影响。
实施例2:采用HPLC-MS/MS分析度拉鲁肽IdeS酶切样品
本实施例的目的是采用HPLC-MS/MS分析方法对待测样品IdeS酶切肽段进行各种修饰分析,具体操作方法如下:
1.采用色谱级纯水将待测样品稀释至1.5μg/μL,取10μL稀释后的样品,分别加入20μL50mM磷酸盐+150mM NaCl(pH6.6)缓冲液混匀,然后各加入15Unit IdeS,于37℃酶切过夜;
2.酶切结束后,在样品中加入终浓度为10mM的TCEP,于37℃孵育15min,12000rpm离心10min后取上清上样分析;
3.采用Waters公司Xevo G2-XS QTof串联高分辨质谱对样品进行分析,所采用的色谱条件和质谱条件如下:
色谱条件:
质谱条件:
4.由于酶切样品肽段组成比较简单,主要包含N-端GLP-1结构域肽段、C-端的Fc/2肽段及未酶切的完整肽链组分,如样品中存在修饰,能很容易在UV谱图及质谱数据中观察到有新的组分出现。度拉鲁肽IdeS酶切样品的UV图谱示例图如图5所示,除GLP-1结构域肽段、C-端的Fc/2肽段及未酶切的完整肽链组分的3个主要的色谱峰外,还能在GLP-1结构域肽段附近检测到多个响应相对较低的组分,经质谱分析发现这些组分分别为GLP-1结构域肽段的各种修饰肽段,信息如表1所示,各组分的质谱图如图6所示。
表1GLP-1结构域肽段中鉴定到的主要修饰肽段的信息
注:灰色背景加下划线的氨基酸残基为可能的修饰位点。
5.在各待测样品的质谱数据中提取表中所列各组分的XIC图,由于肽段分子量较大,在目标离子的一系列同位素峰中单同位素峰响应相对较弱,为了提高检测的灵敏度,选取第4个同位素峰的m/z进行提取,各组分的XIC示意图如图7所示。
测试组样品中各种修饰肽段及原生肽段所占比例如表2所示。
表2样品中各种修饰肽段及原生肽段的相对含量
对比例1:胰蛋白酶肽质量指纹图谱分析与IdeS酶切分析结果对比
本对比例的目的是对度拉鲁肽待测样品进行常规胰蛋白酶肽质量指纹图谱分析,对比IdeS酶切分析与常规肽质量指纹图谱分析在修饰鉴定方面的差异,具体操作方法如下:
1.取样品约20μg,加入终浓度为6.0M尿素及10mM TCEP,于37℃孵育60min进行变性及还原处理;然后加入终浓度为20mM IAM,于37℃避光孵育15min进行烷基化;孵育结束后采用50mM NH4HCO3将体系中尿素终浓度稀释至1.0M,并按20:1质量比加入胰蛋白酶进行过夜酶切。
2.样品酶切结束后加入终浓度为1%FA进行终止,经12000rpm离心5min后取上清进行LC-MS/MS分析。
3.所采用的色谱条件和质谱条件如下:
色谱条件:
采用Triple TOF 5600+串联高分辨质谱对样品进行分析,质谱参数设置如下:
4.采用Matrix Science公司的Mascot软件(Version 2.4.0)对质谱数据进行分析,检索样品中可能存在的修饰类型及修饰位点,关键参数设置如下:
参数 | 设置值 |
蛋白酶 | Trypsin |
最大漏切位点数 | 2 |
一级质谱误差范围 | 50ppm |
二级质谱误差范围 | 0.2Da |
仪器类型 | ESI-QUAD-TOF |
固定修饰类型 | Carbamidomethyl(C) |
可变修饰类型 | Oxidation(M)、Deamidation(N/Q) |
由于仅设置了常见的甲硫氨酸氧化及天冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺修饰这两种可变修饰类型,因此经Mascot搜库只检索到了这两种修饰类型,具体如表3所示。
表3Mascot检索到的翻译后修饰肽段及修饰位点
从表3中可见,经胰蛋白酶肽质量指纹图谱分析及Mascot搜库仅从度拉鲁肽样品中检索到了位于Fc段的3个甲硫氨酸氧化修饰位点和4个天冬酰胺脱酰胺修饰位点,由于单抗及Fc融合蛋白的甲硫氨酸氧化及天冬酰胺脱酰胺修饰已经研究的比较透彻,其产生机制、分析方法等已有多篇文献报道(Pan et al.,Protein Sci.18(2):424-433(2009);Liuet al.,Biologicals.37(5):313-322(2009);Pace et al.,J Pharm Sci.102(6):1712-1723(2013)),因此这两种修饰不是本专利关注的重点。
5.IdeS酶切分析及胰蛋白酶肽质量指纹图谱分析样品处理过程及分析结果对比如表4所示。
表4IdeS酶切分析及胰蛋白酶肽质量指纹图谱分析对比
从表4可见,IdeS酶切样品处理过程简便(不需要对蛋白进行变性及烷基化处理),样品分析时间短(仅需20min即可完成样品分析),而且采用IdeS酶切分析能很容易检测到多种通过胰蛋白酶肽谱图分析未鉴定到的修饰类型。
