DK166806B1

DK166806B1 - Anvendelse af plantepollenekstrakter til fremstilling af farmaceutiske, tumorcellevaeksthaemmende praeparater

Info

Publication number: DK166806B1
Application number: DK445686A
Authority: DK
Inventors: Ari Lewenstein; Fouad K Habib
Original assignee: Cernitin Sa
Priority date: 1985-09-20
Filing date: 1986-09-17
Publication date: 1993-07-19
Also published as: ATE74761T1; EP0220453A3; DE3684868D1; DK445686A; EP0220453A2; DK445686D0; US4952399A; EP0220453B1

Description

DK 166806 B1

Opfindelsen angår anvendelsen af pollen-ekstrakter til fremstilling af farmaceutiske præparater, der hæmmer væksten af tumorceller samtidig med, at de stimulerer stofskifteprocesser i sunde celler.

5 I faglitteraturen er beskrevet et stort antal ak tive stoffer, der hæmmer væksten af tumorceller eller dræber tumorceller eller leukæmiceller. Disse aktive stoffer fører imidlertid i almindelighed også hos sunde celler til en vis hæmning af væksten, idet dog denne 10 væksthæmning er betydeligt mindre end væksthæmningen hos kræftcellerne.

Den foreliggende opfindelse har haft til opgave at tilvejebringe et farmaceutisk præparat, der hæmmer væksten af tumorceller, samtidigt med at det stimulerer 15 stofskifteprocesserne i sunde celler.

Det viste sig overraskende, at ekstrakter vundet fra plantepollen med vandige ekstraktionsmidler, eller på aminosyrer og/eller peptider og/eller proteinagtige stoffer berigede fraktioner af disse pollenekstrakter 20 hæmmer væksten af tumorceller og samtidigt stimulerer stofskifteprocesserne i sunde celler.

I litteraturen er beskrevet et stort antal cyto-statica, og nogle af disse produkter er også tidligere benyttet til kemoterapeutisk behandling af tumorer. Der 25 kan i denne sammenhæng henvises til publikationen af Pirwitz "Grundlagen und Praxis chemischer Tumorbehand-lungen", Berlin, Springer, 1954.

En væsentlig ulempe ved de fleste hidtil kendte, til kræftbehandling anvendte midler består i, at de ikke 30 blot hæmmer væksten af kræftcellerne, men også virker toxisk på sunde celler. Der er tidligere gennemført mange arbejder med henblik på til kemoterapi af tumorer at finde midler, der ikke udviser nævnte ulempe. Eksempelvis er der i publikationen af B. Kellner et al., 35 "Naturwissenschaft", 1955, side 582 og 583, beskrevet DK 166806 B1 2 cytostatiske midler, der er baseret på allerede tidligere til kemoterapi af tumorer anvendte midler, såsom på nitrogen-sennepsgas, idet toxiciteten af disse midler er formindsket ved en kemisk binding til sukker, såsom til 5 D-mannit. I rødderne af visse berberisvækster er fundet mitosehæmmende stoffer, der er opbygget af glycosidrest-er og en flerkernet aglucon udvisende aromatiske rester og cycloaliphatiske rester. Der kan i denne sammenhæng henvises til publikationen af A. Stoll et al., Helv.

10 Chirn. Acta Nr. 37, side 1747-1762, 1954.

Endvidere kendes fremgangsmåder til fremstilling af ekstrakter af plantepollen, og der kan i denne sammenhæng for eksempel henvises til i tysk patentskrift nr. 1 467 750 og østrigsk patentskrift nr. 255 643 be-15 skrevne fremgangsmåder. Ifølge disse fremgangsmåder er det lykkedes at vinde pollenekstrakter, der er frie eller i det væsentlige frie for højmolekylære proteiner fra pollenkappen, der kan fremkalde allergier. Ved de beskrevne fremgangsmåder blev pollen ekstraheret med et 20 vandigt ekstraktionsmiddel, derefter blev der podet med en svamp af slægten Mucor, og i nærværelse af denne svamp blev de høj molekylære proteiner nedbrudt til lavmolekylære proteiner eller aminosyrer. Endelig blev det vandige medium fraskilt og tørret, og pollenresten blev 25 ekstraheret yderligere med et ikke-vandigt medium, og også denne anden ekstrakt blev udvundet.

