CN105418731B - 鹿茸蛋白提取物及其药学用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种鹿茸蛋白提取物，其特征在于通过下述方法获得：1)将鹿茸进行粉碎，得到鹿茸粉碎物；用水浸提所述鹿茸粉碎物，收集水溶性物质得到鹿茸水溶性提取物；2)对所述鹿茸水溶性提取物用水进行透析至pH值为6.5‑8.5，结束透析，得到所述鹿茸蛋白提取物。本发明的鹿茸蛋白提取物可用于预防和治疗心肌梗塞。

Description

鹿茸蛋白提取物及其药学用途
本申请要求相同申请人于2015年7月13日提交的中国发明专利申请号为201510408556.9，题为“鹿茸提取物的制备方法及其相关产品”的发明专利申请的优先权。
技术领域
本申请涉及一种中药材提取物及其药学方面用途，具体为一种鹿茸蛋白提取物及其制药用途。
背景技术
鹿茸为脊索动物门哺乳纲鹿科的动物梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。鹿茸始载于《神农本草经》，列为中品，是我国的传统名贵中药之一。性温，味甘、咸入肝、肾经。功能主治壮元阳，补气血，益精髓，强筋骨。
鹿茸是哺乳动物中唯一具有完全再生能力的附属器官，在其生长期间以每天2cm的速度生长，而不会形成肿瘤。因此我们推测鹿茸中含有促进组织再生的物质。现代药理研究证实，鹿茸中蛋白类成分高达55.26％，但由于检测方法的限制对鹿茸蛋白口服后的药理作用的研究有限。
心肌梗死是导致突然死亡的主要原因之一。其治疗原则包括保护和维持心脏功能，挽救濒死心肌，防止梗死区扩大，缩小心肌缺血范围，处理并发症。数年来，中药治疗心血管疾病的开发及应用对心血管疾病的防治显示出良好的前景。鹿茸秉承纯阳之实质，富含生发之气，生精补髓，益气强智，养血壮阳，强筋健骨，治一切虚损，可用来治疗神经衰弱、贫血症、心功能减退、心脏功能减弱等疾病。已有研究证明，鹿茸提取物可提高缺血心肌组织SOD活性、降低MDA含量。鹿茸醇提物有较好的抗心率失常作用，改善左室的收缩和舒张功能。然而鹿茸蛋白混合物的心肌损伤保护作用目前研究较少。本实验从减小心梗面积，挽救濒死心肌的角度出发，对鹿茸蛋白混合物治疗小鼠心肌缺血的作用进行了研究。
发明内容
本发明一方面提供了一种鹿茸蛋白提取物。本发明所述的鹿茸蛋白提取物通过下述步骤获得：1)将鹿茸进行粉碎，得到鹿茸粉碎物；用水浸提所述鹿茸粉碎物，收集水溶性物质得到鹿茸水溶性提取物；2)对所述鹿茸水溶性提取物用水进行透析至pH值为6.5-8.5(如7.0)，结束透析，得到所述鹿茸蛋白提取物。
本发明所述的鹿茸蛋白提取物包含至少157种蛋白，通过对蛋白的功能和作用分析研究，可以把这157种蛋白分为如下几类：钙结合蛋白4个，细胞粘附分子3个，细胞连接蛋白2个，分子伴侣3个，细胞骨架蛋白9个，防御/免疫蛋白6个，酶调节剂14个，细胞外基质蛋白7个，水解酶15个，激酶6个，连接酶3个，裂解酶7个，膜转运蛋白2个，核酸结合蛋白10个，氧化还原酶10个，磷酸酶1个，蛋白酶6个，受体15个，信号分子9个，贮藏蛋白1个，结构蛋白1个，表面活性剂2个，转录因子14个，传输/载体蛋白8个，转移酶11个，跨膜受体调节/接头蛋白5个，转运体9个。这157种蛋白的名称及GI号见下文表1-表27，蛋白的功能不是唯一的，一种蛋白可能同时具有两种或两种以上的功能。其中与发育和繁殖相关蛋白共有15个，如表28所示。
表1、钙结合蛋白(Calcium-bindingprotein)
蛋白名称 NCBI登录号
凝溶胶(Gelsolin) gi|74356373
