CN103509081A - 一种可保持活性的蛋白质顺序提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可保持蛋白质活性的蛋白质顺序提取方法的建立及其在鹿茸活性蛋白质提取过程中的应用。基于多种溶剂提取可以获得更高提取效率及提取覆盖广度这一原理，选择四种生物相容性良好的提取溶剂；首先应用盐溶液提取水溶性蛋白质，匀浆液经离心后获得上清液作为组分1；然后应用酸性溶液提取残渣中碱性蛋白质，离心后得到上清液作为组分2；继续应用碱性溶液和丁醇水溶液依次对残渣进行提取，分别获得组分3和组分4。本发明的优点为：相对于单一溶剂提取法，本方法可以大大提高提取覆盖广度，同时可保持各提取组分中的蛋白质的活性。此外，由于各溶剂的提取选择性差异，在提取过程中还能实现蛋白质分级处理。
Description
技术领域
本发明涉及用于蛋白质活性检测及功能蛋白质组学研究的蛋白质提取方法，具体地说是一种基于多种非变性溶剂的顺序提取方法的构建。
背景技术
功能蛋白质组学研究是一个重要的研究方向，它是在生命体或细胞的整体水平上研究蛋白质的表达和修饰状态，重点研究那些可能涉及特定功能机制的蛋白质群。鹿茸作为哺乳动物唯一能够完整持续再生的器官，在较短时时期内可以产生大量的血管、神经、软骨等组织，被认为是研究组织生长调节机制的理想模型。以鹿茸为样品，建立可以保持活性的提取方法，并对提取得到的活性蛋白质进行功能蛋白质组学分析，对于认识鹿茸生长过程中发挥调节作用的功能蛋白质群，进而推动我国传统动物药的深入开发有积极意义。
在功能蛋白质研究中，如何在保持活性的条件下对蛋白质进行广泛的提取是需要解决的重要问题。在此过程能否全面地获得样品中含有的蛋白质并保持其活性，对于后续蛋白质分离纯化和活性筛选至关重要。由国内外的研究现状可知，目前可保持活性的蛋白质提取方法相对简单，通常只采用单一溶剂提取。例如，稀盐和缓冲盐溶液（pH值近中性）常被用于提取水溶性蛋白质；酸溶液对碱性蛋白质的提取效果较好，碱溶液对酸性蛋白质有较好的提取效果；丁醇和非离子型表面活性剂常用于提取提取疏水性蛋白质。我们知道，在提取过程中，所用溶剂的种类越多，得到的蛋白质成分就会越多。若采用多种溶剂顺序提取，就可以较全面的提取蛋白质。有研究表明，在对组织样品进行蛋白质组学研究时，采用顺序提取法可以大大提高鉴定的蛋白质数量，这是由于多种溶剂具有较好的互补性。不仅如此，我们在研究中还发现，采用顺序提取法对鹿茸蛋白质进行提取时，获得的多个组分具有明显不同的活性，提示顺序提取法在一定程度上具有样品预分级的功能。这是由于各种溶剂的选择性不同造成的。因此，选择生物相容性良好的溶剂，发展顺序提取方法，实现生物样品中蛋白质的广泛提取，对于功能蛋白质组学研究具有较大意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种活性蛋白质顺序提取方法，以期解决单一溶剂不能充分提取功能蛋白质的问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
根据离子强度、酸碱性和极性方面的差异，选择多种性质不同的非变性溶剂，对液氮研磨粉碎的样品粉末依次进行提前，获得多种活性蛋白质组分。将所得组分经超滤处理，浓缩、除盐的同时，获得分子量大于5000Da的蛋白质组分。
具体为：
1）样品的前处理
取新鲜动物组织样品，用生理盐水清洗，去除血液残留。切成2×2×2mm的颗粒，在液氮条件下进行研磨，得到动物组织粗粉（粒径在0.1-1mm）。
2）顺序提取过程
首先向粗粉中加入盐溶液（含有蛋白酶抑制剂），1g粗粉中加入盐溶液为4-10ml，超声处理40S，每10S间隔10S。然后冰上孵育30min。将所得匀浆液于10000-20000r/min条件下离心5-40min，取上清液，得提取液备用。重复提取2次，合并上清液作为提取物A。向残渣中加入酸性溶剂4-10ml，（含有蛋白酶抑制剂）。按上述操作获得组分B。向残渣中加入碱性溶剂4-10ml，（含有蛋白酶抑制剂）。按上述操作获得组分C。向残渣中加入疏水性溶剂4-10ml（含有蛋白酶抑制剂）。按上述操作获得组分D。
3）活性蛋白质浓缩
