CN105969832A - 一种鲽鱼皮胶原蛋白粉的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鲽鱼皮胶原蛋白粉的制备方法，具体为将鲽鱼皮处理完成后，依次用水解蛋白酶和中性蛋白酶双酶分步酶解，最后得到的产物经浓缩和冷冻干燥即为鲽鱼皮胶原蛋白粉。本发明首次采用鲽鱼皮生产胶原蛋白粉，实现了鲽鱼皮资源的高值化利用，具体制备方法弥补了酸法、碱法和热水提取法的不足，克服了单酶酶解位点的不足，混合酶酶解相互干扰的缺点，得到了一种高纯度、高得率的鱼源胶原蛋白粉。
Description
技术领域
本发明涉及水产品加工领域，具体涉及一种高纯度鲽鱼皮胶原蛋白粉的制备方法。
背景技术
我国是水产品生产大国，2014年全国水产品总产量达6461.52万吨，其中，海水鱼类产量达118.97万吨，连续多年居世界第一位。虽然我国水产品产量占据如此高的份额，但与国外相比，我国水产品加工和综合利用程度较低。由于当前鱼类加工和综合利用技术不够纯熟，在鱼类加工过程中产生了约占鱼体50％～70％的加工副产物，这些问题成为了鱼类产品开发利用过程中面临的主要难题。若不对这些鱼类加工副产物进行有效的处理，不仅会造成环境的污染，还会造成资源的严重浪费，因此，因此，如何有效地利用这些鱼类加工副产物成为了当前科研工作者的研究热点。
据报道，鱼类加工副产物多限于加工成饲料鱼粉，提取鱼油(Glencross B,Blyth D,Irvin S,et al.An evaluation of the complete replacement of both fishmealand fish oil in diets forjuvenile Asian seabass,Lates calcarifer[J].Aquaculture,2016,451:298-309.)，生产皮革，制备调味料(Huynh H L,Danhi R,Yan S W.Using FishSauce as a Substitute for Sodium Chloride in Culinary Sauces and Effects onSensory Properties[J].Journal ofFood Science,2016,81(1):S150-S155.)等。然而随着水产行业的不断发展和人们生活质量的改善，这些低附加值的产品已不能满足人们对生活更高层次的追求，因此，亟待研究者从鱼类加工副产物中获取一种或多种高附加值的产品来满足人们的需求。
胶原蛋白(Collagen)是动物体内分布最广、含量最丰富的一种糖蛋白，由三条α-肽链相互缠绕而形成的螺旋结构的纤维状蛋白质，富含甘氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸等氨基酸；广泛存在于皮肤、骨骼、肌腱及韧带等组织和器官中，具有调节细胞、支撑器官和保护机体的功能。传统上，胶原蛋白主要来源于猪、牛等陆生动物的皮和骨骼，然而，随着牛海绵状脑病(BSE)、口蹄病(FMD)及传染性海绵状脑病(TSE)的爆发，人们对牲畜来源生产的胶原蛋白及其衍生产品安全性产生了一种忧虑。因此，科研工作者急于寻找一种新的富含胶原蛋白的原料来替代从陆源动物中提取的胶原蛋白，新的、安全的胶原蛋白资源的开发利用是当前要解决的首要问题。
研究表明，鱼类加工废弃物中鱼皮中含有丰富的胶原蛋白，是一种优质且资源丰富的蛋白质资源(Liu D,Liang L,Regenstein J M,et al.Extraction andcharacterisation of pepsin-solubilised collagen from fins,scales,skins,bones andswim bladders of bighead carp(Hypophthalmichthys nobilis)[J].Food Chemistry,2012,133(4):1441-1448.)。近年来，鱼胶原蛋白因其来源广、低抗原性、低过敏性和使用安全等特点倍受研究者的关注。鱼胶原蛋白逐渐替代了传统的胶原蛋白，为鱼类加工废弃物的高值化利用提供了一条新的途径。