纤溶酶原(Plasminogen) gi|113205806
钙调素(Regucalcin) gi|6526714
钙蛋白酶-3(Calpain-3) gi|148921535
表2、细胞粘附分子(Celladhesionmolecule)
表3、细胞连接蛋白(Celljunctionprotein)
蛋白名称 NCBI登录号
Dachs，isoform E gi|320544701
假定蛋白(Uncharacterized protein) gi|335306011
表4、分子伴侣(Molecularchaperones)
表5、细胞骨架蛋白(Cytoskeletal protein)
表6、防御/免疫蛋白(Defense/immunity protein)
表7、酶调节剂(Enzyme modulator)
表8、细胞外基质蛋白(Extracellular matrix protein)
表9、水解酶(Hydrolase)
表10、激酶(Kinase)
表11、连接酶(Ligase)
表12、裂解酶(Lyase)
表13、膜转运蛋白(Membrane traffic protein)
蛋白名称 NCBI登录号
假定蛋白(Uncharacterized protein) gi|194035664
突触蛋白1(Synapsin 1) gi|374304627
表14、核酸结合蛋白(Nucleicacidbindingprotein)
表15、氧化还原酶(Oxidoreductase)
表16、磷酸酶(Phosphatase)
蛋白名称 NCBI登录号
nositol monophosphatase 1 gi|61680900
表17、蛋白酶(Protease)
表18、受体(Receptor)
表19、信号分子(Signaling molecule)
表20、贮藏蛋白(Storage protein)
蛋白名称 NCBI登录号
结珠蛋白(Junction plakoglobin) gi|157391365
表21、结构蛋白(Structural protein)
表22、表面活性剂(Surfactant)
蛋白名称 NCBI登录号
胶原α-1(I)的链(Collagen alpha-1(I)chain) gi|27734648
胶原α-1(III)链(Collagen alpha-1(III)chain) gi|115290
表23、转录因子(Transcriptionfactor)
表24、传输/载体蛋白(Transfer/carrier protein)
表25、转移酶(Transferase)
表26、跨膜受体调节蛋白/接头蛋白(Transmembrane receptor egulatory/adaptorprotein)
蛋白名称 NCBI登录号
EMB蛋白(Embigin) gi|114600358
假定蛋白(Uncharacterized protein) gi|109077181
EMB蛋白(Embigin) gi|78100071
EMB蛋白(Embigin) gi|221043364
EMB蛋白(Embigin) gi|38197442
表27、转运体(Transporter)
表28、与发育和繁殖相关蛋白(developmental processandreproductionprotein)
另一方面，本发明提供了所述鹿茸蛋白提取物的制备方法，包括：
1)将鹿茸进行粉碎，得到鹿茸粉碎物；用水浸提所述鹿茸粉碎物，收集水溶性物质得到鹿茸水溶性提取物；
2)对所述鹿茸水溶性提取物用水进行透析至pH值为6.5-8.5(如7.0)，结束透析，得到所述鹿茸蛋白提取物。