将各提取液置于超滤离心管中（截留分子量为5000），在500-5000r/min范围内离心30min-6h。将过滤得到的除盐的浓缩液，冷冻干燥后置于-80℃冰箱保存，待用。
本发明的优点为：(1)多种提取溶剂可以较广泛的提取蛋白质；(2)顺序提取过程可以实现初步分级效果。
附图说明
图1顺序提取法获得各组分的蛋白质组学分析结果；
图2顺序提取法获得各组分的活性考察结果；
具体实施方式
将采收的动物组织经真空泵抽净残留的鹿血，用生理盐水清洗，去除血液残留。切成2×2×2mm的颗粒，在液氮条件下进行研磨，得到动物组织粗粉（粒径在0.1-1mm）。
首先向粗粉中加入盐溶液（含有蛋白酶抑制剂），1g粗粉中加入盐溶液为4-10ml，超声处理40S，每10S间隔10S。然后冰上孵育30min。将所得匀浆液于10000-20000r/min条件下离心5-40min，取上清液，得提取液备用。重复提取2次，合并上清液作为提取物A。向残渣中加入酸性溶剂4-10ml，（含有蛋白酶抑制剂）。按上述操作获得组分B。向残渣中加入碱性溶剂4-10ml，（含有蛋白酶抑制剂）。按上述操作获得组分C。向残渣中加入疏水性溶剂4-10ml（含有蛋白酶抑制剂）。按上述操作获得组分D。
将各提取液置于超滤离心管中（截留分子量为5000），在500-5000范围内离心30min-6h。将过滤得到的除盐的浓缩液，冷冻干燥后置于-80℃冰箱保存，待用。
应用例1
一种从鹿茸中提取活性蛋白质的顺序提取方法
将新采收的鹿茸经真空泵抽净残留的鹿血，用生理盐水清洁鹿茸表面并用75％酒精消毒。将鹿茸组织切片，用生理盐水清洗出去血液残留，在液氮条件下进行研磨，得到鹿茸粗粉（粒径在0.1-1mm）。
首先向鹿茸粗粉中加入盐溶液（含有蛋白酶抑制剂），1g粗粉中加入盐溶液为4-10ml，超声处理40S，每10S间隔10S。然后冰上孵育30min。将所得匀浆液于10000-20000r/min条件下离心5-40min，取上清液，得提取液备用。重复提取2次，合并上清液作为提取物A。向残渣中加入酸性溶剂4-10ml，（含有蛋白酶抑制剂）。按上述操作获得组分B。向残渣中加入碱性溶剂4-10ml，（含有蛋白酶抑制剂）。按上述操作获得组分C。向残渣中加入疏水性溶剂4-10ml（含有蛋白酶抑制剂）。按上述操作获得组分D。
将各提取液置于超滤离心管中（截留分子量为5000），在3000×g条件下离心3h。将过滤得到的除盐的浓缩液，冷冻干燥后置于-80℃冰箱保存，待用。
参照文献（Liang Gao，Journal of Chromatography B，2010，878，3370-3374）对所得各组分进行蛋白质组学分析，结果如图1所示。
参照文献（Bruneel,A，Proteomics，15，3876-3884.）对后所得各组分进行促人脐静脉内皮细胞增殖试验，结果如图2所示。
图1顺序提取法获得各组分的蛋白质组学分析结果；结果显示：从顺序提取法得到的各组分中，共鉴定到1221个蛋白质。各组分都含有大量的独有蛋白质（占总数的46.7％），说明各种溶剂可以对样品中含有的蛋白质进行较好的分级提取。
图2顺序提取法获得各组分的活性考察结果；结果显示：溶剂3具有较明显的促进HUVEC增殖活性，相对于空白组，可达到138％的增殖率。
应用例2
一种从鹿心中提取活性蛋白质的顺序提取方法
将收集的鹿心经生理盐水清洗，去除血液残留。切成2×2×2mm的颗粒，在液氮条件下进行研磨，得到动物组织粗粉（粒径在0.1-1mm）。
首先向心粗粉中加入盐溶液（含有蛋白酶抑制剂），1g粗粉中加入盐溶液为4-10ml，超声处理40S，每10S间隔10S。然后冰上孵育30min。将所得匀浆液于10000-20000r/min条件下离心5-40min，取上清液，得提取液备用。重复提取2次，合并上清液作为提取物A。向残渣中加入酸性溶剂4-10ml，（含有蛋白酶抑制剂）。按上述操作获得组分B。向残渣中加入碱性溶剂4-10ml，（含有蛋白酶抑制剂）。按上述操作获得组分C。向残渣中加入疏水性溶剂4-10ml（含有蛋白酶抑制剂）。按上述操作获得组分D。
将各提取液置于超滤离心管中（截留分子量为5000），在3000×g条件下离心3h。将过滤得到的除盐的浓缩液，冷冻干燥后置于-80℃冰箱保存，待用。
