CN111458396B - 一种蛋白的电荷异质性检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛋白的电荷异质性检测方法，即将蛋白进行酶切、片段分离、变性还原和去糖基化修饰等特殊的蛋白前处理后，采用cIEF、iCIEF等等电聚焦电泳进行检测，得到的电荷异构体的分离效果好，能够对蛋白的电荷异质性进行定性及定量分析，尤其适用于对具有复杂电荷异质性的蛋白进行电荷异质性检测。

Description

一种蛋白的电荷异质性检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛋白的电荷异质性检测方法。
背景技术
蛋白类药物是一类通过细胞表达的生物技术药物，包括单克隆抗体、重组蛋白、融合蛋白等，这类药物被用于癌症、自身免疫性疾病及其他疾病的治疗。这类药物中的蛋白常呈现微观不均一性，即“异质性”，包括电荷、疏水、形态等相关的异构体。其中，由于蛋白分子所带电荷差异造成的异质性称为电荷异构体，产生原因主要与翻译后修饰有关，可能来自于蛋白分子复杂的生物合成途径，如细胞系及培养工艺等。
蛋白的电荷异质性可能对蛋白类药物的稳定性、药效、免疫原性或药代动力学具有重要影响，是蛋白类药物的关键质量属性(CQA)。例如，基因泰克公司曾对上市抗体及临床前抗体药物关于电荷变化产生的药效、药代等方面的影响做过一个总结，结果表明：①当电荷变异超过一个pH单位时，会影响药物的组织分布及药代动力学；②增加正电荷，会提高药物的组织停滞，降低血液清除；③降低正电荷，会减少药物的组织停滞，提高药物的全身清除。此外，蛋白的电荷异质性还可反映蛋白药物生产工艺的稳定性。综上，蛋白的电荷异质性检测在蛋白药物的质量控制中十分重要。
为了实现蛋白的电荷异质性检测，人们通常将蛋白直接或进行简单脱盐处理后，与载体两性电解质、pI Marker等溶液混合，通过等电聚焦电泳(IEF)、毛细管等电聚焦电泳(cIEF)和全柱成像毛细管等电聚焦电泳(iCIEF)等方法进行检测。但常规的检测方法通常只能实现蛋白电荷异质性的定性分析，不能满足其定量分析要求。对于具有电荷异质性较为复杂的蛋白，常规的检测方法不能满足蛋白电荷异质性的定性和/或定量分析要求。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种蛋白的电荷异质性检测方法，用于蛋白的电荷异质性的定性及定量检测。本发明提供如下技术方案：
一种蛋白的电荷异质性检测方法，包括以下步骤：
采用蛋白酶对待测蛋白进行酶切，分离酶切片段，对分离后的酶切片段进行变性还原和去糖基化修饰处理后，采用等电聚集电泳进行电荷异质性检测；优选地，所述蛋白具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
本发明所述蛋白的电荷异质性检测方法中，所述蛋白酶选自木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、IdeZ蛋白酶或重组化脓性链球菌IgG降解酶，优选为重组化脓性链球菌IgG降解酶。
本发明所述的分离酶切片段为采用亲和树脂分离方法进行，所述亲和树脂为常规的蛋白A树脂、蛋白G树脂，具体如本发明中例举的GE Healthcare的MabSelectTM树脂。本发明所述的分离酶切片段也可以采用其他常用的蛋白分离方法进行，例如利用不同酶切片段的分子量大小差异、分子结构差异、溶解度差异、对某些配体(如蛋白A，蛋白G)的亲和力差异等进行分离，只要能够将酶切片段有效分离即可。
本发明所述“变性还原”处理指通过加入变性剂(如盐酸胍、尿素、表面活性剂等)和还原剂(如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇等)，使蛋白质中的二硫键被破坏，且使蛋白质失去其天然存在的四级结构、三级结构或二级结构。在某些实施例中，上述的变性还原处理包括如下操作：向酶切片段中加入盐酸胍和二硫苏糖醇，在50℃下进行变性还原。在某些实施例中，上述的变性还原处理包括如下操作：向酶切片段中加入表面活性剂和二硫苏糖醇，在95℃下进行变性还原。
本发明所述“去糖基化修饰”处理是指采用适当方法对蛋白中的糖基化修饰进行去除的处理；优选地，所述去糖基化修饰是指除去蛋白中的N-糖基化修饰；具体为采用去糖基化酶对酶切片段进行酶切处理，如N-糖酰胺酶F。
优选地，本发明所述蛋白的电荷异质性检测方法中，进行变性还原处理和去糖基化修饰处理的酶切片段为不含免疫球蛋白Fc区的酶切片段。所述“免疫球蛋白Fc区”是Fc全长或部分Fc序列，选自CH2片段，CH3片段，铰合区域片段。