上述方法中，所述鹿茸粉碎物的粒径可为50μm-100μm，具体可为75μm。
上述方法中，所述用水浸提时水的pH值为3-4(如3.5)，所述水的pH值可通过向水中加入冰醋酸进行调节。
上述方法中，所述用水浸提为在2-6℃(如4℃)进行20-26h(如24h)。
上述方法中，所述鹿茸粉碎物和水的质量比可为1∶(4-6)，具体可为1∶5，所述鹿茸的质量为鲜重。
上述方法中，所述鹿茸可为新鲜的鹿茸。
上述方法中，可采用离心收集所述水溶性物质。所述离心采用的离心力可为3000g-5000g(如4000g)，离心时间可为10-20min(如10min)。
上述方法中，所述透析采用截留分子量为1kDa的半透膜进行。所述透析可在水中进行10-12h，每4h更换水一次。
上述方法中，所述方法还包括将结束透析后得到的液体在50-60℃(如55℃)进行浓缩，得到浓缩液；将所述浓缩液在3000g-5000g(如4000g)进行离心10-20min(如10min)，收集上清液，将所述上清液进行冷冻干燥，得到鹿茸蛋白提取物干粉的步骤。
上述方法中，所述鹿茸蛋白提取物含有蛋白，所述蛋白的分子量可为10kDa-250kDa。
上述方法中，所述鹿茸蛋白提取物中含有表1-表27中的157种蛋白。
本发明的鹿茸提取物的低至高浓度对小鼠心肌缺血程度都有显著改善作用；其显著减小梗死面积，降低纤维化程度；降低小鼠心梗后心肌组织CK、CK-MB、LDH与血清LDH含量。口服鹿茸蛋白混合物对损伤心肌具有明显的保护作用，其作用机制可能与调节心肌酶水平，降低心肌纤维化程度，促进缺血心肌恢复等机制有关。
附图说明
图1为BSA标准曲线。
图2为鹿茸蛋白质提取物的SDS-PAGE电泳图。其中，泳道1为蛋白质分子量Marker，泳道2-4均为鹿茸蛋白质提取物。
图3为冠状动脉结扎心肌缺血小鼠HE染色图(×40倍，局部放大×200倍)；其中3a为假手术组(Sham)；3b为模型组(Model)；3c为鹿茸提取物低剂量组(VAPsL)；3d为鹿茸提取物中剂量(VAPsM)；3e为鹿茸提取物高剂量组(VAPsH)；3f为氯沙坦组(Losartan)。
图4为MASSON染色冠脉结扎心肌缺血小鼠给药后心脏组织形态分析图(×40倍，局部放大×200倍)；其中4a为假手术组(Sham)；4b为模型组(Model)；4c为鹿茸提取物低剂量组(VAPsL)；4d为鹿茸提取物中剂量(VAPsM)；4e为鹿茸提取物高剂量组(VAPsH)；4f为氯沙坦组(Losartan)。
实施例
下面结合实施例对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的鲜梅花鹿茸为吉林省吉云集团吉云鹿业发展有限公司的产品。
下述实施例中的6-羟多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)为Sigma-Aldrich公司的产品。
下述实施例中的美多芭为Roche公司的产品。
下述实施例中Sephadex G-25为Pharmacia公司产品(Lot No.17-0360-01)；超滤离心管为Millipore公司产品(Lot No.UFC800308)；国产安亭牌高速冷冻离心机(LotNo.GL-20G-II)；BCA蛋白定量试剂盒为碧云天生物技术研究所的产品(Lot No.SP2001)；Bradford蛋白定量试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司的产品(Lot No.PA102)；即用型透析袋为北京索莱宝科技有限公司的产品(LotNo.P1000D)；胶体磨购自北京锟捷玉诚机械设备有限公司；美国冷冻干燥机；美国Bio-rad垂直电泳仪：美国基因公司生产G-Box凝胶成像系统；美国Bio-rad酶标仪；iMarkTM Microplate Absorbance Reader(Bio-Rad，USA)；高效液相色谱仪(Agilent，1200，美国)；氮空一体机(NA-5L，上海荆和分析仪器有限公司)；质谱仪(Bruker，Altra-TOF/TOF，德国)。