De ved disse kendte fremgangsmåder med det vandige ekstraktionsmiddel og det ikke-vandige ekstraktionsmiddel vundne pollenekstrakter og også blandinger 30 deraf er kommercielt tilgængelige, og de benyttes som styrkende midler, til behandling af prostatalidelser, til fremme af sårheling og knoglebrudsheling og som betændelseshæmmende middel.

I den ikke til teknikkens stade hørende europæi-35 ske patentansøgning 86-106 017.6 (svarende til europæisk offentliggørelsesskrift nr. 201.053) er endvidere be- DK 166806 B1 3 skrevet en fremgangsmåde til fremstilling af et farmaceutisk præparat til forebyggende behandling af allergier, hvilket præparat som aktivt stof indeholder en med vandige ekstraktionsmidler eller med ikke-vandige eks-5 traktionsmidler vundet pollenekstrakt.

Det har nu overraskende vist sig, at en med et vandigt ekstraktionsmiddel vundet ekstrakt fra plante-pollen hæmmer væksten af tumorceller og samtidigt stimulerer stofskifteprocesserne i sunde celler.

10 Den foreliggende opfindelse angår anvendelse af plantepollenekstrakter til fremstilling af farmaceutiske præparater, der hæmmer væksten af tumorceller samtidig med, at de stimulerer stofskifteprocesserne i sunde celler, hvorhos denne anvendelse er ejendommelig ved, at 15 der anvendes en med vandige ekstraktionsmidler fra plan-tepollen vundet ekstrakt, hvorhos denne ekstrakt højst indeholder 5 vægt% højmolekylære proteiner eller er fri for sådanne.

Foretrukne ekstrakter, der ifølge opfindelsen an-20 vendes til fremstilling af de farmaceutiske præparater til bekæmpelse af tumorceller, er tørre ekstrakter, der udviser et vandindhold på under 12 vægt% baseret på ekstraktens totalvægt, og som indeholder mindst 70 vægt% carbonhydrater, 5-12 vægt% aminosyrer og/eller peptider 25 samt vandopløselige vitaminer fra B-gruppen.

Til testning af den hæmmende virkning, som plan-tepollenekstrakterne udøver på kræftceller, blev der udtaget et stort antal celler, såsom humane strubehovedkræftceller, humane leverkræftceller, blærekræftceller, 30 prostatakræftceller, testikelkræftceller og humane brystkræftceller, og der blev også testet leukæmiceller. Cellernes overlevelsesrate blev bestemt ved en tælling af cellerne ved kulturens start og efter en bestemt dyrkningsfase.

35 Ved forsøgene til brug ved sammenligning blev de pågældende cellekulturer dyrket uden tilsætning af de DK 166806 B1 4 med vandige ekstraktionsmidler vundne plantepolleneks-trakter.

Ved forsøgene til bestemmelse af hæmningen af tumorcellernes vækst blev der efter en indledende dyrk-5 ningsfase tilsat den med de vandige ekstraktionsmidler vundne plantepollenekstrakt.

I alle tilfælde blev der før tællingerne foretaget farvninger med trypanblåt, hvorved de døde celler blev farvet.

10 Det viste sig overraskende, at der ved nogle ar ter af de testede kræftceller straks efter tilsætningen af de ifølge opfindelsen ud fra plantepollenekstrakter fremstillede præparater blev konstateret en ringe stigning i celletallet for kræftcellerne. I disse tilfælde 15 fulgte imidlertid efter en fortsat behandling på to eller flere dage der-efter et fald i antallet af de levende kræftceller i kulturen. Hos nogle af de testede kræftceller fulgte straks efter tilsætningen af de ifølge opfindelsen ud fra plantepollenekstrakter fremstille-20 de præparater et fald i antallet af de levende kræftceller sammenlignet med kontrolforsøgene, der blev dyrket videre uden tilsætning af disse ekstrakter.

