CN108490185A - 一种胶原蛋白多肽粉的制备方法及其在免疫学中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种胶原蛋白多肽粉的制备方法，具体地，所述制备方法包括：除杂得到目标浆状物、蛋白酶水解、对酶解液进行盐析、离心后提取上清液、上清液透析纯化，干燥后得到胶原蛋白多肽粉、免疫反应测试。本发明适合大规模生产，且原料来源广，价格低廉，制备得到的胶原蛋白多肽粉具有免疫检测准确度高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种胶原蛋白多肽粉，具体地，涉及一种应用于免疫检测领域的猪皮胶原蛋白制备的胶原蛋白多肽粉。
背景技术
人们利用免疫学技术对药物、激素、蛋白、传染物进行快速精确地检测。在所有的免疫学方法中，被分析物和分析物之间都会有特异性的反应或者结合。这种特异性的反应大多指的是抗原作为被分析物，抗体或抗体片段作为分析物之间结合形成特异性结合配对，同一反应中，可能会有多个抗体或抗原互相反应。检测抗体抗原反应的方法有很多，一般是对抗体或者抗原进行标记，常用的标记技术有放射性同位素标记、色素标记、荧光素标记、酶标记或者特异性结合配体标记(生物素/链霉亲和素)。在非均相免疫检测中，分析物或者被分析物是被固定在固相载体上的。
在免疫检测中存在的主要问题是被检测样本中或者固相载体上的附属物质与被分析物或分析物发生了非特异性反应，引起背景信号升高，信号结果离散等现象，从而降低了检测结果的灵敏度和特异性。由于被测物的非特异性结合或样本中的其他物质的特异性结合，会引起的检测信号出现假阳性或假阴性，使得免疫结果出现较大的偏差，这可能会误导临床医生做出错误的治疗方案，耽误治疗时间，造成不可逆转的后果。尤其是ICU、急诊常用项目检测结果的准确性可能会直接影响抢救方案，威胁患者生命。因此，如何消除免疫检测中非特异性反应，确保结果的准确可靠，始终是免疫学检测中的难点。
之前的研究结果显示，各种蛋白、改性蛋白分子、蛋白聚合物能够降低在免疫反应中的非特异性结合。然而，可溶性蛋白粘度高且不稳定，加热至40℃后降至室温会使其变性成凝胶状；天然的蛋白的部分成分可能会对免疫检测过程产生负面的影响；化学改性的蛋白分子，尤其是酰化蛋白质被认为能够减少免疫检测中的非特异性结合，但是无法消除血浆中其他抗体所引起的假阳信号；也有研究利用聚合免疫球蛋白来降低类风湿因子的干扰，但在免疫检测中引入这种人免疫球蛋白多为抗体或抗体聚合物会引起背景信号提升，同时生产这种免疫球蛋白成本高工序复杂。
综上，本领域迫切需要开发一种兼具来源广泛、价格低廉、免疫检测准确度高等功能的胶原蛋白多肽粉。
发明内容
本发明的目的是开发一种兼具兼具来源广泛、价格低廉、免疫检测准确度高等功能的胶原蛋白多肽粉。
本发明的第一方面，提供了一种胶原蛋白多肽粉的制备方法，具体地，所述的方法包括步骤：
(a)提供一含有胶原蛋白多肽的组织作为原料；
(b)将所述含胶原蛋白多肽的组织进行切碎处理，从而形成小块状组织，其中所述小块状组织的大小为1-5mm3；
(c)对所述小块状组织进行浆化处理，形成浆状物；
(d)对所述浆状物进行去杂处理，从而获得经去杂的浆状物；
(e)对所述经去杂的浆状物进行酶解处理，从而获得酶解液；
(f)任选地对所述酶解液进行灭活处理，从而获得经灭活的酶解液；
(g)对所述经灭活的酶解液进行盐析处理，从而获得含胶原蛋白多肽的上清液；
(h)对所述上清液进行透析处理，从而获得经透析的上清液，其中所述透析处理采用截留分子量为3-7kDa的透析膜；
(j)对经透析的上清液进行干燥，从而获得所述的胶原蛋白多肽粉。
在另一优选例中，所述的组织选自皮肤、肌腱、角膜或其组合。
在另一优选例中，所述的组织选自猪皮。
在另一优选例中，所述的步骤(c)中，所述的浆化处理包括：将所述的小块状组织与盐溶液进行混合，形成第一混合物，并对所述第一混合物进行超声处理，从而形成所述的浆状物。
在另一优选例中，所述盐溶液选自氯化钠溶液、氯化钾溶液、氯化镁溶液或其组合。
在另一优选例中，所述盐溶液优选为氯化钠溶液。
在另一优选例中，所述的盐溶液浓度选自0.5-3wt％，较优地选自1-2.5wt％，最优选自1wt％。
在另一优选例中，所述盐溶液为2mol/L的氯化钠溶液。
在另一优选例中，所述的步骤(e)中，所述酶解处理包括：向所述经去杂的浆状物加入蛋白酶，所述的蛋白酶选自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶或其组合。