实施例1、鹿茸蛋白提取物的制备和检测
一、鹿茸蛋白提取物的制备
按照下述方法制备鹿茸蛋白提取物：
鲜鹿茸直接用粉碎机进行第一次粉碎，得到第一次鹿茸粉碎物。将鹿茸第一次粉碎物进行液氮速冻后置入超微粉碎机中，加适量水进行第二次粉碎至肉糜状，得到鹿茸第二次粉碎物，第二次鹿茸粉碎物的分子粒径为75μm。将鹿茸第二次粉碎物补充一定量水(鹿茸第二次粉碎物和水的质量比为1∶5)后加入适量的冰醋酸保持pH为3.5置于4℃保持24h，然后4000g离心10min分离上层清夜，该上清液即为鹿茸水溶性提取物。将鹿茸水溶性提取物用自来水进行透析脱盐10-12h，每4h更换一次水，直至经pH试纸测量外部透析液为7.0后，结束透析，透析袋内所得的物质即为鹿茸蛋白提取物溶液，透析采用的半透膜的截留分子量为1kDa。将鹿茸蛋白提取物溶液在55℃以下旋转蒸发浓缩至200mL以内，然后4000g离心10min除掉沉淀之后，收集上清液，将该上清液进行冷冻干燥，得到鹿茸蛋白提取物干粉，冷冻保存。
二、鹿茸蛋白提取物中蛋白浓度的测定
采用Bradford蛋白定量试剂盒，按照说明书要求操作，将蛋白标准品(BSA)溶液(浓度为1mg/mL)按0μL，1μL，2μL，3μL，4μL，5μL，6μL的体积加到96孔板的标准品孔中，加入1×PBS缓冲液补足到10μL，向孔中加入190μL考马斯亮蓝染液，混匀，室温放置8min后用酶标仪测定595nm处的OD值，得到的标准曲线如图1所示。
分别称取5mg按照步骤一方法制备的3个不同时间点的鹿茸蛋白提取物干粉(1号为2014年12月4日制备，2号为2014年12月5制备，3号为2014年12月25日制备)，分别溶于1×PBS缓冲液中，制备成浓度为2.5mg/mL的鹿茸蛋白提取物溶液，依次编号为1号、2号和3号的浓度为2.5mg/mL的鹿茸蛋白提取物溶液，按照说明书要求操作，每组数据重复测定3次。1号、2号和3号的浓度为2.5mg/mL的鹿茸蛋白提取物溶液的OD595的数值分别为1.229±0.127、0.982±0.148、0.905±0.169，根据BSA标准曲线计算得到1号、2号和3号的5mg鹿茸蛋白提取物干粉中的蛋白含量分别为0.972mg，0.677mg，0.585mg，3组数据取平均值0.745mg，经计算还原后采用超微粉碎法获得的鹿茸蛋白提取物干粉中蛋白的百分含量为14.892％。
三、鹿茸蛋白提取物中蛋白分子量的测定
将步骤一制备的鹿茸蛋白提取物干粉采用1×PBS缓冲液进行溶解，鹿茸蛋白提取物的上样量为50μg、上样体积为20μL。采用5％浓缩胶，10％分离胶，80V电压下进行SDS-PAGE电泳150min。电泳结束后，经考马斯亮蓝染色后，白光下观察蛋白条带，依据蛋白条带与蛋白量标准条带的相对位置确定鹿茸蛋白提取物中蛋白的分子量。
结果如图2所示，鹿茸蛋白提取物中蛋白的分子量范围为10kDa-250kDa。
四、鹿茸蛋白提取物中蛋白的质谱鉴定将鹿茸蛋白提取物经DS-PAGE初步分离后得到的含蛋白的凝胶条带等分为10份进行质谱鉴定。具体步骤如下：
1、样品预处理