鲽鱼是一种深海鱼，主要产于温带及寒带领域，是我国北方海域的主要经济鱼种之一，在鲽鱼加工废弃物鱼皮中胶原蛋白含量最高可占其蛋白质总量的80％左右，因此，鲽鱼皮是生产鱼胶原蛋白粉的良好原料。如果将这些鲽鱼皮加以综合利用，生产出高纯度的鱼胶原蛋白粉，用于食品、化妆品、保健品和医药原料等方面，将会取得重大的经济价值和理论意义。
目前关于鲽鱼皮胶原蛋白粉的研究鲜有报道，对于提取鱼胶原蛋白粉的方法往往是使用单一的提取方法，这样生产出来的产品不仅生产周期长、纯度低、得率低、色泽差和生产成本高等，且鱼皮的有效利用率较低。
发明内容
鉴于现有技术中存在的不足，本发明提供了一种以鲽鱼皮为原料，生产出一种高纯度、高得率的鱼胶原蛋白粉的方法。
具体的，本发明提供的鲽鱼皮胶原蛋白粉的制备方法，具体包括如下步骤：
S1：鲽鱼皮的制备
将新鲜的鲽鱼采用击晕处死，在冰上取下鲽鱼皮，剔除鲽鱼皮上残留的杂质，用水清洗干净，剪成0.5cm×0.5cm大小，在-20℃下贮藏备用，操作的全过程均在4±1℃下进行；
S2：鲽鱼皮的预处理
取一定量的鲽鱼皮，先用水冲洗3-5次，除去鲽鱼皮上残留的杂质，在4±1℃下，以料液比为1:10-15(w/v)的比例加入0.1-0.5mol/L的食用NaOH溶液，搅拌浸泡24h以除去鲽鱼皮中非胶原蛋白和色素，然后用冰水冲洗鲽鱼皮至中性，充分沥干后，以料液比为1:25-30(w/v)的比例加入10-15％的食用正丁醇，搅拌浸泡24h以除去鲽鱼皮中的脂肪，然后用冰水冲洗鲽鱼皮至中性，充分沥干，待酶解；
S3：鲽鱼皮的双酶酶解处理
将预处理后的鲽鱼皮，依次经过水解蛋白酶，中性蛋白酶进行双酶酶解处理，然后在95℃水浴灭酶10min，之后在4℃条件下10000r/min离心15-20min，取上清液，待盐析；
S4：盐析处理
向上清液中加入氯化钠溶液搅拌，至最终盐浓度为0.9-1.0mol/L，静置过夜，在4℃条件下5000r/min离心20-25min后，弃上清液，然后将沉淀溶于0.1-0.5mol/L的冰乙酸溶液中，随后在4℃条件下8000r/min离心20-25min除去不溶性杂质，待透析；
S5：透析处理
将盐析处理的产物先用0.1-0.5mol/L的冰乙酸溶液透析过夜，再用超纯水进行透析，每6h换一次超纯水，直到透析液中不存在银离子时，停止透析，待冷冻干燥；
S6：冷冻干燥处理
将透析处理的产物真空冷冻干燥，最终得到鲽鱼皮胶原蛋白粉。
优选地，S2中，食用NaOH溶液搅拌浸泡24h过程中，食用NaOH溶液每6h更换一次；食用正丁醇搅拌浸泡24h过程中，食用正丁醇溶液每6h更换一次。
优选地，S3中，所述水解蛋白酶为Alcalase 2.4L，所述中性蛋白酶为Neutrase 0.8L。
更优选地，S3中，加入蛋白酶的总质量为鲽鱼皮质量的0.1-0.5％，酶解温度为40-55℃，酶解时间2-4h。
优选地，S6中，采用Free Zone2.5真空冷冻干燥机进行冷冻干燥。
本发明提供的鲽鱼皮胶原蛋白粉的制备方法，具有以下有益效果：
(1)首次采用鲽鱼皮制备胶原蛋白粉，实现了鲽鱼皮资源的高值化利用；
(2)弥补了酸法、碱法和热水提取法，酶法克服了其得率低的问题；相对于单酶酶解，双酶酶解克服了酶解位点不足的难题；相比于混合酶解，双酶依次酶解充分发挥了各自的酶解效果，避免了混合酶解相互干扰的缺点；
(3)生产周期短、制得的产品纯度高、得率低、色泽较好，鱼皮的有效利用率高。
(4)鲽鱼皮为水产加工副产品，是提取胶原蛋白的优质蛋白质资源，且价格低、来源广泛；不仅利用废弃的鱼皮生产出高附加值的产品，变废为宝；还降低了环境的污染，具有重要的经济价值和社会意义。
附图说明
图1为本发明实施例提供的鲽鱼皮胶原蛋白粉的制备工艺流程图。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明以下实施例中所用到的试剂食用NaOH、食用正丁醇、氯化钠、食用冰乙酸为常规试剂，水解蛋白酶Alcalase 2.4L(吉宝青岛生物科技有限公司)、中性蛋白酶Neutrase 0.8L(吉宝青岛生物科技有限公司)均可在市场购买获得。
实施例1