在另一优选例中，所述蛋白酶为：含有质量分数为80％的胃蛋白、含有质量分数为10％的木瓜蛋白酶、含有质量分数为10％的凝乳蛋白酶的蛋白酶组合。
在另一优选例中，所述的酶解处理中，蛋白酶和经去杂的浆状物的质量比为：7-13:1。
在另一优选例中，所述蛋白酶和经去杂的浆状物的质量比为10:1。
在另一优选例中，所述的盐析处理包括：向所述经灭活的酶解液加入盐或盐溶液，从而获得第二混合物，并对第二混合物进行离心，从而获得含胶原蛋白多肽的上清液。
在另一优选例中，所述盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁或其组合；
所述盐溶液选自氯化钠溶液、氯化钾溶液、氯化镁溶液或其组合。
在另一优选例中，所述盐优选为氯化钠。
在另一优选例中，所述盐溶液优选为氯化钠溶液。
在另一优选例中，所述的盐溶液浓度选自1-3mol/L，较优地选自1.5-2.5mol/L，最优选自2mol/L。
在另一优选例中，所述盐溶液为2mol/L的氯化钠溶液。
在另一优选例中，所述的步骤(j)中，所述的干燥包括：真空干燥、加热干燥、干燥剂干燥或其组合。
在另一优选例中，所述的干燥优选为真空干燥。
本发明的第二方面提供一种胶原蛋白多肽粉，且所述的胶原蛋白多肽粉具有选自下组的一个或多个特性：
(i)分子量分为10-17KD；
(ii)含盐量为2％-5％；
(iii)粉末呈乳白色；以及
(iv)粉末溶于水呈淡黄色。
本发明的第三发明，提供一种降低体外免疫检测的背景信号的方法，具体地，所述的方法包括步骤：在所述免疫检测中使用本发明的胶原蛋白多肽粉，从而降低体外免疫检测的背景信号。
在另一优选例中，所述的体外免疫检测是针对选自下组的样本：血浆样本、血液样本、血清样本、组织液或其组合。
在另一优选例中，所述的使用包括在所述样本中添加所述的胶原蛋白多肽粉。
在另一优选例中，所述的使用包括将所述的胶原蛋白多肽粉添加至一缓冲液中，形成含所述的胶原蛋白多肽粉的缓冲液，然后将所述缓冲液与所述样本进行混合。
在另一优选例中，所述的缓冲液选自下组：PBS缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液或其组合。
在另一优选例中，在所述缓冲液中，所述的胶原蛋白多肽粉的浓度为0.05-2wt％，较佳地0.1-1wt％。
在另一优选例中，所述的缓冲液与所述样本的混合体积比例为2-20:1。
在另一优选例中，所述的免疫检测采用选自下组的方法：双抗体夹心法、双抗原夹心法、间接法、竞争法、或捕获包被法。
在另一优选例中，所述的免疫检测用于检测选自下组的物质：脑利钠肽、心肌肌钙蛋白、肌酸激酶同工酶、肌红蛋白或其组合。
本发明的第四方面提供本发明所述的胶原蛋白多肽粉的用途，具体地，所述胶原蛋白多肽粉的用途在于用于制备一制剂，所述制剂用于降低体外免疫检测的背景信号。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1：不同缓冲液中，免疫反应的信号对比图。
图2：胶原蛋白多肽粉在在不同添加量下免疫反应的信号对比例。
图3：质量分数为0.8％trition X-100，和0.1mol/L PB的溶液中检测信号与真实信号相关性图。
图4：质量分数为0.75％的胶原蛋白多肽粉的0.8wt％trition X-100，和0.1mol/LPB缓冲液中检测信号与真实信号相关性图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种免疫检测准确度高等功能的胶原猪皮蛋白，本发明来源的猪皮可以替换为其他动物，如鸡、鸭、鸽等禽类动物，牛、羊、马等哺乳类动物的皮肤、肌腱、角膜等，利用猪皮制备的胶原蛋白多肽粉具有来源广泛、价格低廉、免疫检测准确度高等功能，在此基础上完成了本发明。
术语：
除非另有定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如文中所用，表述：“整体相关性约0.93”，包括0.92和0.94之间的全部值。
一种胶原蛋白多肽粉的制备方法，具体地，所述的方法包括步骤：
(a)提供一含有胶原蛋白多肽的组织作为原料；
(b)将所述含胶原蛋白多肽的组织进行切碎处理，从而形成小块状组织，其中所述小块状组织的大小为1-5mm3；
(c)对所述小块状组织进行浆化处理，形成浆状物；