对比例2:胰蛋白酶肽质量指纹图谱分析数据深度处理
采用IdeS酶切分析在度拉鲁肽样品中检测到了磷酸化、羟化等多种修饰肽段存在,而采用常规的胰蛋白酶肽谱图分析及Mascot搜库处理并未搜索到这些修饰。经胰蛋白酶酶切后的肽段样品中理论上应包含所有的未修饰肽段及各种修饰肽段,其中有些较短的肽段由于在色谱柱上没有保留,直接从色谱柱上穿出不会被质谱检测到;另外有一些含量极低的修饰肽段由于低于质谱的检测限也不会被质谱检测到;其它的未修饰肽段及修饰肽段应该都能被质谱检测到。
由于在进行胰蛋白酶肽质量指纹图谱分析时,度拉鲁肽样品经胰蛋白酶酶切后会产生非常多的肽段,样品比较复杂,TIC谱图中通常会有几十色谱峰出现。肽质量指纹图谱分析的数据量巨大,通常需借助Mascot等软件进行数据分析,而在进行Mascot数据处理时要设置可能发生的修饰类型,然后软件则只会检索样品中是否存在设置的修饰类型,包含其他修饰类型的肽段即使能被质谱检测到,也不会被软件搜索到,被软件选择性的“忽略”。
根据上述推论,IdeS酶切分析中鉴定到的修饰其对应的修饰肽段应该也能在肽质量指纹图谱分析中被质谱检测到。因此本实施例的主要目的是对对比例1中的肽质量指纹图谱分析的质谱数据进行深度处理:通过提取IdeS酶切修饰分析中鉴定到的各种修饰所对应修饰肽段的XIC,根据是否有目标离子被提取到,并进一步对目标离子的二级质谱图进行人工验证,确定该修饰在样品中是否存在。采用该方法,IdeS酶切修饰分析中鉴定到的所有修饰类型在胰蛋白酶肽质量指纹图谱分析的质谱数据中均能提取到,并且均有二级质谱图进行确认(二级质谱图分别见图8-图12),具体如表5所示。
表5肽质量指纹图谱分析质谱数据中提取到的各种修饰肽段的信息
注:“*”表示修饰位点未通过二级质谱确认到具体的氨基酸残基。
本对比例的分析结果表明IdeS酶切修饰分析的结果与胰蛋白酶肽质量指纹图谱分析的结果一致,但IdeS酶切分析操作简单,样品分析时间短,并且更容易发现新的修饰类型。
Claims (9)
1.一种基于IdeS酶切的度拉鲁肽中多种修饰水平的分析方法,其特征在于,步骤如下:
(1)在待测度拉鲁肽样品中加入酶切缓冲液形成缓冲体系,混匀后加入IdeS蛋白酶进行酶切;
(2)酶切完毕后加入巯基还原试剂对样品中的二硫键进行还原;
(3)采用液相色谱法或液相色谱串联质谱法对样品进行分析。
2.如权利要求1所述的分析方法,其特征在于,所述步骤(1)的缓冲体系中度拉鲁肽的终浓度为0.02μg/μL-5μg/μL。
3.如权利要求1所述的分析方法,其特征在于,所述步骤(1)的酶切缓冲液为50mM磷酸盐+150mM NaCl,pH6.6或其他适合IdeS酶切的缓冲盐溶液。
4.如权利要求1所述的分析方法,其特征在于,所述步骤(1)中IdeS酶量为1μg度拉鲁肽加入0.1Unit-10Unit。
5.如权利要求1所述的分析方法,其特征在于,所述步骤(1)中IdeS的酶切温度为20℃-45℃,酶切时间为10min-24h。
6.如权利要求1所述的分析方法,其特征在于,所述步骤(2)的巯基还原试剂为二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP),终浓度为5mM-500mM,处理温度为20℃-50℃,处理时间为5min-5h。
7.如权利要求1所述的分析方法,其特征在于,所述步骤(3)中液相色谱法所采用的液相色谱柱为C3-C8反相色谱柱或二联苯基柱,检测器为UV/DAD检测器。
8.如权利要求1所述的分析方法,其特征在于,所述步骤(3)中液相色谱串联质谱法所使用的串联质谱为Waters公司的ESI-Q-TOF,关键质谱参数设定如下:采用正离子模式进行采集;毛细管电压:+2.5kV;锥孔电压:60V;离子源温度:120℃;去溶剂气温度:400℃;锥孔气流速:50L/h;去溶剂气流速:800L/h;所得数据采用UNIFI 1.8工作站进行处理。
9.如权利要求1所述的分析方法,其特征在于,所述的多种修饰包括:丝氨酸磷酸化、赖氨酸羟化、葡萄糖基半乳糖羟赖氨酸修饰、甲醛修饰和乙醛修饰。
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111323472A (zh) * | 2020-03-16 | 2020-06-23 | 上海中科新生命生物科技有限公司 | 一种基于sp3酶解的单克隆抗体生物医药结构分析方法 |
CN114395597A (zh) * | 2021-12-17 | 2022-04-26 | 佛山汉腾生物科技有限公司 | Glp-1或其变体的羟基化检测方法 |
