CN103304654B - 一种醛化血细胞纯化花生种子中凝集素的方法 - Google Patents
一种醛化血细胞纯化花生种子中凝集素的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103304654B CN103304654B CN201310276043.8A CN201310276043A CN103304654B CN 103304654 B CN103304654 B CN 103304654B CN 201310276043 A CN201310276043 A CN 201310276043A CN 103304654 B CN103304654 B CN 103304654B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hemocyte
- hydroformylation
- peanut
- agglutinin
- acid buffer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
本发明公开了一种醛化血细胞纯化花生种子中凝集素的方法，其特征在于：将制得的花生粉经石油醚脱脂处理之后，与醛化后血细胞混合、偶联，经洗脱、冷冻干燥得到凝集素。本发明利用醛化后血细胞对花生种子中凝集素进行特异性吸附，再利用乳糖对凝集素的特异结合能力进行洗脱，从而达到凝集素纯化的目的，本方法具有经济、简便、条件温和且回收率高的优点，符合高通量、大规模纯化需要。
Description
技术领域
本发明涉及一种醛化血细胞纯化花生种子中凝集素的方法，属于营养与食品加工领域。
背景技术
凝集素是一种广泛存在于动植物及微生物体中的选择性结合或非共价性结合于糖基的蛋白或糖蛋白。这类蛋白的主要性质是它们可以特异性的与糖类物质作用,而且与细胞表面的糖类复合物相结合。凝集素在有机体生命活动中扮演极其重要的角色,它们与细胞间的粘附、细菌感染宿主、机体的天然免疫防御、宿主吞噬细胞清除入侵细菌等生理过程密切相关。
植物凝集素最早于1888年由俄国的Stillmark最先在植物种子蓖麻籽中发现，当时取名为蓖麻素(ricin) 。经过数十年的深入探索，己经在凝集素的性质、生理功能、基因结构域表达等方面取得了很大的进展。凝集素最大的特点是能促使细胞凝集，比较直观的表现是使红血球凝集。植物凝集素在其所在的机体内还有许多生理功能，如细胞与细胞间粘着，分子或离子的传递，雌蕊受粉，转基因抗虫，共生固氮，植物防御病原体侵入等。豆科凝集素是来自豆科植物的一类同源蛋白，是目前研究得最为清楚的凝集素家族，已经从70多种植物中纯化了600多种豆科凝集素，其中大部分来自种子，豆科凝集素还存在于叶片、茎、皮、根等营养器官中。通过分离鉴定,对它们的性质、分子结构及功能作了大量的研究,许多工作已深入到基因水平。近年来,随着对凝集素研究的展开,人们已认识到凝集素的重要性。现在免疫学、肿瘤、生殖生理、细胞生物学等许多方面得到应用，在医学、农业上呈现出巨大的应用前景。
植物凝集素的分离、提纯及相关生物活性测定, 一直是研究者关注的热点。具体的分离纯化方法目前有很多种，基本上都是按照蛋白质分离方法进行。由于凝集素自身很不稳定,易受p H、温度及离子等条件变化的影响,加之在生物体内的含量很低，使它的纯化十分困难,同时也阻碍了对它的深入研究。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中的问题，提供一种经济、简便、条件温和且回收率高，符合大规模纯化需要的醛化血细胞纯化花生种子中凝集素的方法。
为达到上述目的，本发明采用以下步骤：一种醛化血细胞纯化花生种子中凝集素的方法，其特征在于：将制得的花生粉经石油醚脱脂处理之后，与醛化后血细胞混合、偶联，经洗脱、冷冻干燥得到凝集素；其具体步骤如下：
一、将新鲜的血液加入抗凝剂，用两倍体积的灭菌磷酸缓冲液重悬，2000转离心5分钟，再用灭菌磷酸缓冲液重悬2-3次，最后将血细胞的比容稀释为0.05备用；
二、步骤一中得到的0.05血细胞取10倍体积与1倍体积的neuraminidase混合反应后，用灭菌磷酸缓冲液洗涤3-4次，重悬为比容0.2-0.4的酶处理血细胞；
三、步骤二中得到的0.2-0.4酶处理血细胞取4倍体积与1倍体积的醛化剂反应后，用灭菌磷酸缓冲液洗涤3-4次，将血细胞用灭菌磷酸缓冲液稀释为比容0.4-0.6的醛化血细胞备用;
四、将花生晒干、粉碎，加入石油醚中，恒温水浴振荡处理，抽滤，弃滤液，保留花生粉滤渣，并置于通风橱中晾干；
