CN112574293A - 一种利用超声辅助从鳖背甲中脱钙提取胶原蛋白的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用超声辅助从鳖背甲中脱钙提取胶原蛋白的工艺，将洁净的鳖背甲样品与盐酸按照料液比1:10‑50的比例混合，在温度为15‑38℃，超声功率为50‑250w的环境下脱钙15‑120min；脱钙结束后，离心收集上清液，冷冻干燥，获得背甲胶原蛋白；并通过对得到的背甲胶原蛋白的理化性质进行研究，证明利用本工艺提取得到的背甲胶原蛋白的胶原蛋白迁出率小，且脱钙率高，为中华鳖背甲进一步提取胶原蛋白的研究提供基础，为水产品加工副产物及其综合利用提供了重要的科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及胶原蛋白提取技术领域，具体涉及一种利用超声辅助从鳖背甲中脱钙提取胶原蛋白的工艺。
背景技术
水产动物骨的主要成分是胶原蛋白、结缔组织以及矿物质，动物骨骼(如牛骨等)通常含有丰富的蛋白、多肽、氨基酸及钙、磷等矿物质，且骨骼蛋白以胶原蛋白为主，约占总蛋白80％左右；骨胶原蛋白与皮胶原蛋白的不同，由于骨骼中含有60％～70％左右的无机矿物质，磷酸钙和羟基磷灰石与胶原结合，形成坚硬难溶的骨盐沉积在胶原表面，所以水解胶原蛋白前应进行脱钙处理，降低胶原蛋白中无机杂质的含量，得到纯度高的胶原，像甲鱼背甲等副产物大多无法得到有效、高值地利用，造成了严重的资源浪费和环境污染；因此，为水产品加工副产物寻求一条高效、合理的综合利用途径显得尤为重要；
国内外学者对鱼骨、鱼鳞中可溶性钙的提脱除做了一些研究，均存在脱钙效率不高、时间长等问题；郝淑贤等以罗非鱼皮为原料，不同方法提取鱼皮胶原蛋白，其中超声预处理6.5h的胶原蛋白和酸法提取的胶原蛋白在电导率、氨基酸组成、凝胶强度和特性粘度以及热变性温度上差别甚微，这也间接说明了超声预处理对胶原蛋白的一级结构不会变化；另外，李德富等以胶原蛋白溶液为研究对象也证实了这一点，该研究发现超声预处理后发现胶原蛋白自组装形成的三螺旋结构在超声下会变的更为松散而不会消失或解离；王梅英等在盐酸浓度为0.8mol.L-1，超声时间为56.82min，液料比为15倍条件下，脱钙率达到92.43％；但目前未见对中华鳖背甲中可溶性钙提取的相关报道；而随着脱钙时间越长，胶原蛋白的流失量增加；
因此，为了能够对鳖甲中钙的有效脱除，尽可能多的保留胶原蛋白，探究超声辅助鳖甲中钙的脱除工艺。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种利用超声辅助从鳖背甲中脱钙提取胶原蛋白的工艺，通过在鳖背甲中按照料液比1:52的比例加入盐酸，提取到背甲胶原蛋白，并通过对得到的背甲胶原蛋白的理化性质进行研究，证明利用本工艺提取得到的背甲胶原蛋白的胶原蛋白迁出率小，且脱钙率高，为中华鳖背甲进一步提取胶原蛋白的研究提供基础。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种利用超声辅助从鳖背甲中脱钙提取胶原蛋白的工艺，将洁净的鳖背甲样品与盐酸按照料液比1:10-50的比例混合，在温度为15-38℃，超声功率为50-250w条件下于水套杯中脱钙15-120min；脱钙结束后，离心收集上清液，检测脱钙率和胶原蛋白溶出率，同时离心沉淀经纯水洗剂2-3次至pH值为中性，于冷干燥机中冷冻干燥，获得背甲胶原蛋白，为水产品加工副产物及其综合利用提供了重要的科学依据。
优选的，所述的鳖背甲需要预先经过破碎、冷冻干燥处理。
