CN107034259A - 一种高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白的制备方法,属于胶原蛋白制备技术领域。其通过清洗、脱盐、碱液浸泡、醇浸泡、超声酶提、后处理、重复盐析和透析最后得到产品高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白。本发明采用的超声辅助酶提工艺操作简单,既能有效缩短提取时间,又能获得具有良好热稳定性能的胶原蛋白,而且对环境的污染也较小。此外,还可充分有效开发和利用中华鳖副产物,避免资源的浪费,提高企业经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白的制备方法,属于胶原蛋白制备技术领域。
背景技术
近年来,由于胶原蛋白越来越多地用于医药、食品、高档化妆品、生物肥料等工业领域,造成市场供不应求。目前,工业胶原蛋白主要来源于牛、猪等陆产动物。由于畜产动物中重大疾病的频繁发生,如牛的海绵状脑病(疯牛病);猪的口蹄疫等,使用户对胶原蛋白的安全性产生怀疑。
实际上,水产动物的皮、骨、鳍等含丰富的胶原蛋白,而且是安全的胶原蛋白的来源。从水产动物中提取胶原蛋白并对其进行深入研究在国外已相当普遍。中华鳖(Pelodiscus sinensis Wiegmann)是我国传统的名贵水产品,俗称甲鱼、团鱼、水鱼、王八、神守等。鳖类的生理活性物质及其抗癌药品、保健食品的开发是研究的热点。据世界粮农组织统计,我国2013年中华鳖产量347587t,按比例计算大约有43000t的壳、骨下脚料。有关中华鳖裙边胶原蛋白的研究已有报道,但关于含钙组织如中华鳖壳、骨中胶原蛋白的研究报道极少。如果这些下脚料能得到有效利用,将会为企业带来可观的经济效益。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处,提供一种高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白的制备方法。
本发明的技术方案,一种高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白的制备方法,步骤如下:
(1)清洗:取中华鳖壳,彻底清除附着的肌肉后立即使用或置于-20℃冰箱中待用;
(2)脱盐:中华鳖壳充分剁碎后,按照料液比1:6~8g/mL加入0.3~0.7mol/L的盐酸溶液,温度10~20℃;静置放置,每隔1~3h换液1次;换液3~5次后,用水清洗至洗出液呈中性,收集得到脱盐中华鳖壳,冷冻干燥24~48h备用;
(3)碱液浸泡:用步骤(2)所得脱盐中华鳖壳质量15~25倍的0.05~0.15mol/L的NaOH溶液于20℃下浸泡3~5h;
(4)醇浸泡:取步骤(3)所得中华鳖壳用蒸馏水反复洗涤,充分沥干后加入中华鳖壳质量计15~25倍的质量浓度为10%的异丙醇溶液,于20~25℃下浸泡12~24h,以去除脂肪;
(5)超声酶提:步骤(4)所得中华鳖壳经蒸馏水反复洗涤,沥干后再加入以中华鳖壳质量计15~25倍的0.3~0.7mol/L的乙酸溶液,在超声波100~200W下预处理4~8min,然后添加100~200U/g的胃蛋白酶,并在37℃下磁力搅拌3~5h,以未进行超声处理的酶提胶原蛋白进行对照;
(6)后处理:在0~8℃下,以8000~12000×g离心25~35min后得上清液即为粗胶原蛋白;
(7)重复盐析:取步骤(6)所得粗胶原蛋白加入NaCl至溶液终浓度为0.8~1.0mol/L,同时析出絮状沉淀,于4℃,5000~10000×g离心10~20min得沉淀物,用0.5mol/L冰醋酸重新溶解,重复盐析一次,5000~10000×g离心10~20min得沉淀物即为盐析后的胶原蛋白;
(8)透析:对步骤(7)所得胶原蛋白用0.3~0.7mol/L乙酸溶解,在0.05~0.15mol/L乙酸中透析24~48h,每6~10h更换一次透析液,冷冻干燥后置-40℃冰箱中待用,即得产品高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白。
本发明的有益效果:本发明采用的超声辅助酶提工艺操作简单,既能有效缩短提取时间,又能获得具有良好热稳定性能的胶原蛋白,而且对环境的污染也较小。此外,还可充分有效开发和利用中华鳖副产物,避免资源的浪费,提高企业经济效益。
附图说明