Særligt stærkt viste den væksthæmmende virkning af de ifølge opfindelsen ud fra plantepollenekstrakter 25 fremstillede præparater sig at være på væksten af leukæmiceller. I dette tilfælde blev i kulturerne straks efter tilsætningen af de ifølge opfindelsen ud fra plantepollenekstrakter fremstillede præparater væksten af leukæmicellerne hæmmet, og fra den anden dag af behandlin-30 gen kunne der ikke længere påvises levende leukæmiceller.

Ved de øvrige testede celler kunne der konstateres en tydelig hæmning af cellevæksten ved tilsætning af de ifølge opfindelsen ud fra plantepollenekstrakter 35 fremstillede præparater. Resultaterne for de øvrige testede kræftceller var nogenlunde de samme, dvs. der kun- DK 166806 B1 5 ne overalt konstateres tydelige væksthæmninger, men en øjeblikkelig dræbning af alle levende kræftceller allerede på den anden dag efter behandlingen kunne kun konstateres ved leukæmiceller.

5 Det kunne endvidere påvises, at tilsvarende cel lekulturer, der indeholdt sunde humane celler, for eksempel sunde humane prostataceller eller sunde humane brystceller, ved tilsætning af de ifølge opfindelsen ud fra pollenekstrakter fremstillede præparater, ikke blev 10 hæmmet i deres vækst, og at der endog kunne konstateres en forøget vækst sammenlignet med tilsvarende kontrolprøver uden tilsætning af pollenekstrakter.

Af disse forsøgsresultater fremgår således, at de med vandige ekstraktionsmidler vundne plantepolleneks-15 trakter indeholder aktive stoffer, der specifikt hæmmer væksten af kræftceller, men stimulerer stofskifteprocesserne i sunde celler, og at disse pollenekstrakter er særligt aktive over for leukæmiceller, idet de i løbet af kort tid fører til en dræbning af samtlige leukæmi-20 celler.

Plantepollenekstrakten vindes fortrinsvis ved, at tørrede plantepollen ekstraheres med et vandigt ekstraktionsmiddel indeholdende vand og et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel, og de tilstedeværende højmo-25 lekylære proteiner derefter ved indvirkning af mikroorganismer nedbrydes, fuldstændigt eller indtil et maksimalindhold på 5 vægt% baseret på tørvægten, til lavmolekylære proteiner eller aminosyrer, hvorefter det vandige medium fraskilles fra pollenresten og inddampes i vaku-30 um, således at den aktive stofblanding bliver tilbage i form af et gullighvidt produkt.

De ved denne fremgangsmåde vundne, i fast form foreliggende produkter udviser i almindelighed et vandindhold på under 12 vægt%, og de indeholder, baseret på 35 totalvælgten, mindst 70% carbonhydrater og 5-12% aminosyrer, peptider eller proteinagtige stoffer, samt endvi- DK 166806 B1 6 dere vandopløselige vitaminer fra B-gruppen. Askeindholdet i disse præparater er relativt højt og tyder på et stort indhold af mineralstoffer.

Den kemiske undersøgelse af typiske, på denne 5 måde vundne præparater gav følgende værdier:

Bestanddel_Mængde i væqt%_

Vand 5 - 10

Nitrogen 2,5 10 Aske 4,5

Aminosyrer, proteiner og pro- inagtige stoffer 6 - 9

Frit phosphat 0,8 - 1,4

Carbonhydrater 78 15 Sukkerbestanddele_5 - 10_ Tørproduktet indeholdt endvidere 7,5 yg vitaminer B2 pr. gram og 60 yg vitamin B3 pr. gram.

Undersøgelsen af de mineralske bestanddele i de 20 med de vandige ekstraktionsmidler ved den omhandlede fremgangsmåde vundne ekstrakter gav følgende værdier:

Bestanddel_Mængde i ppm_

Ca 56 25 P 58

Mg 11

Na 250

Fe 18

Zn 2,3 30 Cu 5

Al_12_

Også ekstrakternes sukkerbestanddele blev undersøgt nærmere, og der kunne deri konstateres arabinose, 35 galactose, mannose og glucose, alle i mængder fra spormængder op til 4% eller mere.