本发明所述蛋白的电荷异质性检测方法中，所述等电聚焦电泳方法优选为毛细管等电聚焦电泳；所述等电聚焦电泳步骤中使用6mol/L的尿素为助溶剂，采用的载体两性电解质的pH值范围为3～10。
本发明提供的蛋白电荷异质性检测方法，具有分离效果好，检测灵敏度高，重复性好等优点，能够对蛋白电荷异质性进行准确的定性及定量分析，有利于产业上对蛋白药物的质量控制。
附图说明
图1为对比组1.1中cIEF检测结果；
图2为对比组1.1中iCIEF检测结果；
图3为对比组1.2中cIEF检测结果；
图4为对比组1.3中cIEF检测结果；
图5为对比组1.4中cIEF检测结果；
图6为对比组1.5中cIEF检测结果；
图7为对比组1.6中cIEF检测结果；
图8为对比例2中cIEF检测结果；
图9为对比例3中cIEF检测结果；
图10为实施例1中cIEF检测结果；
图11为实施例2中cIEF检测结果；
图12为实施例3中cIEF检测结果；
图13为实施例4中Fc段的cIEF检测结果；
图14为实施例4中非Fc段的cIEF检测结果；
其中，pI9.5表示pI＝9.5的Marker峰；pI7.0表示pI＝7.0的Marker峰；pI5.5表示pI＝5.5的Marker峰；pI4.1表示pI＝4.1的Marker峰。
具体实施方式
现通过以下实施例对本发明作进一步阐释。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要求书的范围内。
实施例中涉及的部分物料及仪器情况如下：
Figure BDA0001949507860000031
Figure BDA0001949507860000041
对比例1：蛋白酶切处理方法对比
方法：对蛋白采用不同的酶切处理，电泳检测蛋白的电荷异质性。该对比例中待检测的蛋白具有SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列。
对比组1.1：蛋白不经过任何酶切处理，进行cIEF和iCIEF检测
将待检测的蛋白不经过酶切处理，与6M cIEF胶(含摩尔浓度为6mol/L尿素的cIEF胶)、载体两性电解质(pH3～10)、阴极稳定液(300mM NaOH)、阳极稳定液(200mM磷酸)以及等电点标准蛋白(pI值分别为：5.5，7.0和9.5)进行混合处理后，进行cIEF检测。cIEF的分离条件为：聚焦电压25KV、聚焦时间15min、分离电压30KV、分离时间30min；检测波长：280nm。cIEF检测结果如图1所示。
同时，将待检测蛋白不经过酶切处理，与甲基纤维素溶液(质量浓度0.5％)、载体两性电解质(pH2～9)以及等电点标准蛋白(pI值分别为：5.12和8.71)进行混合处理后，采用分辨率更高的iCIEF进行电荷异质性检测。icIEF的分离条件为：聚焦电压1KV、聚焦时间1min；聚焦电压2KV、聚焦时间1min；聚焦电压3KV、聚焦时间7min；检测波长：280nm。检测结果见图2。
由图1和图2看出：对待检测蛋白不经过任何酶切处理即进行cIEF或iCIEF检测，iCIEF谱图中峰形优于cIEF谱图，但两个谱图中的峰形边界均不清晰，蛋白中各电荷异构体未得到很好分离，不能实现蛋白电荷异构体的定性及定量分析的目的。
对比组1.2：蛋白经过不同的切唾液酸处理后，分别进行cIEF检测，检测结果见图3。具体的检测方法分别为：
(1)向待测蛋白样品中加入唾液酸酶(如α2-3,6,8Neuraminidase)及其酶切缓冲液(NEB公司推荐的1xGlyco Buffer)，在37℃下酶切过夜进行切唾液酸处理，然后与6McIEF胶(含摩尔浓度为6mol/L尿素的cIEF胶)、载体两性电解质(pH3～10)、阴极稳定液(300mM NaOH)、阳极稳定液(200mM磷酸)以及等电点标准蛋白(pI值分别为：5.5，7.0和9.5)进行混合处理后，进行cIEF检测(cIEF的分离条件为：聚焦电压25KV、聚焦时间15min、分离电压30KV、分离时间30min；检测波长：280nm)。检测得到的谱图结果如图3中“D1.2.4”标记所示。
(2)向待测蛋白样品中加入1M DTT，在37℃条件下反应1h进行还原处理，再加入1MIAA(碘乙酰胺)，室温反应30min进行封闭处理；然后采用如上述检测方法(1)中所述的切唾液酸处理、混合处理及cIEF检测。检测得到的谱图结果如图3中“D1.2.3”标记所示。