(d)对所述浆状物进行去杂处理，从而获得经去杂的浆状物；
(e)对所述经去杂的浆状物进行酶解处理，从而获得酶解液；
(f)任选地对所述酶解液进行灭活处理，从而获得经灭活的酶解液；
(g)对所述经灭活的酶解液进行盐析处理，从而获得含胶原蛋白多肽的上清液；
(h)对所述上清液进行透析处理，从而获得经透析的上清液，其中所述透析处理采用截留分子量为3-7kDa的透析膜；
(j)对经透析的上清液进行干燥，从而获得所述的胶原蛋白多肽粉，且所述的干燥包括：真空干燥、加热干燥、干燥剂干燥及其组合。
在另一优选例中，所述的干燥包括：真空干燥、加热干燥、干燥剂干燥及其组合。
在另一优选例中，所述的干燥为真空干燥。
在另一优选例中，所述的组织选自皮肤、肌腱、角膜或其组合。
在另一优选例中，所述的组织选自猪皮。
在另一优选例中，所述的步骤(c)中，所述的浆化处理包括：将所述的小块状组织与盐溶液进行混合，形成第一混合物，并对所述第一混合物进行超声处理，从而形成所述的浆状物。
在另一优选例中，所述盐溶液选自氯化钠溶液、氯化钾溶液、氯化镁溶液或其组合。
在另一优选例中，所述盐溶液为氯化钠溶液。
在另一优选例中，所述的盐溶液浓度选自0.5-3wt％，较优地选自1-2.5wt％，最优选自1wt％。
在另一优选例中，所述盐溶液为2mol/L的氯化钠溶液。
在另一优选例中，所述的步骤(e)中，所述酶解处理包括：向所述经去杂的浆状物加入蛋白酶；
所述的蛋白酶选自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶或其组合。
在另一优选例中，所述蛋白酶为：含有质量分数为80％的胃蛋白、含有质量分数为10％的木瓜蛋白酶、含有质量分数为10％的凝乳蛋白酶的蛋白酶组合。
在另一优选例中，所述的酶解处理中，蛋白酶和经去杂的浆状物的质量比为：7-13:1。
在另一优选例中，所述蛋白酶和经去杂的浆状物的质量比为10:1。
在另一优选例中，所述的盐析处理包括：向所述经灭活的酶解液加入盐或盐溶液，从而获得第二混合物，并对第二混合物进行离心，从而获得含胶原蛋白多肽的上清液。
在另一优选例中，所述盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁或其组合；
所述盐溶液选自氯化钠溶液、氯化钾溶液、氯化镁溶液或其组合。
在另一优选例中，所述盐优选为氯化钠。
在另一优选例中，所述盐溶液优选为氯化钠溶液。
在另一优选例中，所述的盐溶液浓度选自1-3mol/L，较优地选自1.5-2.5mol/L最优选自2mol/L。
在另一优选例中，所述盐溶液为2mol/L的氯化钠溶液。
本发明的胶原蛋白多肽粉，典型地，所述的胶原蛋白多肽粉具有选自下组的一个或多个特性：
(i)分子量分为10-17KD；
(ii)含盐量为2％-5％；
(iii)粉末呈乳白色；以及
(iv)粉末溶于水呈淡黄色。
一种降低体外免疫检测的背景信号的方法，具体地，所述的方法包括：在所述免疫检测中使用本发明的胶原蛋白多肽粉，从而降低体外免疫检测的背景信号。
在另一优选例中，所述的体外免疫检测是针对选自下组的样本：血浆样本、血液样本、血清样本、组织液或其组合。
在另一优选例中，所述的使用包括在所述样本中添加所述的胶原蛋白多肽粉。
在另一优选例中，所述的使用包括将所述的胶原蛋白多肽粉添加至一缓冲液中，形成含所述的胶原蛋白多肽粉的缓冲液，然后将所述缓冲液与所述样本进行混合。
在另一优选例中，所述的缓冲液选自下组：PBS缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液或其组合。
在另一优选例中，在所述缓冲液中，所述的胶原蛋白多肽粉的浓度为0.05-2wt％，较佳地0.1-1wt％。
在另一优选例中，所述的缓冲液与所述样本的混合体积比例为2-20:1。
在另一优选例中，所述的免疫检测采用选自下组的方法：双抗体夹心法、双抗原夹心法、间接法、竞争法、或捕获包被法。
在另一优选例中，所述的免疫检测用于检测选自下组的物质：脑利钠肽、心肌肌钙蛋白、肌酸激酶同工酶、肌红蛋白或其组合。
一种胶原蛋白多肽粉的用途，典型地，用于制备一制剂，所述制剂用于降低体外免疫检测的背景信号。
本发明的主要优点包括:
(1)本发明所采用的原料来源广泛，价格低廉，有效成分高，拓宽了胶原蛋白多肽在生物学中的应用范围。