7 DK 166306 ΒΊ

Aktiviteten af de med de vandige ekstraktionsmidler vundne pollenekstrakter, der stimulerer stofskifteprocesserne i sunde celler, blev bestemt ved hjælp af in vitro-forsøg. Hertil blev den cycliske adenosin-mono-5 phosphat-test, forkortet c-AMP-test, gennemført. Til denne test blev benyttet høj rensede Leydigceller i en koncentration på 105 celler/ml. c-AMP-testen udgør en deficitmodel, ved hvilken forud ældede celler, i dette tilfælde 24 timer ved 6°C, stimuleres med et peptidhor-10 mon, HCG, og c-AMP-produktionen undersøges radioimmunologisk. Hvis der ved tilførslen af det substrat, der skal undersøges, sker en stimulation af c-AMP-produktionen, må dette substrat indeholde stoffer, der ophæver deficiter fremkommet gennem ældningsprocessen og således 15 bevirker en stimulation af cellestofskiftet.

Det viste sig, at de ved den omhandlede fremgangsmåde til fremstilling af farmaceutiske præparater anvendte pollenekstrakter fremkalder en tydelig akkumulering af c-AMP-produktionen sammenlignet med tilsvaren-20 de teste, hvortil der ikke er benyttet sådanne pollenekstrakter.

Den nævnte test blev også, i stedet for på høj-rensede Leydigceller, foretaget på tilsvarende prostata-celler, og i dette tilfælde kunne der konstateres analo-25 ge resultater.

De vandige ekstraktionsmidler, der anvendes til fremstilling af pollenekstrakterne, er fortrinsvis blandet med en vægtmæssig mindre andel af et fuldstændigt vandblandbart organisk opløsningsmiddel. Eksempler på 30 sådanne opløsningsmidler er lavere alkoholer eller lavere ketoner, såsom ethanol eller acetone. Det anvendte vandige ekstraktionsmiddel udviser i almindelighed et indhold på 2-30% af det med vand blandbare organiske opløsningsmiddel, idet resten til 100 vægt% består af 35 vand, fortrinsvis af destilleret vand.

Som eksempler på godt egnede vandige ekstraktionsmidler kan nævnes en 20%'s vandig opløsning af ethanol eller en 5%'s vandig opløsning af acetone.

DK 166806 B1 8

Efter denne forekstraktionsbehandling tilsættes mikroorganismer, og pollen'et får lov at forblive i det vandige ekstraktionsmiddel under omrøring i yderligere 36-60 timer ved en temperatur på 15-35°C. I løbet af 5 dette tidsrum foregår fermenteringen af de ydre pollenkapper. Mikroorganismerne nedbryder de højmolekylære proteiner til lavmolekylære proteiner eller frie aminosyrer.

Som allergen virkende bestanddele, der kan være 10 indeholdt i de som udgangsmateriale anvendte pollen, er højmolekylære proteiner. Disse bliver ved nævnte indvirkning af mikroorganismerne i det mindste nedbrudt så vidt, at det efter fermentationen vundne produkt ikke viser nogen allergen aktivitet.

15 Som mikroorganismer anvendes til gennemførelse af fermentationen med fordel svampe. Svampe, der er velegnede til denne fermentation, er svampe af slægten Mucor.

Som eksempel på sådanne svampe, der bevirker nedbrydning af de højmolekylære proteiner, kan nævnes Mucor glome-20 rata, Mucor luteus, Mucor mucedo, Mucor flavus, Mucor corticolus, Mucor brunneus, Mucor hiemalis eller Mucor alpinus.