图1是常规酶提和超声辅助酶提胶原蛋白的分数粘度变化趋势。
具体实施方式
实施例1
一种高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白的制备方法,步骤如下:
(1)清洗:取中华鳖壳,彻底清除附着的肌肉后立即使用或置于-20℃冰箱中待用;
(2)脱盐:中华鳖壳充分剁碎后,按照料液比1:6g/mL加入0.3mol/L的盐酸溶液,温度10℃;静置放置,每隔1h换液1次;换液5次后,用水清洗至洗出液呈中性,收集得到脱盐中华鳖壳,冷冻干燥24h备用;
(3)碱液浸泡:用步骤(2)所得脱盐中华鳖壳质量15倍的0.15mol/L的NaOH溶液于20℃下浸泡3h;
(4)醇浸泡:取步骤(3)所得中华鳖壳用蒸馏水反复洗涤,充分沥干后加入中华鳖壳质量计15倍的质量浓度为10%的异丙醇溶液,于20℃下浸泡24h,以去除脂肪;
(5)超声酶提:步骤(4)所得中华鳖壳经蒸馏水反复洗涤,沥干后再加入以中华鳖壳质量计15倍的0.7mol/L的乙酸溶液,在超声波100W下预处理4min,然后添加200U/g的胃蛋白酶,并在37℃下磁力搅拌3h,以未进行超声处理的酶提胶原蛋白进行对照;
(6)后处理:在0℃下,以8000×g离心35min后得上清液即为粗胶原蛋白;
(7)重复盐析:取步骤(6)所得粗胶原蛋白加入NaCl至溶液终浓度为0.8mol/L,同时析出絮状沉淀,于4℃,10000×g离心10min得沉淀物,用0.5mol/L冰醋酸重新溶解,重复盐析一次,5000×g离心20min得沉淀物即为盐析后的胶原蛋白;
(8)透析:对步骤(7)所得胶原蛋白用0.3mol/L乙酸溶解,在0.15mol/L乙酸中透析24h,每10h更换一次透析液,冷冻干燥后置-40℃冰箱中待用,即得产品高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白。
实施例2
一种高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白的制备方法,其特征是步骤如下:
(1)清洗:取中华鳖壳,彻底清除附着的肌肉后立即使用或置于-20℃冰箱中待用;
(2)脱盐:中华鳖壳充分剁碎后,按照料液比1:8g/mL加入0.3mol/L的盐酸溶液,温度20℃;静置放置,每隔1h换液1次;换液3次后,用水清洗至洗出液呈中性,收集得到脱盐中华鳖壳,冷冻干燥24h备用;
(3)碱液浸泡:用步骤(2)所得脱盐中华鳖壳质量25倍的0.05mol/L的NaOH溶液于20℃下浸泡3h;
(4)醇浸泡:取步骤(3)所得中华鳖壳用蒸馏水反复洗涤,充分沥干后加入中华鳖壳质量计25倍的质量浓度为10%的异丙醇溶液,于20℃下浸泡12h,以去除脂肪;
(5)超声酶提:步骤(4)所得中华鳖壳经蒸馏水反复洗涤,沥干后再加入以中华鳖壳质量计25倍的0.3mol/L的乙酸溶液,在超声波100W下预处理8min,然后添加200U/g的胃蛋白酶,并在37℃下磁力搅拌3h,以未进行超声处理的酶提胶原蛋白进行对照;
(6)后处理:在8℃下,以8000×g离心25min后得上清液即为粗胶原蛋白;
(7)重复盐析:取步骤(6)所得粗胶原蛋白加入NaCl至溶液终浓度为1.0mol/L,同时析出絮状沉淀,于4℃,10000×g离心10min得沉淀物,用0.5mol/L冰醋酸重新溶解,重复盐析一次,10000×g离心20min得沉淀物即为盐析后的胶原蛋白;
(8)透析:对步骤(7)所得胶原蛋白用0.7mol/L乙酸溶解,在0.05mol/L乙酸中透析48h,每10h更换一次透析液,冷冻干燥后置-40℃冰箱中待用,即得产品高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白。
实施例3
一种高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白的制备方法,其特征是步骤如下:
(1)清洗:取中华鳖壳,彻底清除附着的肌肉后立即使用或置于-20℃冰箱中待用;
(2)脱盐:中华鳖壳充分剁碎后,按照料液比1:7g/mL加入0.5mol/L的盐酸溶液,温度15℃;静置放置,每隔2h换液1次;换液4次后,用水清洗至洗出液呈中性,收集得到脱盐中华鳖壳,冷冻干燥34h备用;
(3)碱液浸泡:用步骤(2)所得脱盐中华鳖壳质量20倍的0.1mol/L的NaOH溶液于20℃下浸泡4h;