(3)向待测蛋白样品中加入7M盐酸胍和1M DTT，在50℃条件下反应50min进行变性还原处理，再加入1M IAA(碘乙酰胺)，室温反应30min进行封闭处理；然后采用如上述检测方法(1)中所述的切唾液酸处理、混合处理及cIEF检测。检测得到的谱图结果如图3中“D1.2.2”标记所示。
(4)向待测蛋白样品中加入表面活性剂(0.2％的RapiGest SF)和1M DTT，在95℃条件下反应10min进行变性还原处理，再加入1M IAA(碘乙酰胺)，室温反应30min进行封闭处理；然后采用如上述检测方法(1)中所述的切唾液酸处理、混合处理及cIEF检测。检测得到的谱图结果如图3中“D1.2.1”标记所示。
由图3看出：将蛋白样品分别采用对比组1.2中(1)-(4)的切唾液酸前处理后，检测得到的谱图中目的峰辨识准确度低(目的峰的出峰时间为24～28.3minutes的范围内；出峰时间为27.5minutes附近的峰为pI＝7.0的Marker)，待测蛋白中各电荷异构体的分离效果差(其中，对比组1.2中(1)的检测方法在样品前处理过程中出现沉淀，检测谱图“D1.2.4”中无目的峰出现)，不能实现对蛋白电荷异质性进行定性及定量分析的目的。
对比组1.3：蛋白经过不同的去除糖基化修饰处理后，分别进行cIEF检测，检测结果见图4。具体的检测方法为：
平行取三份蛋白样品，分别加入表面活性剂(0.2％的RapiGest SF)和1M DTT，在95℃条件下反应10min进行变性还原处理，然后将三份样品采用PNGase F酶于37℃下分别酶切1h、4h、20h，随后将酶切后的样品分别采用如对比组1.2中检测方法(1)所述的混合处理及cIEF检测。检测得到的谱图结果如图4所示，其中，“D1.3.1”为PNGase F酶酶切1h的检测谱图；“D1.3.2”为PNGase F酶酶切4h的检测谱图；“D1.3.3”为PNGase F酶酶切20h的检测谱图。
由图4看出：将蛋白样品分别采用对比组1.3中(1)-(3)的去糖基化修饰前处理后，检测得到的谱图峰型差，不同目的峰的辨识度低(目的峰的出峰时间为28.6～31minutes范围内)，待测蛋白中各电荷异构体的分离效果差，不能满足对蛋白电荷异质性进行定性及定量分析要求。
对比组1.4：蛋白经过IdeS酶酶切处理后，进行cIEF检测
将待检测蛋白样品中加入IdeS酶及其酶切缓冲液，在37℃下酶切1.5h，然后采用如对比组1.2中检测方法(1)所述的混合处理及cIEF检测。检测得到的谱图结果如图5所示。
由图5可知：采用对比组1.4的检测方法，得到的谱图中出峰时间为30～33minutes范围内的目的峰辨识度低，待测蛋白中各电荷异构体的分离效果差，不能满足蛋白电荷异质性的定性和定量分析要求。
对比组1.5：蛋白经过IdeS酶酶切和切唾液酸处理后，进行cIEF检测
向待检测蛋白中加入IdeS酶及其酶切缓冲液，在37℃下酶切1.5h后，再加入唾液酸酶(如α2-3,6,8Neuraminidase)及其酶切缓冲液，在37℃下酶切20h，然后采用如对比组1.2中检测方法(1)所述的混合处理及cIEF检测。检测得到的谱图结果如图6所示。
由图6看出：采用对比组1.5的检测方法，得到的谱图中各目的峰辨识准确度低(目的峰的出峰时间为25.5～30.5minutes范围内)，蛋白中各电荷异构体的分离效果差，不能实现蛋白电荷异质性的定性及定量分析的目的。
对比组1.6：蛋白经过IdeS酶酶切和切N糖(去除糖基化修饰)处理后，进行cIEF检测，检测结果见图7。具体的检测方法分别为：
(1)向待检测的蛋白样品中加入IdeS酶及其酶切缓冲液，在37℃下酶切1.5h，然后加入表面活性剂(0.2％的RapiGest SF)和1M DTT，在95℃条件下反应10min进行变性还原处理，然后采用PNGase F酶于37℃下酶切1h进行去除糖基化修饰处理，然后采用如对比组1.2中检测方法(1)所述的混合处理及cIEF检测。检测得到的谱图结果如图7中“D1.6.1”标记所示。
(2)该检测方法中除了加入PNGase F在37℃下酶切4h外，其他操作与上述对比组1.6中检测方法(1)的检测方法相同。检测得到的谱图结果如图7中“D1.6.2”标记所示。
(3)该检测方法中除了加入PNGase F在37℃下酶切20h外，其他操作与上述对比组1.6中检测方法(1)的检测方法相同。检测得到的谱图结果如图7中“D1.6.3”标记所示。