将含蛋白的SDS-PAGE凝胶条带在56℃用DTT还原，然后进行碘乙酰胺烷基化反应，将进行反应后的凝胶条带进行脱色处理。将脱色后的胶粒真空干燥后，加入Roche胰酶溶液，37℃下酶解15小时，获得酶解混合肽溶液。将酶解混合肽溶液进入Fusion液质联用仪进行分析。
2、仪器参数设置
液相色谱：C18色谱柱。
流动相：A相：H2O，0.1％(v/v)甲酸；B相：乙腈，0.1％(v/v)甲酸。梯度：5-70min，5％-25％B；70-80min，25％-35％B；80-90min，35％-80％B；90-100min，80％-80％B，流速为400uL/min。
质谱参数：喷雾电压为2.0KV，传输毛细管温度为320℃，一级检测器为orbitrap，质谱一级分辨率为12w，一级扫描范围为350-1550Da，二级碎裂为HCD，碰撞能量为36％，二级检测器为离子阱。
通过质谱鉴定在鹿茸蛋白提取物中获得了157种蛋白，通过对蛋白的功能和作用分析研究，可以把这157种蛋白分为如下几类：钙结合蛋白4个，细胞粘附分子3个，细胞连接蛋白2个，分子伴侣3个，细胞骨架蛋白9个，防御/免疫蛋白6个，酶调节剂14个，细胞外基质蛋白7个，水解酶15个，激酶6个，连接酶3个，裂解酶7个，膜转运蛋白2个，核酸结合蛋白10个，氧化还原酶10个，磷酸酶1个，蛋白酶6个，受体15个，信号分子9个，贮藏蛋白1个，结构蛋白1个，表面活性剂2个，转录因子14个，传输/载体蛋白8个，转移酶11个，跨膜受体调节/接头蛋白5个，转运体9个。这157种蛋白的名称及GI号见下文表1-表27，蛋白的功能不是唯一的，一种蛋白可能同时具有两种或两种以上的功能。其中与发育和繁殖相关蛋白共有15个，如表28所示。
表1、钙结合蛋白(Calcium-bindingprotein)
蛋白名称 NCBI登录号
凝溶胶(Gelsolin) gi|74356373
纤溶酶原(Plasminogen) gi|113205806
钙调素(Regucalcin) gi|6526714
钙蛋白酶-3(Calpain-3) gi|148921535
表2、细胞粘附分子(Celladhesionmolecule)
表3、细胞连接蛋白(Celljunctionprotein)
表4、分子伴侣(Molecularchaperones)
表5、细胞骨架蛋白(Cytoskeletal protein)
表6、防御/免疫蛋白(Defense/immunity protein)
表7、酶调节剂(Enzyme modulator)
表8、细胞外基质蛋白(Extracellular matrix protein)
表9、水解酶(Hydrolase)
表10、激酶(Kinase)
表11、连接酶(Ligase)
表12、裂解酶(Lyase)
表13、膜转运蛋白(Membrane traffic protein)
蛋白名称 NCBI登录号
假定蛋白(Uncharacterized protein) gi|194035664
突触蛋白1(Synapsin 1) gi|374304627
表14、核酸结合蛋白(Nucleicacidbindingprotein)
表15、氧化还原酶(Oxidoreductase)
表16、磷酸酶(Phosphatase)
蛋白名称 NCBI登录号
nositol monophosphatase 1 gi|61680900
表17、蛋白酶(Protease)
表18、受体(Receptor)
表19、信号分子(Signaling molecule)
表20、贮藏蛋白(Storage protein)
蛋白名称 NCBI登录号