将新鲜的鲽鱼采用击晕处死，在冰上取下鲽鱼皮，剔除鲽鱼皮上残留的碎肉和鱼鳞等杂质，用蒸馏水冲洗干净，用剪刀剪成0.5cm×0.5cm大小，在-20℃下贮藏备用，操作的全过程均在4±1℃下进行；
取一定量的鲽鱼皮，先用蒸馏水冲洗3次，除去鲽鱼皮上残留的杂质，4±1℃下，以料液比为1:10(w/v)的比例加入0.1mol/L的食用NaOH溶液，搅拌浸泡24h(食用NaOH溶液每6h更换一次)以除去鲽鱼皮中非胶原蛋白和色素，然后用冰水冲洗鲽鱼皮至中性，充分沥干后，以料液比为1:25(w/v)的比例加入10％的食用正丁醇，搅拌浸泡24h(食用正丁醇溶液每6h更换一次)以除去鱼皮中的脂肪，然后用冰水冲洗鱼皮至中性，充分沥干，待酶解；
将上述预处理后的鲽鱼皮，依次经过水解蛋白酶(Alcalase2.4L)、中性蛋白酶(Neutrase0.8L)进行双酶酶解处理，加入的水解蛋白酶和中性蛋白酶的量均为鲽鱼皮质量的0.1％，酶解温度为40℃，酶解时间2h；然后在95℃水浴灭酶10min，之后在4℃条件下10000r/min离心15min取上清液，待盐析；
向上述上清液中加入一定量的氯化钠溶液搅拌，至最终盐浓度为0.9mol/L。静置过夜，在4℃条件下5000r/min离心20min后弃上清液，然后将沉淀溶于0.1mol/L的食用冰乙酸溶液中，随后在4℃条件下8000r/min离心20min除去不溶性杂质，待透析；
将盐析处理的产物先用0.1mol/L的食用冰乙酸溶液透析过夜(每6h换一次透析液)，再用超纯水进行透析，每6h换一次超纯水，直到透析液中不存在银离子时，停止透析，待冷冻干燥；
将透析处理的产物在Free Zone2.5真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，最终得到一种高纯度、高得率的鲽鱼皮胶原蛋白粉。
具体的制备工艺流程见图1所示。
具体的，本实施例1制备得到的鲽鱼皮胶原蛋白粉的纯度为89.07±0.26％，得率为49.39±0.73％(以干重计)，白度为66.80±1.29。
其中：(1)纯度的测定方法如下：
纯度(％)＝胶原蛋白提取物中胶原蛋白的质量(g)/胶原蛋白提取物经冷冻干燥后的质量(g)
(2)得率的测定
胶原蛋白得率的计算方法如下公式：
得率(％)＝m1/m2其中m1表示冷冻干燥后胶原蛋白的质量(g)；m2表示鲽鱼皮的干重(g)。
(3)色泽的测定
采用Chroma Meter CR-400型号色差仪对胶原蛋白粉进行测定，记录相应的亮度值L*(lightness)、红绿值a*(redness/greenness)和黄蓝值b*(yellowness/blueness)每个样品平行测定三次。
白度值的计算公式如下：
白度＝100-[(100-L*)2+a*2+b*2]1/2
由此可见，本实施例1制备得到的鲽鱼皮胶原蛋白粉的得率为49.39±0.73％(以干重计)，相比于酸法36.35±0.56％(以干重计)；相比于文献报道(王雪蒙,于玮,马良,等.兔皮胶原蛋白的提取及其结构鉴定[J].食品与发酵工业,2016,42(4):209-213.)的纯度86.12±0.15％，明显得到了改善和提高，此外，本实施例1制备得到的鲽鱼皮胶原蛋白粉的的纯度为89.07±0.26％，纯度较高。
实施例2
将新鲜的鲽鱼采用击晕处死，在冰上取下鲽鱼皮，剔除鲽鱼皮上残留的碎肉和鱼鳞等杂质，用蒸馏水冲洗干净，用剪刀剪成0.5cm×0.5cm大小，在-20℃下贮藏备用，操作的全过程均在4±1℃下进行；
取一定量的鲽鱼皮，先用蒸馏水冲洗5次，除去鲽鱼皮上残留的杂质，4±1℃下，以料液比为1:15(w/v)的比例加入0.5mol/L的食用NaOH溶液，搅拌浸泡24h(食用NaOH溶液每6h更换一次)以除去鲽鱼皮中非胶原蛋白和色素，然后用冰水冲洗鲽鱼皮至中性，充分沥干后，以料液比为1:30(w/v)的比例加入15％的食用正丁醇，搅拌浸泡24h(食用正丁醇溶液每6h更换一次)以除去鱼皮中的脂肪，然后用冰水冲洗鱼皮至中性，充分沥干，待酶解；