Claims (9)
1.一种可保持活性的蛋白质顺序提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将动物组织除净残留的血液；
2)将组织切片，用生理盐水清洗出去血液残留，在液氮条件下进行研磨，得到粗粉，粒径在0.1-1mm，向其中加入盐溶液；粗粉1g所需盐溶液4-10ml；
3)超声处理20-90S，每超声5-10S、间隔停止5-10S；然后室温冰上孵育10-60min；得匀浆液；
4)将步骤3）所得匀浆液于10000-20000r/min条件下离心5-40min，取上清液，得提取液备用；
5)重复步骤3）和步骤4）2-4次，将所得提取液合并作为提取物A；
6)向步骤5）所得残渣中加入酸性溶剂；残渣1g所需酸性溶剂4-10ml；按步骤3）至步骤5）操作，获得提取液B；
7)向步骤6）所得残渣中加入碱性溶剂；残渣1g所需碱性溶剂4-10ml；按步骤3）至步骤5）操作，获得提取液C；
8)向步骤7）所得残渣中加入疏水性溶剂；残渣1g所需疏水性溶剂4-10ml；按步骤3）至步骤5）操作，获得提取液D；
9)将提取液A、B、C、D分别置于超滤离心管中，截留分子量为3000-10000，在500-5000r/min范围内离心30min-6h；
10)将过滤得到的浓缩液冷冻干燥，收集后置于-80℃冰箱保存，获得4种蛋白质产品。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
盐溶液为下列溶剂中的一种，氯化钠溶液、磷酸缓冲溶液或PBS溶液；浓度范围在50mM-500mM之间，pH为6-8。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
酸性溶剂为下列溶剂中的一种，醋酸-醋酸钠缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液或磷酸缓冲溶液；浓度范围在50mM-500mM之间，pH为2-5。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
碱性溶剂为下列溶剂中的一种，Tris-HCl缓冲溶液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶；浓度范围在50mM-500mM之间，pH为9-12。
5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
疏水性溶剂为下列溶剂中的一种，丁醇水溶液、去氧胆酸钠、charps或TritonX-100；浓度范围在0.5-10％之间。
6.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
提取过程均在4℃条件下进行。
7.按照权利要求1、2、3、4或5所述的制备方法，其特征在于：于所述的盐溶液、酸性溶剂、碱性溶剂、疏水性溶剂中均含有蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂下列物质中的几种构成的混合物：AEBSF、Aprotinin、Bestatin、Sodium Pyrophosphate、E-64、EDTA、Leupeptin、Pepstatin A、PMSF，浓度范围在1-200mg/ml之间。
8.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述动物组织为肌肉组织和/或软骨组织。
9.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述动物组织为鹿茸时，其步骤1）如下：
1）将动物组织经真空泵抽净残留的鹿血，用生理盐水清洁鹿茸表面并用75％酒精消毒；将鹿茸组织切片，用生理盐水清洗出去血液残留，在液氮条件下进行研磨，得到鹿茸粗粉，粒径在0.1-1mm，向鹿茸中加入盐溶液。
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