结珠蛋白(Junction plakoglobin) gi|157391365
表21、结构蛋白(Structural protein)
表22、表面活性剂(Surfactant)
蛋白名称 NCBI登录号
胶原α-1(I)的链(Collagen alpha-1(I)chain) gi|27734648
胶原α-1(III)链(Collagen alpha-1(III)chain) gi|115290
表23、转录因子(Transcriptionfactor)
表24、传输/载体蛋白(Transfer/carrier protein)
表25、转移酶(Transferase)
表26、跨膜受体调节蛋白/接头蛋白(Transmembrane receptor egulatory/adaptorprotein)
蛋白名称 NCBI登录号
EMB蛋白(Embigin) gi|114600358
假定蛋白(Uncharacterized protein) gi|109077181
EMB蛋白(Embigin) gi|78100071
EMB蛋白(Embigin) gi|221043364
EMB蛋白(Embigin) gi|38197442
表27、转运体(Transporter)
表28、与发育和繁殖相关蛋白(developmental processandreproductionprotein)
实施例2、鹿茸蛋白提取物的药效学研究
1材料
1.1实验动物
雄性C57BL/6小鼠[由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号为SCXK(京)2012-0001]，8周，饲养于SPF级动物室。
1.2仪器试剂
氯沙坦钾(科索亚K021048)；全自动生化仪(日立7080)；CK Kit(中生北控生物科技有限公司150601)；CKMB Kit(中生北控生物科技有限公司150761)；LDHKit(中生北控生物科技有限公司140571)；Masson染色试剂盒(索来宝DC0032-100)。
2方法
2.1鹿茸蛋白提取物的制备
按照下述方法制备鹿茸蛋白提取物，该鹿茸蛋白提取物即为预防和/或治疗帕金森病的鹿茸蛋白提取物。具体如下：
鲜鹿茸直接用粉碎机进行第一次粉碎，得到第一次鹿茸粉碎物。将鹿茸第一次粉碎物进行液氮速冻后置入超微粉碎机中，加适量水进行第二次粉碎至肉糜状，得到鹿茸第二次粉碎物，第二次鹿茸粉碎物的分子粒径为75μm。将鹿茸第二次粉碎物补充一定量水(鹿茸第二次粉碎物和水的质量比为1∶5)后加入适量的冰醋酸保持pH为3.5置于4℃保持24h，然后4000g离心10min分离上层清夜，该上清液即为鹿茸水溶性提取物。将鹿茸水溶性提取物用自来水进行透析脱盐10-12h，每4h更换一次水，直至经pH试纸测量外部透析液为7.0后，结束透析，透析袋内所得的物质即为鹿茸蛋白提取物溶液，透析采用的半透膜的截留分子量为1kDa。将鹿茸蛋白提取物溶液在55℃以下旋转蒸发浓缩至200mL以内，然后4000g离心10min除掉沉淀之后，收集上清液，将该上清液进行冷冻干燥，得到鹿茸蛋白提取物干粉，冷冻保存。
2.2实验动物制备
小鼠称重后，腹腔注射4％水合氯醛(1ml/100g)麻醉后，不使用机械通气，在左胸心尖搏动位置开一纵行12mm皮肤切口，对切口穿线做荷包暂不缝合，钝性分离胸大肌和胸小肌，在心尖区第4肋间用蚊式血管钳直接撑开胸壁，轻轻将心脏挤出，在距左冠状动脉分出后约3mm处使用6号缝针和丝线将冠脉连同该处心肌一起结扎，可观察到左室前壁发白，将心脏归位，挤出胸腔残气同时收紧荷包缝线，关胸。手术前后心电图对比有典型心梗表现者为手术成功。存活动物纳入模型。假手术组同法手术但不结扎冠状动脉。