Efter denne fermentationsbehandling gennemføres en filtrering. Filtratet er en klar opløsning. Fra •25 dette filtrat afdampes det vandige medium i vakuum, hvorved vindes en tilsvarende pollenekstrakt i form af et gullighvidt produkt. Denne aktive stofblanding, der i almindelighed har den ovenfor nævnte sammensætning, benyttes ifølge opfindelsen til fremstilling af det 30 farmaceutiske præparat, dér hæmmer væksten af tumorceller og stimulerer stofskiftet i sunde celler. Hvad angår valg af plantepollen og yderligere enkeltheder ved fremgangsmåden til fremstilling af den med vandige ekstraktionsmidler vundne pollenekstrakt skal henvises til, 35 hvad der allerede findes angivet i det tyske offentliggørelsesskrift nr. 1 467 750 og det østrigske patent- DK 166806 B1 9 skrift nr. 255 643. Endvidere er der også i den ikke til teknikkens stade hørende europæiske patentansøgning 86-106 017.6 (svarende til europæisk offentliggørelses- . skrift nr. 201.053) en nærmere omtale af fremgangsmåden 5 til fremstilling af pollenekstrakter under anvendelse af vandige ekstraktionsmidler, og deri er også beskrevet en fremgangsmåde til fremstilling af pollenekstrakter under anvendelse af ikke-vandige ekstraktionsmidler. Det skal imidlertid bemærkes, at kun de med de vandige ekstrak-10 tionsmidler vundne pollenekstrakter indeholder aktive stoffer, der hæmmer væksten af tumorcellerne, hvorimod en sådan aktivitet ikke har kunnet påvises hos de med de ikke-vandige ekstraktionsmidler vundne pollenekstrakter.

Ud fra de med de vandige ekstraktionsmidler frem-15 stillede pollenekstrakter, der vandtes i form af det gullighvide produkt, blev der derefter fremstillet fraktioner, der var beriget på aminosyrer og/eller peptider og/eller proteinagtige stoffer.

Et særligt fordelagtigt præparat er derfor en på 20 aminosyrer og/eller peptider og/eller proteinagtige stoffer beriget fraktion fra en med vandige ekstraktionsmidler vundet pollenekstrakt, hvilken fraktion højst indeholder 5 vægt% højmolekylære proteiner eller er fri for sådanne.

25 Især foretrækkes en på de proteinagtige stoffer, peptiderne eller aminosyrer beriget fraktion ud fra pollenekstrakten, hvor det gullighvide pulver først opløstes i et egnet opløsningsmiddel, fortrinsvis i vand eller en blanding af vand og et med vand blandbart opløs-30 ningsmiddel, og denne opløsning blev derefter underkastet søjlechromatografisk opdeling. Det blev tilsigtet at opfange de fraktioner, hvori der ved ninhydrin-testen blev påvist tilstedeværelse af aminosyrer og/eller peptider og/eller proteinagtige stoffer.

35 Den søjlechromatografiske opdeling kan med fordel gennemføres under anvendelse af en med Sephadex® fyldt søjle.

DK 166806 B1 10 I stedet for søjlechromatografi blev der udviklet en yderligere fremgangsmåde til ud fra de omhandlede vandige pollenekstrakter at fremstille en fraktion, der er beriget på peptider og/eller proteinagtige stoffer 5 og/eller aminosyrer. Ved denne udførelsesform for den omhandlede fremgangsmåde bliver det gullighvide produkt opløst i vand, der tilsættes et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel og eventuelt yderligere en organisk syre, hvorved opløseligheden af peptiderne og/eller 10 proteinagtige stoffer og/eller aminosyrer i det flydende medium formindskes, og disse stoffer udfælder. Det således vundne bundfald isoleres og tørres.

Som med vand blandbart organisk opløsningsmiddel anvendes til gennemførelse af denne fremgangsmåde med 15 fordel'en lavere alkohol eller en lavere keton. Som organisk syre kan anvendes en aliphatisk carboxylsyre eller en aromatisk carboxylsyre, såsom benzoesyre.

Ifølge en speciel udførelsesform for denne fremgangsmåde blev der til den vandige opløsning af det gul-20 lighvide produkt, der blev vundet ud fra plantepollen ved ekstrationen med de vandige opløsningsmidler, sat acetone og yderligere benzoesyre. Herved dannedes et på proteiner, peptider og aminosyrer beriget bundfald.