由图7看出：采用对比组1.6中(1)-(3)的IdeS酶酶切和不同时间的去糖基化修饰的前处理后，检测得到的谱图中目的峰(出峰时间为36.3～40.3minutes范围内)的峰形及各电荷异构体的分离效果比对比组1.1-1.5中的结果有较大改善，但各目的峰的辨识准确度仍有待提高，无法实现各目的峰峰面积百分比的准确计算，即，采用对比组1.6中(1)-(3)的检测方法不能满足蛋白电荷异质性的定量分析要求。
综上，由对比组1.1-1.6的结果可看出：上述对比组中对蛋白采用不同单酶切或组合酶切的前处理后，再进行等电聚焦电泳检测，得到的检测谱图中各目的峰均不能准确识别，得到的蛋白电荷异构体的分离效果欠佳，不能实现蛋白异质性检测的定性及定量分析目的。
对比例2：酶切片段的前处理方法对比
向待检测的蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)中加入IdeS酶及其酶切缓冲液，在37℃下酶切1.5h，然后加入活化后的亲和树脂(GE Healthcare MabSelect SuReLx树脂)中，上下颠倒混匀后，静置并离心，吸取上清液，即为不含免疫球蛋白Fc区的非Fc段；向离心后的沉淀中加入亲和树脂洗脱液(0.1M柠檬酸(pH＝3.4))，上下颠倒混匀后，静置并离心，吸取上清液，即为含免疫球蛋白Fc区的Fc段。
将上述方法得到的Fc段采用如对比组1.2中检测方法(1)所述的混合处理及cIEF检测，检测结果如图8中的“D2.1”标记所示。
将上述方法得到的非Fc段分成3等份，分别采用如下处理：
(1)将非Fc段采用如对比组1.2中检测方法(1)所述的混合处理及cIEF检测，检测结果如图8中的“D2.2”标记所示；
(2)将非Fc段中加入唾液酸酶(α2-3,6,8Neuraminidase)及其酶切缓冲液(1xGlyco Buffer)，在37℃下酶切过夜，然后采用如对比组1.2中检测方法(1)所述的混合处理及cIEF检测，检测结果如图8中的“D2.3”标记所示；
(3)将非Fc段中加入表面活性剂(0.2％的RapiGest SF)和1M DTT，在95℃条件下反应10min进行变性还原处理，然后加入PNGase F酶及其酶切缓冲液，于37℃下酶切过夜后，采用如对比组1.2中检测方法(1)所述的混合处理及cIEF检测，检测结果如图8中的“D2.4”标记所示。
从图8可看出：谱图“D2.1”中目的峰(出峰时间为24.8～28.8minutes)除有一个目的峰与pI7.0的Marker重叠外，其余目的峰的分离效果好，能实现峰面积百分比的准确计算，即“D2.1”对应的检测方法中，若在混合处理时将pI7.0Marker进行合适替换，则可实现蛋白电荷异质性定性和定量分析；谱图“D2.2”中目的峰(出峰时间为27.8～31.8minutes)和谱图“D2.3”中目的峰(出峰时间为24.8～28.8minutes)的峰型差、分离效果差、信噪比低，不能对各目的峰进行准确识别，更无法实现各目的峰峰面积百分比的准确计算，即，采用“D2.2”和“D2.3”对应的检测方法不能实现蛋白电荷异质性的定性及定量分析；谱图“D2.4”中目的峰(出峰时间为28.8～31minutes)的峰型好、分离效果好，能实现各目的峰峰面积百分比的准确计算，即，采用“D2.4”对应的检测方法，能实现蛋白电荷异质性定性和定量分析的目的。
对比例3：不同检测条件对比
向待检测的蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)中加入IdeS酶及其酶切缓冲液，在37℃下酶切1.5h，然后加入活化后的亲和树脂(GE Healthcare MabSelect SuReLx树脂)中，上下颠倒混匀后，静置并离心，吸取上清液，即为不含免疫球蛋白Fc区的非Fc段，将得到的非Fc段中加入表面活性剂(0.2％的RapiGest SF)和1M DTT，在95℃条件下反应10min进行变性还原处理，然后加入PNGase F酶及其酶切缓冲液，于37℃下酶切过夜，将上述处理后的非Fc段分成8等份，分别与cIEF胶、载体两性电解质、阴极稳定液(300mM NaOH)、阳极稳定液(200mM磷酸)以及等电点标准蛋白(pI值分别为：5.5，7.0和9.5)进行混合处理后，进行cIEF检测(cIEF的分离条件为：聚焦电压25KV、聚焦时间15min、分离电压30KV、分离时间30min；检测波长：280nm)。
上述8份非Fc段的混合条件中分别采用如下表的cIEF胶中尿素的浓度和载体两性电解质的pH范围，其余混合条件及cIEF检测条件均相同，检测结果如图9所示：
Figure BDA0001949507860000081