2.3分组与给药
将造模成功的小鼠分成7个组，每组10只，口服给药14天。
假手术组：给予等体积生理盐水；
模型组：给予等体积生理盐水；
阳性组：给予氯沙坦钾50mg/kg/d；
鹿茸组：亚组1：60mg/kg鹿茸粉，即鹿茸低剂量组；
亚组2：120mg/kg鹿茸粉，即鹿茸中剂量组；
亚组3：180mg/kg鹿茸粉，即鹿茸高剂量组；
2.4采用定量组织测定硝基四氮唑蓝N-BT染色法[9]
摘取小鼠心脏，用盐水冲洗，除去血污，剔除血管脂肪等非心肌组织，用滤纸吸去水分，沿冠状沟切除心房、右心室，仅留下左心室肌，然后将心室-80℃速冻3min后，冠状方向均匀切成0.1cm厚的心肌片，切片心肌放入0.1％的硝基四氮唑蓝(N-BT)。在37℃二氧化碳孵育箱中温育5～7min。染色过程中不时搅拌染色液，使之与心肌有充分的接触机会。染色后立即用水冲洗，洗去多余的染料。数码相机拍摄照片后，医学图像分析系统扫描每片心肌的总面积和坏死区面积，累积计算心肌总坏死面积占整个心肌总面积的百分比。
2.5病理学检测
用10％水合氯醛腹腔注射麻醉动物后，开胸暴露心脏，取完整心脏组织，将其放入4％多聚甲醛中固定24h后进行石蜡包埋。沿心尖连续做冠状切片，厚度为6μm。将制作好的片子用HE色与MASSON染色后，于显微镜下观察心肌坏死形态与纤维化情况并拍照。
2.6生化检测
摘取小鼠心脏，用盐水冲洗，剔除血管脂肪等心肌组织，沿冠状沟切除心房，留下心室。心尖部取心肌组织以1∶9加入冰生理盐水，高速组织匀浆机制成10％的心肌组织匀浆，低温离心机离心3000rpm，10min，取上清，检测血清肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶CK-MB与乳酸脱氢酶(LDH)含量。
3结果
3.1心电图评价
如表29所示，与假手术组比较，模型组ST段偏移显著增加，给予鹿茸提取物低、中、高剂量组可显著降低ST段偏移值，改善小鼠心肌缺血情况。其中Sham表示假手术组，Model表示模型组；VAPsL表示鹿茸低剂量组；VAPsM表示鹿茸中剂量组；VAPsH表示鹿茸高剂量组；Losartan表示氯沙坦钾组
表29 ST段偏移的总毫米数(∑-ST)
*P＜0.05，**P＜0.01vs Model
3.2心肌梗死面积的检测
如上述N-BT染色法分析。计算得到心肌梗死面积＝心肌总坏死面积/心肌总面积×100％。
心梗模型组小鼠的心肌梗死面积(53.92±7.6％)明显增大，差异有统计学意义(P＜0.01)；与模型组比较，鹿茸低中高剂量组，心肌梗死面积(16.58±3.02％，7.12±2.16％，3.34±1.14％)明显减小，差异有统计学意义(P＜0.01，P＜0.05)且存在剂量依赖关系。阳性对照药氯沙坦钾组心梗面积也显著减小(25.33±4.87％)，但其作用显著低于鹿茸高、中剂量组(P＜0.05)。
表30各组小鼠心梗面积比较
F＝83.767，**P＜0.01vs.Model；▲P＜0.05vs.Losartan
3.3病理检测结果
如图3所显示：
假手术组：心肌着色力均匀，横纹排列整齐，细胞界限清晰，排列规整，显示正常心肌细胞形态，肌丝无断裂，细胞间隙均匀，可见少量炎性细胞浸润。
模型组：心肌梗死区大，梗死区室壁变薄，心肌纤维呈波浪状(↑)，心肌纤维肌浆凝聚，形成红染，粗细不一的横带(↑)，心肌轮廓可见，交界处呈充血状可见大量炎性细胞浸润(↑)。
鹿茸低、中、高剂量组：与假手术组相比，低、中剂量组心肌细胞排列稍紊乱，炎症细胞浸润减低，高剂量组可见肌浆凝聚，呈强嗜酸性染色，未见明显排列紊乱的心肌细胞。