(2)本发明克服了蛋白及其衍生物应用于消除免疫反应非特异性结合问题的研究思路和方法，降低免疫检测临床样本中非特异性反应，降低反应的背景信号，避免假阳性和假阴性结果，解决了蛋白应用于免疫反应中所存在的背景信号升高和热稳定性问题。
(3)本发明方法操作简单，对设备要求低，适合工业化生产。
(4)本发明克服了蛋白及其衍生物应用于消除免疫反应非特异性结合问题的研究思路和方法，降低免疫检测临床样本中非特异性反应，降低反应的背景信号，避免假阳性和假阴性结果，解决了蛋白应用于免疫反应中所存在的背景信号升高和热稳定性问题。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
胶原蛋白多肽粉的制备：
(1)清洗去脂：称取100克猪皮，用2千克蒸馏水对猪皮进行清洗，将猪皮切成小块1mm3，加入400mL 1wt％氯化钠溶液进行浸泡超声溶解打碎成浆状物，去除猪皮中的杂蛋白和油脂。
(2)酶水解：用滤纸过滤上述混合物，将去除杂质的浆状物收集于250mL圆底烧瓶中，加入质量分数为80％的胃蛋白酶、质量分数为10％的木瓜蛋白酶、质量分数为10％的凝乳蛋白酶，蛋白酶和浆状物质量比为10:1，调整pH为5，放入搅拌器，室温(20-25℃)反应12小时。
(3)盐析：将上述酶解溶液加热至100度，边加热边搅拌，30分钟后冷却至室温，溶液无明显析出或呈凝胶状现象，加入2mol/L的氯化钠进行盐析，15000rpm离心10分钟收集上清液。
(4)纯化：将上清液装入截留分子量为10kDa的透析袋，用纯净水进行透析过夜，除去溶液中盐分，真空干燥后制成蛋白多肽粉。
本发明的蛋白多肽粉为淡黄色粉末，分子量为10kDa～17kDa，含盐量为2％-5％。
实施例1：
采用本发明的蛋白多肽粉利用双抗夹心法进行免疫检测，步骤包括：
(1)配制0.1M PB缓冲溶液、含0.2％牛血清白蛋白的0.1M PB缓冲液、含0.2％蛋白酪蛋白的0.1M PB缓冲液、含0.2％蛋白多肽的0.1M PB缓冲液。
(2)将脑利钠肽校准品母液稀释成以下浓度待用：0pg/mL、25pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、2500pg/mL；
(3)在0.5mL离心管中加入0.4μL荧光微球(5mg/mL)后，加入75μL上述缓冲液中的一种和25μL配好浓度的校准品；
(4)用移液枪反复吹打30s，取60μL混合液加入到试纸条上，反应900s后，将试纸条放置在荧光测试仪上读取结果；
(5)每个浓度平行测定三次，选用三次结果的平均值与校准品浓度绘制拟合曲线。
(6)取25μL含脑利钠肽的人血浆样本于0.5mL离心管中，加入0.4μL荧光微球(5mg/mL)和75μL上述缓冲液中的一种；
(7)用移液枪反复吹打30s，取60μL混合液加入到试纸条上，反应900s后，将试纸条放置在荧光测试仪上读取结果；
(8)将含脑利钠肽的人血浆样本检测值代入拟合曲线中计算检测浓度值，考察测定结果与参考结果的差异。
由图1可见，对比Sample1的真实值(即第一柱状)，用PB缓冲液稀释Sample1(即第二柱状)，其受样本干扰程度为19％；用含0.2％牛血清白蛋白的PB缓冲液稀释样本测试(即第三柱状)，此时样本中的干扰程度为22％；含0.2％酪蛋白的缓冲液使得样本的干扰程度减小到7％(即第四柱状)；而采用含0.2％蛋白多肽的缓冲液稀释样本(即第五柱状)，此时样本回算值与真实值差异最小，为-6％。
在Sample 2中，0.1M PB缓冲液中，检测信号(即第七柱状)出现了明显的假阳现象，检测值是真实值(即第六柱状)的19.3倍；在含0.2％牛血清白蛋白的PB缓冲液中(即第八柱状)，假阳现象有所缓解，信号受干扰程度较0.1M PB缓冲液下降了68％；在含0.2％酪蛋白的缓冲液中，信号受干扰程度下降的77％(即第九柱状)；含0.2％蛋白多肽的PB缓冲液中(即第十柱状)，检测信号最为接近真实值，受干扰程度下降了86％。
实施例2：
采用本发明的蛋白多肽粉利用双抗夹心法进行免疫检测，步骤包括：
(1)将蛋白多肽溶解于含0.2％牛血清蛋白的0.1M PB溶液，配制成0.2％、0.5％、1％的不同浓度的蛋白多肽缓冲液。
(2)将脑利钠肽校准品母液稀释成以下浓度待用：0pg/mL、25pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、2500pg/mL；
(3)在0.5mL离心管中加入0.4μL荧光微球(5mg/mL)后，加入75μL上述缓冲液中的一种和25μL配好浓度的校准品；