Endvidere blev ved en mikrogradient-gelelektro-25 forese af den på aminosyrer og/eller peptider og/eller proteinagtige stoffer berigede fraktion isoleret et pep-tidholdigt produkt, hvis molekylvægt ligger i området 650-750. Det kan antages, at dette produkt er opbygget af 6-8 aminosyrer. Ved denne mikrogradientelektroforese 30 blev der endvidere isoleret en spids, der svarede til en molekylvægt på ca. 700, og det antages, at det pågældende protein er et heptapeptid.

Disse på aminosyrer og/eller peptider og/eller proteinagtige stoffer berigede fraktioner af de med de 35 vandige ekstraktionsmidler vundne pollenekstrakter bliver nu undersøgt nærmere for deres farmakologiske aktivitet.

DK 166806 B1 11

Opfindelsen beskrives nærmere gennem følgende eksempler. Samtlige teste, der blev gennemført på kræftceller, gennemførtes med den ved fremgangsmåden ifølge Eksempel 1 fremstillede plantepollenekstrakt eller med 5 plantepollenekstrakter, der var vundet ved lignende fremgangsmåder. De på proteiner berigede fraktioner, der blev fremstillet ved fremgangsmåden ifølge Eksemplerne 2 og 3, er hidtil ukendte produkter, der imidlertid endnu ikke har kunnet testes tilsvarende for deres 10 kræfthæmmende aktiviteter.

Eksempel l 120 kg Pollen fra rug med den latinske betegnelse 15 Secale cereale blev behandlet med 600 kg af en 20 mol% opløsning af ethanol i vand. Dette pollen blev omrørt 48 timer ved en temperatur på 30-32°C. Efter denne forbehandling blev der tilsat Mucor alpinus og omrørt ved 30°C i 20-30 timer.

2Ό Det vandige medium blev filtreret fra pollen.

Det udgjorde en klar opløsning. Denne klare opløsning blev sterilfiltreret, og opløsningsmidlet blev derefter afdampet i vakuum. Der vandtes herved en tørret plantepollenekstrakt. Denne udgjorde et gullighvidt pulver.

25 Dette gullighvide pulver blev ifølge opfindelsen anvendt til fremstilling af det farmaceutiske præparat, der hæmmer væksten af tumorceller og stimulerer stofskifteprocesserne i sunde celler.

30

Eksempel 2

Det ved fremgangsmåden ifølge Eksempel 1 vundne produkt blev opløst i vand, indtil der var opnået en fuldstændig opløsning. Derefter blev der tilsat acetone 35 og benzoesyre. Acetonen blev tilsat dråvevis, hvorved der dannedes et bundfald, og tilsætningen af acetone fo- DK 166806 B1 12 regik, indtil der ikke udfældede mere materiale. Det dannede bundfald blev fjernet fra det flydende medium, for eksempel ved filtrering eller frasugning af opløsningsmidlet. Derefter blev det tørret.

5 Det således vundne tørprodukt blev isoleret i en mængde på ca. 60 vægt%, baseret på de 100 vægt% af den i dette eksempel anvendte oprindelige ekstrakt ifølge eksempel i.

Moderluden, der blev bortkastet, var fuldstændigt 10 fri for proteinagtige materialer eller peptider eller i det væsentlige fri for disse produkter. Heraf fremgår, at der i det vundne tørrede bundfald havde fundet en berigelse sted på peptider og proteinagtige komponenter sammenlignet med den oprindelige ekstrakt.

15

Eksempel 3

Den ved fremgangsmåden ifølge eksempel 2 vundne, på peptider og proteinagtige materialer samt aminosyrer 20 berigede fraktion blev underkastet mikrogradient-gel-elektroforese. Spidsen med en molekylvægt på ca. 700.

Der blev isoleret, og mængden af det deri indeholdte peptid androg 1 vægt% beregnet på den ifølge Eksempel 1 fremstillede tørrede ekstrakt.

25

Eksempel 4 I dette eksempel blev den væksthæmmende virkning på leukæmiceller testet.

30 Cellekulturerne indeholdt ved testens start 4 x 104 leukæmiceller pr. ml. Ved de til sammenligning anvendte cellekulturer, til hvilke der ikke blev sat nogen med vandige ekstraktionsmidler vundet pollenekstrakt, var antallet af levende leukæmiceller indtil den fjerde 35 dyrkningsdag steget til 5,2 x 105 celler pr. ml.