优选的，所述的盐酸浓度为0.2-1.2mol/L。
优选的，所述的盐酸浓度为0.812mol/mL。
优选的，所述的温度为25.205℃。
优选的，所述的料液比为1:52(g/mL)。
优选的，所述的反应时间为63.166min。
优选的，所述的超声功率为143.131w。
优选的，所述的离心收集上清液的转速和时间分别为10000r/min和25min。
优选的，鳖背甲的脱钙率为61.18％，得到的背甲胶原蛋白的胶原蛋白迁出率2.44％。
本发明的有益效果是：本发明公开了一种利用超声辅助从鳖背甲中脱钙提取胶原蛋白的工艺，与现有技术相比，本发明的改进之处在于：
本发明为缩短在鳖背甲脱钙时间，减少胶原蛋白的流失量，设计了一种利用超声辅助从鳖背甲中脱钙提取胶原蛋白的工艺，将鳖背甲与浓度为0.8mol/mL的盐酸按照料液比1:52(g/mL)的比例混合，在温度为25℃、超声功率为143w的环境下脱钙63min，得到背甲胶原蛋白，本工艺对鳖背甲的脱钙率为61.18％，提取得到的背甲胶原蛋白的迁出率为2.44％；经实验证明，本工艺得到的背甲胶原蛋白的紫光扫描符合胶原蛋白的紫外吸收特征、SDS-PAGE电泳结果符合水生胶原蛋白的结构特征、傅立叶红外扫描(FI-IR)具有好的完整性，为中华鳖背甲进一步提取胶原蛋白的研究提供基础，为水产品加工副产物及其综合利用提供了重要的科学依据。
附图说明
图1为本发明钙含量的测定采用EDTA滴定法得到的钙标准曲线图。
图2为本发明钙含量的测定采用EDTA滴定法得到的羟脯氨酸标准曲线图。
图3为本发明各因素对于鳖甲中脱钙率与胶原蛋白迁出率的影响曲线图。
图4为本发明鳖背甲胶原蛋白在190～800nm处的UV谱图。
图5为本发明鳖背甲胶原蛋白的SDS-PAGE图谱。
图6为本发明鳖背甲胶原蛋白在500～4000cm-1处的FTIR谱图。
其中：在图3中：(a)表示盐酸浓度(A)对于鳖甲中脱钙率与胶原蛋白迁出率的影响曲线，(b)表示温度(B)对于鳖甲中脱钙率与胶原蛋白迁出率的影响曲线，(c)表示时间(C)对于鳖甲中脱钙率与胶原蛋白迁出率的影响曲线，(d)表示料液比(D)对于鳖甲中脱钙率与胶原蛋白迁出率的影响曲线，(e)表示超声频率(E)对于鳖甲中脱钙率与胶原蛋白迁出率的影响曲线，(f)表示超声功率(F)对于鳖甲中脱钙率与胶原蛋白迁出率的影响曲线。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
由于骨骼中含有60％～70％左右的无机矿物质，磷酸钙和羟基磷灰石与胶原结合，形成坚硬难溶的骨盐沉积在胶原表面，使得直接提取鱼鳞胶原蛋白产率低、生产周期长，所以水解胶原蛋白前应进行脱钙处理，降低胶原蛋白中无机杂质的含量，得到纯度高的胶原蛋白；像甲鱼背甲等副产物大多无法得到有效、高值地利用，造成了严重的资源浪费和环境污染。因此，为水产品加工副产物、合理的综合利用途径显得尤为重要。
实施例1：参照附图1-3所示的一种利用超声辅助从鳖背甲中脱钙提取胶原蛋白的工艺，包括步骤：
1.材料与仪器的准备
中华鳖背甲：购买于浙江省绍兴养殖场，宰杀获得背甲；碳酸钙、盐酸、硝酸、柠檬酸钠、乙二胺四乙酸二钠、氢氧化钠、无水乙酸钠等均为分析纯；ME204-电子分析天平：梅特勒公司；S220-KpH计：梅特勒公司；ALPHA 2-4LD plus冷冻干燥机：Christ公司；Cary-100紫外分光光度计：安捷伦公司；BPG-9140A精密鼓风干燥箱：上海一恒公司；JY92-ⅡN超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；