(4)用移液枪反复吹打30s，取60μL混合液加入到试纸条上，反应900s后，将试纸条放置在荧光测试仪上读取结果；
(5)每个浓度平行测定三次，选用三次结果的平均值与校准品浓度绘制拟合曲线。
(6)取25μL含脑利钠肽的人血浆样本于0.5mL离心管中，加入0.4μL荧光微球(5mg/mL)和75μL上述缓冲液中的一种；
(7)用移液枪反复吹打30s，取60μL混合液加入到试纸条上，反应900s后，将试纸条放置在荧光测试仪上读取结果；
(8)将含脑利钠肽的人血浆样本检测值代入拟合曲线中计算检测浓度值，考察测定结果与参考结果的差异。
由图2中，Sample 2检测结果显示蛋白多肽的含量越高，对假阳信号的抑制效果越好，消除了免疫反应中的非特异性结合，而Sample 1中随着蛋白多肽浓度升高，检测信号降低，1％蛋白多肽缓冲液中检测值低于真实值15％。
缓冲液会稀释抗原纯品制备标准曲线，蛋白多肽添加至缓释液中，增加蛋白多肽虽然会减小样本中杂质的干扰，但是对纯品标准曲线却是先减后增的效果，蛋白多肽最佳添加量需综合标准曲线和样本信号决定。
实施例3：
采用本发明的蛋白多肽粉利用双抗夹心法进行免疫检测，步骤包括：
将发明的蛋白多肽粉溶解于表面活性剂triton X-100 0.80wt％，0.1M PB缓冲溶液，且蛋白多肽含量0.75％，配制成实验组缓冲液：蛋白多肽0.75％，triton X-1000.80wt％，0.1M PB缓冲溶液；将心肌肌钙蛋白校准品母液稀释成以下浓度待用：0ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、20ng/mL，利用双抗夹心法进行免疫检测：
(1)在0.5mL离心管中加入0.4μL荧光微球(5mg/mL)后，加入75μL上述缓冲液中的一种和25μL配好浓度的校准品；
(2)用移液枪反复吹打30s，取60μL混合液加入到试纸条上，反应900s后，将试纸条放置在荧光测试仪上读取结果；
(3)每个浓度平行测定三次，选用三次结果的平均值与校准品浓度绘制拟合曲线。
(4)取25μL含心肌肌钙蛋白的人血浆样本于0.5mL离心管中，加入0.4μL荧光微球(5mg/mL)和75μL上述缓冲液中的一种；
(5)用移液枪反复吹打30s，取60μL混合液加入到试纸条上，反应900s后，将试纸条放置在荧光测试仪上读取结果；
(6)将含心肌肌钙蛋白的人血浆样本检测值代入拟合曲线中计算检测浓度值，考察测定结果与参考结果的差异。
(7)对照组缓冲液：表面活性剂triton X-100 0.80％，0.1M PB溶液数据。
表1：真实信号、对照组缓冲液检测信号和实验组缓冲液检测信号
该检测项目的正常人参考值在0.5ng/mL，采用对照组溶液测试18例样本，第3例出现明显的假阳，会指示临床医生做出不正确的临床判断，第11例出现信号偏低的情况，真实信号与检测信号的整体相关性约0.93(图3)，而采用实验组缓冲液测试18例样本信号，假阳和信号偏低情况解决，如图4所示，整体相关性约0.99。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种胶原蛋白多肽粉的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(a)提供一含有胶原蛋白多肽的组织作为原料；
(b)将所述含胶原蛋白多肽的组织进行切碎处理，从而形成小块状组织，其中所述小块状组织的大小为1-5mm3；
(c)对所述小块状组织进行浆化处理，形成浆状物；
(d)对所述浆状物进行去杂处理，从而获得经去杂的浆状物；
(e)对所述经去杂的浆状物进行酶解处理，从而获得酶解液；
(f)任选地对所述酶解液进行灭活处理，从而获得经灭活的酶解液；
(g)对所述经灭活的酶解液进行盐析处理，从而获得含胶原蛋白多肽的上清液；
(h)对所述上清液进行透析处理，从而获得经透析的上清液，其中所述透析处理采用截留分子量为3-7kDa的透析膜；