取上述预处理后的鲽鱼皮，依次经过水解蛋白酶(Alcalase 2.4L)、中性蛋白酶(Neutrase 0.8L)进行双酶酶解处理，加入的水解蛋白酶和中性蛋白酶的量均为鲽鱼皮质量的0.5％，酶解温度为55℃，酶解时间4h；然后在95℃水浴灭酶10min，之后在4℃条件下10000r/min离心20min取上清液，待盐析；
向上述上清液中加入一定量的氯化钠溶液搅拌，至最终氯化钠浓度为1.0mol/L。静置过夜，在4℃条件下5000r/min离心25min后弃上清液，然后将沉淀溶于0.5mol/L的食用冰乙酸溶液中，随后在4℃条件下8000r/min离心25min除去不溶性杂质，待透析；
将盐析处理的产物先用0.5mol/L的食用冰乙酸溶液透析过夜(每6h换一次透析液)，再用超纯水进行透析，每6h换一次超纯水，直到透析液中不存在银离子时，停止透析，待冷冻干燥；
将透析处理的产物在Free Zone2.5真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，最终得到高纯度、高得率的鲽鱼皮胶原蛋白粉。
采用与实施例1相同的测试方法，测得实施例2制备得到的鲽鱼皮胶原蛋白粉的纯度为90.07±0.21％，得率为52.12±0.36％，白度为65.33±1.01。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，其保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内，本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (5)
1.一种鲽鱼皮胶原蛋白粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：鲽鱼皮的制备
将新鲜的鲽鱼采用击晕处死，在冰上取下鲽鱼皮，剔除鲽鱼皮上残留的杂质，用水清洗干净，剪成0.5cm×0.5cm大小，在-20℃下贮藏备用，操作的全过程均在4±1℃下进行；
S2：鲽鱼皮的预处理
取一定量的鲽鱼皮，先用水冲洗3-5次，除去鲽鱼皮上残留的杂质，在4±1℃下，以料液比为1:10-15的比例加入0.1-0.5mol/L的食用NaOH溶液，搅拌浸泡24h以除去鲽鱼皮中非胶原蛋白和色素，然后用冰水冲洗鲽鱼皮至中性，充分沥干后，以料液比为1:25-30的比例加入10-15％的食用正丁醇，搅拌浸泡24h以除去鲽鱼皮中的脂肪，然后用冰水冲洗鲽鱼皮至中性，充分沥干，待酶解；
S3：鲽鱼皮的双酶酶解处理
将预处理后的鲽鱼皮，依次经过水解蛋白酶，中性蛋白酶进行双酶酶解处理，然后在95℃水浴灭酶10min，之后在4℃条件下10000r/min离心15-20min，取上清液，待盐析；
S4：盐析处理
向上清液中加入氯化钠溶液搅拌，至最终盐浓度为0.9-1.0mol/L，静置过夜，在4℃条件下5000r/min离心20-25min后，弃上清液，然后将沉淀溶于0.1-0.5mol/L的冰乙酸溶液中，随后在4℃条件下8000r/min离心20-25min除去不溶性杂质，待透析；
S5：透析处理
将盐析处理的产物先用0.1-0.5mol/L的冰乙酸溶液透析过夜，再用超纯水进行透析，每6h换一次超纯水，直到透析液中不存在银离子时，停止透析，待冷冻干燥；
S6：冷冻干燥处理
将透析处理的产物进行真空冷冻干燥，最终得到鲽鱼皮胶原蛋白粉。
2.根据权利要求1所述的鲽鱼皮胶原蛋白粉的制备方法，其特征在于，S2中，食用NaOH溶液搅拌浸泡24h过程中，食用NaOH溶液每6h更换一次；食用正丁醇搅拌浸泡24h过程中，食用正丁醇溶液每6h更换一次。
3.根据权利要求1所述的鲽鱼皮胶原蛋白粉的制备方法，其特征在于，S3中，所述水解蛋白酶为Alcalase 2.4L，所述中性蛋白酶为Neutrase 0.8L。
4.根据权利要求3所述的鲽鱼皮胶原蛋白粉的制备方法，其特征在于，S3中，加入蛋白酶的总质量为鲽鱼皮质量的0.1-0.5％，酶解温度为40-55℃，酶解时间2-4h。
5.根据权利要求1所述的鲽鱼皮胶原蛋白粉的制备方法，其特征在于，S6中，采用Free Zone 2.5真空冷冻干燥机进行冷冻干燥。
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