由图9可看出：标记“D3.1”、“D3.2”、“D3.3”和“D3.4”的谱图中未见目的峰(目的峰应在pI7.0 Marker和pI5.5 Marker之间)，无法实现蛋白的电荷异质性检测，即采用“D3.1”、“D3.2”、“D3.3”和“D3.4”对应的检测方法，不能实现蛋白电荷异质性检测；标记“D3.5”、“D3.6”和“D3.7”的谱图中，有目的峰出现(目的峰出峰时间为31.3～35minutes范围内)，但峰型差(峰宽大、峰高小)，不能实现各目的峰峰面积的准确计算；标记“D3.8”的峰型最佳，能对目的峰(出峰时间为31～32.7minutes范围内)进行准确识别，能实现各目的峰峰面积百分比的准确计算，即混合处理时采用的载体两性电解质的pH范围对蛋白电荷异质性检测结果产生影响，当采用谱图“D3.8”对应的检测方法，即采用含摩尔浓度为6mol/L尿素的cIEF胶和pH3～10的载体两性电解质进行混合时，能实现蛋白电荷异质性的定性及定量分析。
实施例1：
将待检测的蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)中加入IdeS酶及其酶切缓冲液，在37℃下酶切1.5h，然后加入活化后的亲和树脂(GE Healthcare MabSelect SuReLx树脂)中，上下颠倒混匀后，静置并离心，吸取上清液，即为不含免疫球蛋白Fc区的非Fc段；向离心后的沉淀中加入亲和树脂洗脱液(0.1M柠檬酸(pH＝3.4))，上下颠倒混匀后，静置并离心，吸取上清液，即为含免疫球蛋白Fc区的Fc段。
将上述方法得到的Fc段与6M cIEF胶(含摩尔浓度为6mol/L尿素的cIEF胶)、载体两性电解质(pH3～10)、阴极稳定液(300mMNaOH)、阳极稳定液(200mM磷酸)以及等电点标准蛋白(pI值分别为：4.1，5.5和9.5)进行混合处理后，进行cIEF检测(cIEF的分离条件为：聚焦电压25KV、聚焦时间15min、分离电压30KV、分离时间30min；检测波长：280nm)，检测结果如图10中的“S1.1”标记所示。
将上述方法得到的非Fc段加入表面活性剂(0.2％的RapiGest SF)和1M DTT，在95℃条件下反应10min进行变性还原处理，然后加入PNGase F酶及其酶切缓冲液，于37℃下酶切过夜后，与6M cIEF胶、载体两性电解质(pH3～10)、阴极稳定液(300mMNaOH)、阳极稳定液(200mM磷酸)以及等电点标准蛋白(pI值分别为：5.5，7.0和9.5)进行混合处理，然后采用如上述Fc段相同的cIEF检测，检测结果如图10中的“S1.2”标记所示。
从图10可以看出：采用本实施例的蛋白电荷异质性检测方法，谱图“S1.1”中目的峰(出峰时间26～30minutes)和谱图“S1.2”中目的峰(出峰时间29.5～31.5minutes)的峰型好、信噪比高、各目的峰的辨识准确度高，能够对各目的峰进行准确的峰面积百分比计算，即，采用实施例1中的检测方法可以实现蛋白电荷异质性的定性及定量分析。
实施例2：
将待检测的蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)中加入IdeS酶及其酶切缓冲液，在37℃下酶切1.5h，然后加入活化后的亲和树脂(GE Healthcare MabSelect SuReLx树脂)中，上下颠倒混匀后，静置并离心，吸取上清液，即为不含免疫球蛋白Fc区的非Fc段；向离心后的沉淀中加入亲和树脂洗脱液(0.1M柠檬酸(pH＝3.4))，上下颠倒混匀后，静置并离心，吸取上清液，即为含免疫球蛋白Fc区的Fc段。
将上述方法得到的Fc段与6M cIEF胶(含摩尔浓度为6mol/L尿素的cIEF胶)、载体两性电解质(pH3～10)、阴极稳定液(300mMNaOH)、阳极稳定液(200mM磷酸)以及等电点标准蛋白(pI值分别为：4.5，5.5和9.5)进行混合处理后，进行cIEF检测(cIEF的分离条件为：聚焦电压25KV、聚焦时间15min、分离电压30KV、分离时间30min；检测波长：280nm)，检测结果如图11中的“S2.1”标记所示。