(4)醇浸泡:取步骤(3)所得中华鳖壳用蒸馏水反复洗涤,充分沥干后加入中华鳖壳质量计20倍的质量浓度为10%的异丙醇溶液,于23℃下浸泡20h,以去除脂肪;
(5)超声酶提:步骤(4)所得中华鳖壳经蒸馏水反复洗涤,沥干后再加入以中华鳖壳质量计20倍的0.5mol/L的乙酸溶液,在超声波150W下预处理6min,然后添加150U/g的胃蛋白酶,并在37℃下磁力搅拌4h,以未进行超声处理的酶提胶原蛋白进行对照;
(6)后处理:在4℃下,以10000×g离心30min后得上清液即为粗胶原蛋白;
(7)重复盐析:取步骤(6)所得粗胶原蛋白加入NaCl至溶液终浓度为0.9mol/L,同时析出絮状沉淀,于4℃,8000×g离心15min得沉淀物,用0.5mol/L冰醋酸重新溶解,重复盐析一次,8000×g离心15min得沉淀物即为盐析后的胶原蛋白;
(8)透析:对步骤(7)所得胶原蛋白用0.5mol/L乙酸溶解,在0.1mol/L乙酸中透析36h,每8h更换一次透析液,冷冻干燥后置-40℃冰箱中待用,即得产品高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白。
应用实施例1热变性温度(Td)的测定
通过测定胶原蛋白溶液分数粘度的变化来确定其热变性温度。取一定量的胶原蛋白样品溶于0.1mol/L的乙酸中的配制成0.1%(m/v)浓度的溶液,将胶原蛋白溶液置于Ostwald粘度计中,再将粘度计浸入15℃的水浴中后,保持30min,使得胶原溶液达到15℃。然后将温度从15℃逐步升高至50℃,用Ostwald粘度计测定胶原蛋白溶液在15-50℃(间隔5℃)区间内的粘度,各温度保持恒温30min,并进行8次实验,取平均值。然后,利用公式计算每个温度的分数粘度。绘制分数粘度-温度曲线,Td值为该曲线线性部分的中点。
式中:t为任意时间的温度,℃;t0为0min时的温度,℃。
实验结果如图1所示,常规酶提中华鳖壳胶原蛋白的热变性温度大约为35.3℃,而超声辅助酶提中华鳖壳得到的胶原蛋白的热变性温度为38.5℃左右。水生动物由于其生活的环境,一般情况下的热变形温度均比陆生哺乳动物低7~12℃,以上试验方法得到的胶原蛋白的热变形温度已接近陆生哺乳动物,因此,超声辅助酶提所得的胶原蛋白热稳定性较好,可在生物材料、制药等领域有潜在的应用价值。
Claims (1)
1.一种高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白的制备方法,其特征是步骤如下:
(1)清洗:取中华鳖壳,彻底清除附着的肌肉后立即使用或置于-20℃冰箱中待用;
(2)脱盐:中华鳖壳充分剁碎后,按照料液比 1:6~8g/mL加入0.3~0.7mol/L的盐酸溶液,温度10~20℃;静置放置,每隔1~3h换液1次;换液3~5次后,用水清洗至洗出液呈中性,收集得到脱盐中华鳖壳,冷冻干燥24~48h备用;
(3)碱液浸泡:用步骤(2)所得脱盐中华鳖壳质量15~25倍的0.05~0.15mol/L 的NaOH溶液于20℃下浸泡3~5h;
(4)醇浸泡:取步骤(3)所得中华鳖壳用蒸馏水反复洗涤,充分沥干后加入中华鳖壳质量计15~25倍的质量浓度为10%的异丙醇溶液,于20~25℃下浸泡12~24h,以去除脂肪;
(5)超声酶提:步骤(4)所得中华鳖壳经蒸馏水反复洗涤,沥干后再加入以中华鳖壳质量计15~25倍的0.3~0.7mol/L的乙酸溶液,在超声波100~200W下预处理4~8min,然后添加100~200U/g的胃蛋白酶,并在37℃下磁力搅拌3~5h,以未进行超声处理的酶提胶原蛋白进行对照;
(6)后处理:在0~8℃下,以8000~12000×g离心25~35min后得上清液即为粗胶原蛋白;
(7)重复盐析:取步骤(6)所得粗胶原蛋白加入NaCl至溶液终浓度为 0.8~1.0mol/L,同时析出絮状沉淀,于4℃,5000~10000×g离心10~20min得沉淀物,用 0.5mol/L冰醋酸重新溶解,重复盐析一次,5000~10000×g离心10~20min得沉淀物即为盐析后的胶原蛋白;
(8)透析:对步骤(7)所得胶原蛋白用0.3~0.7mol/L乙酸溶解,在0.05~0.15mol/L乙酸中透析24~48h,每6~10h更换一次透析液,冷冻干燥后置-40 ℃冰箱中待用,即得产品高热稳定性中华鳖副产物胶原蛋白。
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