(j)对经透析的上清液进行干燥，从而获得所述的胶原蛋白多肽粉。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(c)中，所述的浆化处理包括：将所述的小块状组织与盐溶液进行混合，形成第一混合物，并对所述第一混合物进行超声处理，从而形成所述的浆状物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(e)中，所述酶解处理包括：向所述经去杂的浆状物加入蛋白酶。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的酶解处理中，蛋白酶和经去杂的浆状物的质量比为：7-13:1。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的盐析处理包括：向所述经灭活的酶解液加入盐或盐溶液，从而获得第二混合物，并对第二混合物进行离心，从而获得含胶原蛋白多肽的上清液。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述盐溶液选自氯化钠溶液、氯化钾溶液、氯化镁溶液或其组合。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(j)中，所述的干燥包括：真空干燥、加热干燥、干燥剂干燥及其组合。
8.一种使用权利要求1-7中任一项所述的制备方法制备的胶原蛋白多肽粉，其特征在于，所述的胶原蛋白多肽粉具有选自下组的一个或多个特性：
(i)分子量分为10-17KD；
(ii)含盐量为2％-5％；
(iii)粉末呈乳白色；以及
(iv)粉末溶于水呈淡黄色。
9.一种降低体外免疫检测的背景信号的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：在所述免疫检测中使用权利要求8所述的胶原蛋白多肽粉，从而降低体外免疫检测的背景信号。
10.一种权利要求8所述的胶原蛋白多肽粉的用途，其特征在于，用于制备一制剂，所述制剂用于降低体外免疫检测的背景信号。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN201810146920.2A CN108490185A (zh) | 2018-02-12 | 2018-02-12 | 一种胶原蛋白多肽粉的制备方法及其在免疫学中的应用 |
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| CN201810146920.2A CN108490185A (zh) | 2018-02-12 | 2018-02-12 | 一种胶原蛋白多肽粉的制备方法及其在免疫学中的应用 |
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Citations (5)
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| JPH0931100A (ja) * | 1995-07-24 | 1997-02-04 | Nippon Ham Kk | 変性コラーゲン及びその製造方法 |
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| CN103509081A (zh) * | 2012-06-28 | 2014-01-15 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种可保持活性的蛋白质顺序提取方法 |
| CN105393119A (zh) * | 2013-07-30 | 2016-03-09 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 用于免疫试验的多重封闭物珠 |
| CN105969832A (zh) * | 2016-07-26 | 2016-09-28 | 渤海大学 | 一种鲽鱼皮胶原蛋白粉的制备方法 |
-
2018
- 2018-02-12 CN CN201810146920.2A patent/CN108490185A/zh active Pending
Patent Citations (5)
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| 丛艳君，薛文通编著: "《活性蛋白质和肽的制备及在功能食品中的应用》", 30 April 2011, 北京：中国轻工业出版社 * |
| 李彦春 等: "酶解胶原蛋白多肽的制备与分析", 《中国皮革》 * |
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