Hos de kulturer, til hvilke pollenekstrakten blev tilsat i en mængde på 1 mg/ml kultur, var ved afslutnin- DK 166806 B1 13 gen af den første dag af behandlingen antallet af levende leukæmiceller faldet fra 4 x 104 levende celler til 4 x 103 levende celler, og fra den anden dag kunne der ikke længere konstateres nogen levende celler.

5 Ved en yderligere række af cellekulturer blev der til de levende leukæmiceller sat pollenekstrakten i en mængde på 4 mg/ml cellekultur. I dette tilfælde var allerede ved afslutningen af den første behandlingsdag antallet af levende leukæmiceller faldet fra 4,0 x 104 10 celler pr. ml til 2 x 103 celler pr. ml, og på den anden dag kunne der ikke længere konstateres nogen levende celler.

De opnåede resultater er samlet i nedenstående tabel: 15

Dage efter be- Antal levende leukæmiceller pr. ml handlingens efter tilsætning af pollenekstrakten start i en mængde på: 20 _0_1 mg/ml_4 mg/ml 1 4,0 X 104 4 x 103 2 x 103 2 6,0 x 104 0 0 3 2,2 x 105 0 0 25 4 5,2 X 105 0 0

Under de samme betingelser som leukæmicellerne blev normale humane hvide blodlegemer dyrket. Også i dette tilfælde blev der ved de til sammenligning benyt-30 tede cellekulturer dyrket videre i tre dage uden tilsætning af pollenekstrakt. En række kulturer blev dyrket videre under tilsætning af pollenekstrakten i en mængde på 1 mg/ml kultur, og en anden række af kulturer under tilsætning af pollenekstrakten i en mængde på 4 mg/ml.

35 I samtlige kulturer og også i sammenligningskulturen kunne der under de tre dages dyrkning konstateres et DK 166806 B1 14 ringe fald i celletallene. Der kunne imidlertid ikke konstateres nogen drastisk forskel mellem de behandlede kulturer og de ikke behandlede kulturer.

Af disse resultater fremgår, at de ifølge opfin-5 delsen ud fra pollenekstrakter fremstillede præparater selektivt dræber leukæmicellerne, men ikke hindrer væksten af de sunde hvide blodlegemer.

Eksempel 5 10 I dette eksempel blev cellekulturer af humane prostatakræftceller og humane testikelkræftceller undersøgt. Også i dette tilfælde blev der hos cellekulturerne til sammenligningsformål dyrket videre uden tilsætning af den med vandige ekstraktionsmidler vundne pol-15 lenekstrakt, medens en række cellekulturer blev dyrket videre under tilsætning af pollenekstrakten i en mængde på 1 mg/ml kultur og en yderligere række under tilsætning af pollenekstrakten i en mængde på 4 mg/ml kultur.

Ved de tilsvarende kulturer af prostatakræftcel-20 ler kunne der i gruppen til sammenligningsformål konstateres en tydelig stigning i antallet af levende kræftceller fra oprindeligt 4,4 x 104 celler pr. ml til 1,2 x 105 celler pr. ml. på den fjerde dyrkningsdag.

Hos de kulturer, hvor der blev dyrket videre un-25 der tilsætning af pollenekstrakter i en mængde på 1 mg/ ml, var stigningen i levende kræftceller tydeligt mindre dvs. celletallet var steget fra 4,4 x 104 celler pr. ml til 7,6 x 104 celler pr. ml på den fjerde dag.

Hos de kulturer, hvor der blev tilsat 4 mg/ml af 30 den med vandige ekstraktionsmidler vundne pollenekstrakt, indtrådte et tydeligt fald i celletallene, idet nemlig antallet af levende prostatakræftceller var sunket fra 4,4 x 104 celler pr. ml ved behandlingens start til 6,0 x 103 levende celler på den fjerde behandlings-35 dag. De opnåede resultater er samlet i nedenstående tabel.