2.方法
中华鳖背甲基本成分分析：粗蛋白含量的测定采用凯氏定氮法；粗脂肪含量的测定采用索氏抽提法；粗灰分含量的测定是通过使用马弗炉在550-600℃下处理；水分含量的测定采用105℃水分测定仪法；钙含量的测定采用EDTA滴定法；
得到：鳖背甲中测定的水分含量为34.98±0.43％，干物质含量为65.02％；鳖背甲干物质的营养成分如表1所示；
表1：鳖背甲干物质的基本营养成分(`x±s，n＝6)
从上表可以看出：粗蛋白的含量为46.44％，脂肪比例为0.40％，灰分比例为48.53％(其中钙含量比40.59％)，可见鳖背甲中主要成分为蛋白质和无机盐，其含有的脂肪含量较低，因此在胶原蛋白的提取过程中，需要先对鳖背甲进行有效的脱钙工艺；
钙含量的测定采用EDTA滴定法的结果如图1和图2所示：
由图1可知：通过线性回归得到标准方程为y＝0.0447x-0.0038，R2相关系数为0.9963；其中x为钙离子浓度(mg/mL)，y为EDTA消耗体积(mL)；表明溶液中钙离子浓度与EDTA消耗体积相关性良好，可以准确测得溶液中钙离子的浓度；
如图2可知：计算其回归方程为：y＝0.1488x+0.0002，作为胶原蛋白含量测定的标准；式中：x为羟脯氨酸浓度μg/mL；y为560nm处的吸光值，变异系数R2＝0.9995，表明线性关系良好，可作为测定标准。
S1.中华鳖背甲精细去肉后，切碎、粉碎，样品冷冻干燥，精密称取1g的冻干粉样品，将其置于玻璃套杯(连接低温恒温水浴槽精确控制温度)中脱钙操作，初设条件为：盐酸浓度0.2mol/L、料液比1:25、温度25℃、脱钙时间60min、超声功率150w、超声频率60s/30s；在初设条件下的基础上探究盐酸浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mol/L)、料液比(1:10/1:15/1:20/1:25/1:30/1:50m:v)、温度(15、20、25、30、35、38℃)、时间(15/30/45/60/75/90/120min)、超声功率(50、100、150、200、250w)、超声频率(10s/30s、20s/30s、30s/30s、40s/30s、50s/30s、60s/30s)等因素对中华鳖背甲中的钙脱除影响；
S2.脱钙结束后，在转速为10000r/min的环境下离心25min，收集上清液，检测脱钙率和胶原蛋白溶出率，同时离心沉淀经纯水洗剂2-3次至pH值为中性，于冷干燥机中冷冻干燥，获得低含钙量背甲粉，为下一步高效提取背甲胶原蛋白提供原材料；
S3.以脱钙率和胶原蛋白迁出率为评价指标，检测上清液钙含量和胶原蛋白含量，研究各条件的改变对中华鳖背甲脱钙和胶原蛋白迁出的影响，确定最佳的提取工艺：
S4.根据单因素试验结果和显著性差异分析从温度、时间、料液比、酸浓度、超声功率和超声频率等6个因素中筛选出影响脱钙效果较显著的5个因素(A-酸浓度、B-温度、C-料液比、D-时间、E-超声功率)作为试验因子，采用Design-Expert软件设计Box-Behnken试验条件，以脱钙率和胶原蛋白迁出率为评价指标，每组平行3次，取平均值，优化中华鳖背甲脱钙工艺；
(1)得到盐酸浓度、脱钙温度、脱钙时间、料液比、超声频率、超声功率等因素对鳖甲脱钙的影响结果分别见图3(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)，由图所示，结合胶原蛋白损失量，盐酸浓度为0.8mol/L、脱钙温度为25℃，脱钙时间为1h、料液比为1：50、超声频率为60s/30s、超声功率为135W时各单因素脱钙效果最佳；