将上述方法得到的非Fc段加入表面活性剂(0.2％的RapiGest SF)和1M DTT，在95℃条件下反应10min进行变性还原处理，然后加入PNGase F酶及其酶切缓冲液，于37℃下酶切过夜后，加入10M盐酸(即摩尔浓度为10mol/L的盐酸溶液)混匀，静置并离心，弃去上清液，向沉淀中加入6M尿素(即摩尔浓度为6mol/L的尿素溶液)，使非Fc段重新溶解后，与6McIEF胶(含摩尔浓度为6mol/L尿素的cIEF胶)、载体两性电解质(pH3～10)、阴极稳定液(300mM NaOH)、阳极稳定液(200mM磷酸)以及等电点标准蛋白(pI值分别为：5.5，7.0和9.5)进行混合处理，然后采用如上述Fc段相同的cIEF检测，检测结果如图11中的“S2.2”标记所示。
从图11可以看出：采用本实施例的蛋白电荷异质性检测方法，谱图“S2.1”中目的峰(出峰时间26～30minutes)和谱图“S2.2”中目的峰(出峰时间29.5～31minutes)的峰型好、信噪比高、各目的峰的辨识准确度高，能够对各目的峰进行准确的峰面积百分比计算，即，采用实施例2中的检测方法，可以实现蛋白电荷异质性的定性及定量分析。
实施例3：
将待检测的蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)中加入IdeS酶及其酶切缓冲液，在37℃下酶切1.5h，然后加入活化后的亲和树脂(GE Healthcare MabSelect SuReLx树脂)中，上下颠倒混匀后，静置并离心，吸取上清液，即为不含免疫球蛋白Fc区的非Fc段；向离心后的沉淀中加入亲和树脂洗脱液(0.1M柠檬酸(pH＝3.4))，上下颠倒混匀后，静置并离心，吸取上清液，即为含免疫球蛋白Fc区的Fc段。
将上述方法得到的Fc段与6M cIEF胶(含摩尔浓度为6mol/L尿素的cIEF胶)、载体两性电解质(pH3～10)、阴极稳定液(300mM NaOH)、阳极稳定液(200mM磷酸)以及等电点标准蛋白(pI值分别为：4.1，5.5和9.5)进行混合处理后，进行cIEF检测(cIEF的分离条件为：聚焦电压25KV、聚焦时间15min、分离电压30KV、分离时间30min；检测波长：280nm)，检测结果如图12中的“S3.1”标记所示。
将上述方法得到的非Fc段加入表面活性剂(0.2％的RapiGest SF)和1M DTT，在95℃条件下反应10min进行变性还原处理，然后加入PNGase F酶及其酶切缓冲液，于37℃下酶切过夜后，加入IAA于室温下避光封闭30min，加入10M盐酸混匀，静置并离心，弃去上清液，向沉淀中加入6M尿素，使非Fc段重新溶解，然后采用如上述Fc段相同的混合处理及cIEF检测，检测结果如图12中的“S3.2”标记所示。
从图12可以看出：采用本实施例的蛋白电荷异质性检测方法，谱图“S3.1”中目的峰(出峰时间26～30.5minutes)和谱图“S3.2”中目的峰(出峰时间30.5～32minutes)的峰型好、、信噪比高、各目的峰的辨识准确度高，能够对各目的峰进行准确的峰面积百分比计算，即，采用实施例3中的检测方法可以实现蛋白电荷异质性的定性及定量分析。
此外，本申请人经过试验发现，对非Fc段进行变性还原处理后，先加入IAA进行封闭处理，再加入PNGase F酶进行酶切处理，在酶切过程中非Fc段出现聚集沉淀现象，导致cIEF检测谱图中目的峰信号强度低，且分离效果差，即蛋白中各电荷异构体未得到很好分离，不能实现蛋白电荷异质性的定性及定量分析。
实施例4：蛋白电荷异质性检测的灵敏度考察
方法：对蛋白进行紫外光照加速破坏蛋白造成电荷异质性变化，采用实施例1中的检测方法，对上述加速破坏的蛋白样品进行电荷异质性检测，以考察检测方法的灵敏性。
具体操作如下：将蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)直接暴露于254nm光照0min，4.5min，9min，18min，36min，54min和72min后，将不同光照时间的蛋白样品分别采用实施例3中的检测方法，进行cIEF检测。
含免疫球蛋白Fc区的Fc段检测结果见图13所示，其中，谱图“S4.1.1”为光照0min的Fc段检测结果；谱图“S4.1.2”为光照4.5min的Fc段检测结果；谱图“S4.1.3”为光照9min的Fc段检测结果；谱图“S4.1.4”为光照18min的Fc段检测结果；谱图“S4.1.5”为光照36min的Fc段检测结果；谱图“S4.1.6”为光照54min的Fc段检测结果；谱图“S4.1.7”为光照72min的Fc段检测结果。
不含免疫球蛋白Fc区的非Fc段检测结果如图14所示，其中，谱图“S4.2.1”为光照0min的非Fc段检测结果；谱图“S4.2.2”为光照4.5min的非Fc段检测结果；谱图“S4.2.3”为光照9min的非Fc段检测结果；谱图“S4.2.4”为光照18min的非Fc段检测结果；谱图“S4.2.5”为光照36min的非Fc段检测结果；谱图“S4.2.6”为光照54min的非Fc段检测结果；谱图“S4.2.7”为光照72min的非Fc段检测结果。