Claims

15 Hos cellekulturerne af humane testikelkræftceller indtrådte hos sammenligningsgruppen under dyrkningen indtil den fjerde dag et lille fald i antallet af levende celler. Hos de kulturer, hvor pollenekstrakten blev tilsat i en mængde på 1 mg/ml, var på den fjerde dyrk-20 ningsdag antallet af levende kræftceller faldet væsentlig stærkere end hos sammenligningsgruppen, og den højere dosis på 4 mg pollenekstrakt pr. ml førte til et endnu stærkere fald i antallet af levende celler. Lignende resultater som hos cellekulturerne med 25 humane prostatakræftceller blev opnået med cellekulturer, der indeholdt humane strubehovedkræftceller, humane leverkræftceller, humane blærekræftceller og humane brystkræftceller. 30

1. Anvendelse af plantepollenekstrakter til fremstilling af farmaceutiske præparater, der hæmmer 35 væksten af tumorceller samtidig med, at de stimulerer stofskifteprocesserne i sunde celler, kendeteg- DK 166806 B1 net ved, at der anvendes en fra plantepollen med et vandigt ekstraktionsmiddel vundet ekstrakt, der højst indeholder 5 vægt% af højmolekylære proteiner eller er fri for sådanne.

2. Anvendelse ifølge krav 1, kendeteg net ved, at ekstrakten anvendes til fremstilling af et farmaceutisk præparat, der hæmmer væksten af kræftceller efter udløbet af en startfase, eller hæmmer væksten af leukæmiceller straks fra behandlingens start og 10 fuldstændigt dræber disse celler.

3. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at der til fremstilling af det farmaceutiske præparat anvendes en tør ekstrakt, der udviser et vandindhold på under 12% beregnet på ekstraktens to- 15 talvægt, og som indeholder mindst 70 vægt% carbonhydra-ter, 5-12 vægt% aminosyrer og/eller peptider, samt vandopløselige vitaminer fra B-gruppen.

4. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at der til fremstilling af det farma- 20 ceutiske præparat anvendes en på aminosyrer og/eller peptider og/eller proteinagtige stoffer beriget fraktion af pollenekstrakten.

5. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at plantepollenekstrakten vindes ved at tør- 25 rede plantepollen ekstraheres med et vandigt ekstraktionsmiddel indeholdende vand og et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel, og de tilstedeværende højmo-lekylkære proteiner derefter ved indvirkning af mikroorganismer nedbrydes, fuldstændigt eller indtil et maksi- 30 malindhold på 5 vægt% beregnet på tørvægten, til lavmolekylære proteiner eller aminosyrer, hvorefter det vandige medium skilles fra pollenresten og inddampes i vakuum, således at den aktive stofblanding bliver tilbage i form af et gullighvidt produkt.

6. Anvendelse ifølge krav 5, kendeteg ne t ved, at der ud fra det gullighvide produkt fremstilles en på aminosyrer og/eller peptider beriget DK 166806 B1 fraktion, idet det gullighvide produkt opløses i vand, der tilsættes et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel, såsom en lavere alkohol eller en lavere keton og eventuelt en organisk syre, hvorved aminosyrer, peptider 5 og/eller proteinagtige stoffer udfældes, hvorefter bundfaldet isoleres og tørres.

7. Anvendselse ifølge krav 6, kendetegnet ved, at fældningen af aminosyrer og/eller peptider og/eller proteinagtige stoffer gennemføres ved til 10 den vandige opløsning at sætte acetone og benzoesyre.

8. Anvendelse ifølge krav 5, kendetegnet ved, at der ud fra det gullighvide produkt fremstilles en på aminosyrer og/eller peptider og/eller proteinagtige stoffer beriget fraktion, idet nævnte pro- 15 dukt underkastes en søjlechromatografisk opdeling, såsom ved anvendelse af en med Sephadex fyldt søjle, og de fraktioner opsamles, i hvilke der ved ninhydrin-testen kan påvises tilstedeværelse af aminosyrer og/eller peptider og/eller proteinagtige stoffer, og der ud fra dis-20 se fraktioner ved fordampning af opløsningsmidlet fremstilles en aktiv tørrest.