(2)根据Design-expert 8.0.6分析可获得相应的二次响应面回归方程，脱钙率的方程为：
Y＝60.33+0.33A+0.48B+1.38C+0.42D+2.10E-0.76AB+0.52AC-0.32AD+0.16AE+0.69BC+0.51BD-0.091BE+0.61CD+0.98CE+0.75DE-2.45A2-2.68B2-2.99C2-1.98D2-2.77E2；
根据回归模型各因素的系数估计值：A＝0.33、B＝0.48、C＝1.38、D＝0.42、E＝2.10，由其绝对值大小可知以上各因素对鳖背甲脱钙率影响的主次顺序为：E>C>B>D>A，即超声功率>料液比>温度>时间>盐酸浓度；
胶原蛋白迁出率的方程为：
Y＝22.88-2.37A-0.20B-1.88C-1.30D-6.55E+0.59AB+1.39AC-0.012AD-1.04AE-0.63BC+1.89BD-0.68BE+1.04CD-0.57CE-2.25DE+9.09A2+7.03B2+7.56C2+5.97D2+5.47E2；
根据回归模型各因素的系数估计值：A＝-2.37、B＝-0.20、C＝-1.88、D＝-1.30、E＝-6.55，由其绝对值大小可知以上各因素对鳖背甲胶原蛋白迁出率影响的主次顺序为：E>A>C>D>B，即超声功率>盐酸浓度>料液比>时间>温度；
表2：回归模型的方差分析及显著性检验
由表2可知，回归模型P<0.0001，说明模型极显著，失拟相P脱钙＝0.8540和P胶原＝0.1350，表明模型拟合程度良好；模型校正系数R2 Adj分别为98.39％和99.78％，说明不确定因素对试验结果的干扰较小，该模型与数据拟合度较高，比较可靠，可用于分析和预测所选5变量对超声波辅助脱钙的影响；
预测工艺为：盐酸浓度0.812mol/L、温度25.205℃、料液比1:52(g/mL)、时间63.166min、超声功率143.131w、脱钙率为61.115％，胶原蛋白迁出率2.56％。经验证实验，结果为61.18％和2.44％。
实施例2：参见附图4-6所示，对中华鳖背甲脱钙处理后胶原蛋白的理化性质进行分析
取50g样品按照最优脱钙工艺脱钙处理，脱钙后样品经冷冻干燥；同时精确称取冻干粉一定量，在乙酸浓度为0.5mol/L、料液比1:50、温度30℃、磁力搅拌速度100rpm等条件下提取24小时，离心取上清液，冷冻干燥，获得背甲胶原蛋白作为对照物，进行如下理化特性的研究：
(1)紫外扫描：纯化后的胶原蛋白样品采用紫外扫描仪进行扫描，波长间隔1nm，波长范围为190-800nm，得到的鳖背甲胶原蛋白在190～800nm处的UV谱图如图4所示：
其最大吸收峰位于215nm处，这主要与肽链中含有的-C＝O，-COOH和CO-NH2等生色基团在230nm附近具有明显的吸收峰有关；此外，在275nm处还可观察到一较弱的吸收峰，结合氨基酸分析，这是由于分子内部仍含有少量的酪氨酸，存在共轭双键引起的；以上结果符合胶原蛋白的紫外吸收特征。
(2)SDS-PAGE电泳：采用不连续的Tris-甘氨酸电泳系统对纯化的胶原蛋白样品进行SDS-PAGE垂直电泳，分离胶浓度为8％，浓缩胶浓度为5％，浓缩胶电压80V，分离胶电压100V，电泳约1h，染色拍照，鳖背甲胶原蛋白的SDS-PAGE图谱如图5所示：
可以看出，海蜇胶原蛋白中主要含有一条135kDa左右的α-链，以及由α-链的分子内和分子间交联所形成的一些二聚体β-链和三聚体γ-链，由图可初步判断所提胶原蛋白为I型胶原蛋白，亚基结构为[a1(I)]3，符合水生胶原蛋白的结构特征。