氯沙坦钾组：与假手术组相比，心肌细胞排列紊乱，大部分心肌组织可见强嗜酸性染色。
如图4所示，模型组细胞间隙由大量纤维组织填充，心肌纤维增粗、变长、排列紊乱、间隙增宽，横纹模糊断裂。鹿茸低、中、高剂量组及氯沙坦钾组与假手术组相比心肌细胞间仍有纤维组织，其中鹿茸低剂量组心肌细胞纤维组织较多；与模型组比较心肌细胞排列较整齐，纤维增生程度减弱，其中鹿茸高剂量组与依那普利组其纤维增生程度较鹿茸低、中剂量组减弱明显，炎性细胞浸润亦减轻。
Masson染色结果用显微图像分析软件IPP6.0对梗死心脏形态进行分析显示与对照组小鼠比较，模型组小鼠心脏梗死区及梗死边缘区可见纤维增生、排列紊乱；与模型组比较，氯沙坦钾组、鹿茸高、中、低剂量组未见明显梗死区，心肌纤维化沉积减少，差异有统计学意义(P＜0.01)，如下表30所述，Model表示模型组；VAPsL表示鹿茸低剂量组；VAPsM表示鹿茸中剂量组；VAPsH表示鹿茸高剂量组；Losartan表示氯沙坦钾组。
表31各组小鼠心肌纤维化面积比较
F＝0.861，**P＜0.01vs.Model
3.4鹿茸降低心梗小鼠血清与心肌组织心肌酶含量
与假手术组比较，模型组小鼠心肌组织的血清心肌细胞磷酸肌酸激酶(CK)、血清心肌同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)均发生显著变化，差异具有统计学意义(P＜0.01)。鹿茸高、中剂量组均减少了心肌组织CK、LDH释放。氯沙坦钾组对心肌组织CK、CK-MB含量无显著影响；对血清心肌酶指标CK、CK-MB检测结果显示模型组与假手术组及各给药组相比均无显著性差异，见表31、32，其中Sham表示假手术组，Model表示模型组；VAPsL表示鹿茸低剂量组；VAPsM表示鹿茸中剂量组；VAPsH表示鹿茸高剂量组；Losartan表示氯沙坦钾组。
表32血清中心肌酶含量
表33心肌组织中心肌酶含量
总之，本发明的鹿茸提取物上述实验结果表明鹿茸提取物低至高浓度对小鼠心肌缺血程度(∑-ST)都有显著改善作用；其显著减小梗死面积，降低纤维化程度；降低小鼠心梗后心肌组织CK、CK-MB、LDH与血清LDH含量。口服鹿茸蛋白混合物对损伤心肌具有明显的保护作用，其作用机制可能与调节心肌酶水平，降低心肌纤维化程度，促进缺血心肌恢复等机制有关。
本发明已特定地参考本发明的优选实施方案进行了详细描述，但是应当理解，在本发明的精神和范围内可实现变化和修改。因此，本发明所公开的实施方案在所有方面均应视为说明性而非限制性的。本发明的范围由所附权利要求书指定，且落入其等同形式的含义和范围内的所有改变均欲涵盖在本发明的范围内。

Claims (1)

1.一种鹿茸蛋白提取物在制备用于预防和治疗心肌梗塞疾病的药物中的用途，通过下述方法获得：1)将鹿茸进行粉碎，得到鹿茸粉碎物，粉碎物的粒径为75μm；给鹿茸粉碎物补充水，鹿茸粉碎物和水的质量比为1∶5，加入冰醋酸保持pH为3.5置于4℃保持24h，然后4000g离心10min分离上清液，所述上清液为鹿茸水溶性提取物；2)对所述鹿茸水溶性提取物用水进行透析至pH值为7.0，结束透析，得到鹿茸蛋白提取物溶液；将鹿茸蛋白提取物溶液在55℃以下旋转蒸发浓缩至200mL以内，然后4000g离心10min除掉沉淀之后，收集上清液，将所述上清液进行干燥，得到鹿茸提取物干粉；所述透析采用截留分子量为1kDa的半透膜进行，所述鹿茸提取物包含蛋白，所述蛋白的分子量为10kDa-250kDa。
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