从图13中可以看出：随着光照时间的延长，Fc段的目的峰(出峰时间为26～31minutes范围内)信号强度呈减弱的趋势，但各目的峰的峰形边界较清晰、分离效果基本不变；从图14中看出：随着光照时间的延长，非Fc段的目的峰(出峰时间为29.5～33minutes范围内)的峰形边界越来越模糊、峰宽越来越大，且各目的峰逐步向酸端偏移。
综上，从图13和图14可看出，随着紫外光照时间的延长，蛋白的电荷异质性发生变化，而实施例1中的检测方法能灵敏地检测出上述变化，说明实施例1中的检测方法灵敏度高。
序列表
<110> 成都康弘生物科技有限公司
<120> 一种蛋白的电荷异质性检测方法
<130> 2018.12.27
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 526
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His
1 5 10 15
Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro
20 25 30
Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro
35 40 45
Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser
50 55 60
Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val
65 70 75 80
Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn
85 90 95
Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser
100 105 110
Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn
115 120 125
Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His
130 135 140
Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met
145 150 155 160
Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp
165 170 175
Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys
180 185 190
Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly
195 200 205
Ser Gly Met Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg
210 215 220
Ile Pro Ala Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr
225 230 235 240
Lys Asn Gly Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His
245 250 255
Val Leu Thr Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr
260 265 270
Val Ile Leu Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val
275 280 285
Ser Leu Val Val Tyr Val Pro Pro Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr
290 295 300
Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
305 310 315 320
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