(3)傅立叶红外扫描(FI-IR)：称取冷冻干燥后的纯化样品约2mg，加入适量干燥好的KBr混合后置于玛瑙研钵中研磨，当研磨物成细微粉末状后装样，手动压片，利用傅立叶变换红外扫描仪在400-4000cm-1区间内进行吸收波谱扫描，得到鳖背甲胶原蛋白在500～4000cm-1处的FTIR谱图如图6所示：
在酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ以及A、B带均可观察到明显的特征峰，说明鳖背甲胶原蛋白具有典型的胶原蛋白红外光谱特征吸收峰；当酰胺Ⅲ带的峰值与1400～1454cm-1范围内的峰值比例为1.0时，胶原蛋白的三螺旋结构是完整的，由图6知鳖背甲胶原蛋白酰胺Ⅲ带的波数为1238.08cm-1，其与1454cm-1谱带之间的峰值比约为1.0，说明所提胶原蛋白具有较完整的三螺旋结构。
综上所述，利用本发明所述的利用超声辅助从鳖背甲中脱钙提取胶原蛋白的工艺获得背甲胶原蛋白的紫光扫描符合胶原蛋白的紫外吸收特征、SDS-PAGE电泳结果符合水生胶原蛋白的结构特征、傅立叶红外扫描(FI-IR)结果证明具有好的完整性，相比传统的脱钙处理胶原蛋白具有明显的优点，为水产品加工副产物及其综合利用提供了重要的科学依据；
其中：以上(1)-(3)的所有试验至少进行三次，根据三次试验结果计算相应的标准偏差，结果以均值或均值标准偏差的形式表示。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.一种利用超声辅助从鳖背甲中脱钙提取胶原蛋白的工艺，其特征在于：将洁净的鳖背甲样品与盐酸按照料液比1:10-50的比例混合，在温度为15-38℃，超声功率为50-250w的环境下于水套杯中脱钙15-120min；脱钙结束后，离心收集上清液，冷冻干燥，获得背甲胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种利用超声辅助从鳖背甲中脱钙提取胶原蛋白的工艺，其特征在于：所述的鳖背甲需要预先经过破碎、冷冻干燥处理。
3.根据权利要求1所述的一种利用超声辅助从鳖背甲中脱钙提取胶原蛋白的工艺，其特征在于：所述的盐酸浓度为0.2-1.2mol/L。
4.根据权利要求3所述的一种利用超声辅助从鳖背甲中脱钙提取胶原蛋白的工艺，其特征在于：所述的盐酸浓度为0.812mol/mL。
5.根据权利要求1所述的一种利用超声辅助从鳖背甲中脱钙提取胶原蛋白的工艺，其特征在于：所述的温度为25.205℃。
6.根据权利要求1所述的一种利用超声辅助从鳖背甲中脱钙提取胶原蛋白的工艺，其特征在于：所述的料液比为1:52(g/mL)。
7.根据权利要求1所述的一种利用超声辅助从鳖背甲中脱钙提取胶原蛋白的工艺，其特征在于：所述的反应时间为63.166min。
8.根据权利要求1所述的一种利用超声辅助从鳖背甲中脱钙提取胶原蛋白的工艺，其特征在于：所述的超声功率为143.131w。
9.根据权利要求1所述的一种利用超声辅助从鳖背甲中脱钙提取胶原蛋白的工艺，其特征在于：所述的离心收集上清液的转速和时间分别为10000r/min和25min。
10.根据权利要求1所述的一种利用超声辅助从鳖背甲中脱钙提取胶原蛋白的工艺，其特征在于：鳖背甲的脱钙率为61.18％，得到的背甲胶原蛋白的胶原蛋白迁出率2.44％。
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