WO2022143515A1 (zh) * | 2020-12-29 | 2022-07-07 | 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 | 一种人glp-1多肽变体及其应用 |
WO2022143516A1 (zh) * | 2020-12-29 | 2022-07-07 | 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 | 一种人glp-1多肽变体及其应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102308216A (zh) * | 2009-02-09 | 2012-01-04 | 罗切格利卡特公司 | 免疫球蛋白糖基化模式分析 |
CN103217489A (zh) * | 2013-01-15 | 2013-07-24 | 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 | 一种测定蛋白纯化工艺过程中样品的糖基化和末端修饰情况的方法 |
-
2018
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102308216A (zh) * | 2009-02-09 | 2012-01-04 | 罗切格利卡特公司 | 免疫球蛋白糖基化模式分析 |
CN103217489A (zh) * | 2013-01-15 | 2013-07-24 | 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 | 一种测定蛋白纯化工艺过程中样品的糖基化和末端修饰情况的方法 |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
GUILLERMO UMPIERREZ 等: "Efficacy and Safety of Dulaglutide Monotherapy VersusMetformin in Type 2 Diabetes in a Randomized Controlled Trial (AWARD-3)", 《DIABETES CARE》 * |
IZABELA SOKOLOWSKA 等: "Subunit mass analysis for monitoring antibody oxidation", 《MABS》 * |
YAN AN 等: "A new tool for monoclonal antibody analysis Application of IdeS proteolysis in IgG domain-specific characterization", 《MABS》 * |
唐欣 等: "糖尿病药物治疗研究进展", 《现代医药卫生》 * |
许静 等: "半胱氨酸蛋白酶IdeS的原核表达、纯化及活性鉴定", 《中国生物工程杂志》 * |
陈培幸 等: "2 型糖尿病治疗新药__度拉糖肽研究进展", 《现代医药卫生》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111323472A (zh) * | 2020-03-16 | 2020-06-23 | 上海中科新生命生物科技有限公司 | 一种基于sp3酶解的单克隆抗体生物医药结构分析方法 |
WO2022143515A1 (zh) * | 2020-12-29 | 2022-07-07 | 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 | 一种人glp-1多肽变体及其应用 |
WO2022143516A1 (zh) * | 2020-12-29 | 2022-07-07 | 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 | 一种人glp-1多肽变体及其应用 |
CN114395597A (zh) * | 2021-12-17 | 2022-04-26 | 佛山汉腾生物科技有限公司 | Glp-1或其变体的羟基化检测方法 |
CN114395597B (zh) * | 2021-12-17 | 2024-04-09 | 佛山汉腾生物科技有限公司 | Glp-1或其变体的羟基化检测方法 |
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