325 330 335
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
340 345 350
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
355 360 365
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
370 375 380
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
385 390 395 400
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
405 410 415
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
420 425 430
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
435 440 445
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
450 455 460
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ala Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
465 470 475 480
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
485 490 495
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
500 505 510
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
515 520 525

Claims (10)

1.一种蛋白的电荷异质性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：采用蛋白酶对待测蛋白进行酶切，分离酶切片段，对分离后的酶切片段进行变性还原和去糖基化修饰处理后，采用等电聚焦电泳进行电荷异质性检测；所述蛋白具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述进行变性还原处理和去糖基化修饰处理的酶切片段为不含免疫球蛋白Fc区的酶切片段；所述去糖基化修饰为去除蛋白中的N-糖基化修饰；所述变性还原处理是通过加入变性剂和还原剂对分离后的酶切片段进行处理。
2.根据权利要求1所述的蛋白的电荷异质性检测方法，其特征在于，所述蛋白酶选自木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、IdeZ蛋白酶或重组化脓性链球菌IgG降解酶。
3.根据权利要求2所述的蛋白的电荷异质性检测方法，其特征在于，所述蛋白酶为重组化脓性链球菌IgG降解酶。
4.根据权利要求1所述的蛋白的电荷异质性检测方法，其特征在于，所述分离酶切片段为采用亲和树脂分离方法对酶切片段进行分离；所述亲和树脂为蛋白A树脂或蛋白G树脂。
5.根据权利要求1所述的蛋白的电荷异质性检测方法，其特征在于，所述分离酶切片段为采用亲和树脂分离方法对酶切片段进行分离；所述亲和树脂为MabSelectTM树脂。
6.根据权利要求1所述的蛋白的电荷异质性检测方法，其特征在于，所述变性还原处理的步骤为：向分离后的酶切片段中加入盐酸胍和二硫苏糖醇，在50°C下进行变性还原；或向分离后的酶切片段中加入表面活性剂和二硫苏糖醇，在95°C下进行变性还原。
7.根据权利要求1所述的蛋白的电荷异质性检测方法，其特征在于，所述去糖基化修饰处理为采用去糖基化酶对酶切片段进行处理。
8.根据权利要求7所述的蛋白的电荷异质性检测方法，其特征在于，所述去糖基化酶选自N-糖酰胺酶F。
9.根据权利要求1所述的蛋白的电荷异质性检测方法，其特征在于，所述等电聚焦电泳为毛细管等电聚焦电泳。
10.根据权利要求9所述的蛋白的电荷异质性检测方法，其特征在于，所述等电聚焦电泳的步骤中采用的助溶剂为6mol/L的尿素，采用的载体两性电解质的pH值范围为3～10。
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