五、将步骤四中得到的花生粉滤渣中加入5倍体积的灭菌磷酸缓冲液，混匀溶解后以10000转超速离心20 min，弃沉淀，保留上清液，得到花生凝集素粗提液;
六、将步骤五中得到的花生凝集素粗提液与步骤三中得到的醛化血细胞按照1:1-1:3的比例混合，反应30-60 min，期间摇动混合液2-3次；
七、上述混合液2000转离心5 min，弃上清液，沉淀中加入含有200mm乳糖的灭菌磷酸缓冲液洗脱之后离心，上清浓缩、冻干得到花生凝集素纯品。
进一步的，所述新鲜血液可以是小鼠、鸡、鸭或人的新鲜血液。
进一步的，所述步骤三中的醛化剂为甲醛或戊二醛或二者的混合溶液，浓度为1-3%，反应时间为10-30min。
进一步的，所述步骤二中neuraminidase浓度为0.1u/ml，与0.05血细胞的反应温度37℃，反应时间1h。
本发明有益效果在于：利用醛化后血细胞对花生种子中凝集素进行特异性吸附，再利用乳糖对凝集素的特异结合能力进行洗脱，从而达到凝集素纯化的目的，本方法具有经济、简便、条件温和且回收率高的优点，符合高通量、大规模纯化需要。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以助于理解本发明的内容。
实施例1
一种醛化血细胞纯化花生种子中凝集素的方法，其特征在于：将制得的花生粉经石油醚脱脂处理之后，与醛化后血细胞混合、偶联，经洗脱、冷冻干燥得到凝集素；其具体步骤如下：
凝集素粗提液的制备：取无霉烂、无虫蛀的花生种子用流水清洗干净，在鼓风干燥箱中30℃干燥，干燥后的原料去花生衣，用植物粉碎机粉碎，粉碎物过50目筛，收集筛下物作为提取凝集素的花生粉；花生粉加入20倍（花生粉质量与石油醚体积比）石油醚，30℃恒温水浴振荡处理5h，抽滤，弃滤液，保留滤渣，滤渣通风橱中晾干后加入5倍体积的PBS缓冲液，混匀溶解后以10000转超速离心20分钟，弃沉淀，保留上清得到花生凝集素粗提液;
醛化血细胞制备：取新鲜小鼠血液加入抗凝剂备用；将加入抗凝剂的血用两倍体积的灭菌磷酸缓冲液（PBS）重悬，2000转离心5分钟，再用PBS重悬2-3次，最后将血细胞的比容稀释为0.05备用；10倍体积0.05血细胞与1倍体积的neuraminidase混合反应后，用灭菌的PBS洗涤3-4次，重悬为比容0.2-0.4的酶处理血细胞；4倍体积0.2-0.4酶处理血细胞与1倍体积的醛化剂反应一定时间后，用灭菌的PBS洗涤3-4次，将血细胞用PBS稀释为比容0.4-0.6的醛化血细胞4℃冰箱备用;
花生凝集素的纯化：花生凝集素粗提液与醛化血细胞按照1:1-1:3的比例混合，反应30-60分钟，期间摇动混合液2-3次；上述混合液2000转离心5分钟，弃上清，沉淀中加入含有200mm乳糖的PBS缓冲液洗脱之后离心，上清浓缩、冻干得到花生凝集素纯品，花生凝集素提取率在95.5%以上。
实施例2
取新鲜鸡血加入抗凝剂备用；将加入抗凝剂的血用两倍体积的灭菌磷酸缓冲液（PBS）重悬，2000转离心5分钟，再用PBS重悬3次，最后将血细胞的比容稀释为0.05备用；10倍体积0.05血细胞与1倍体积的neuraminidase混合反应后，用灭菌的PBS洗涤3次，重悬为比容0.2的酶处理血细胞；4倍体积0.2比溶的酶处理血细胞与1倍体积的醛化剂反应一定时间后，用灭菌的PBS洗涤3-4次，将血细胞用PBS稀释为比容0.6的醛化血细胞4℃冰箱备用;
取无霉烂、无虫蛀的花生种子用流水清洗干净，在鼓风干燥箱中30℃干燥，干燥后的原料去花生衣，用粉碎机粉碎，粉碎物过50目筛，收集筛下物作为提取凝集素的花生粉；花生粉加入20倍（花生粉质量与石油醚体积比）石油醚，30℃恒温水浴振荡处理5h，抽滤，弃滤液，保留滤渣，滤渣通风橱中晾干后加入5倍体积的PBS缓冲液，混匀溶解后以10000转超速离心20分钟，弃沉淀，保留上清得到花生凝集素粗提液; 花生凝集素粗提液与醛化血细胞按照1:2的比例混合，反应30-60分钟，期间摇动混合液2-3次；上述混合液2000转离心5分钟，弃上清，沉淀中加入含有200mm乳糖的PBS缓冲液洗脱之后离心，上清浓缩、冻干得到花生凝集素纯品，花生凝集素提取率在95.0%以上。
实施例3
取新鲜鸭血加入抗凝剂备用；随后加入两倍体积的灭菌磷酸缓冲液（PBS）重悬，2000转离心5分钟，再用PBS重悬2次，最后将血细胞的比容稀释为0.05备用；10倍体积0.05血细胞与1倍体积的neuraminidase混合反应后，用灭菌的PBS洗涤3次，重悬为比容0.2的酶处理血细胞；4倍体积0.3比溶的酶处理血细胞与1倍体积的醛化剂反应一定时间后，用灭菌的PBS洗涤3次，将血细胞用PBS稀释为比容0.5的醛化血细胞4℃冰箱备用;
取无霉烂、无虫蛀的花生种子用流水清洗干净，在鼓风干燥箱中30℃干燥，干燥后的原料去花生衣，用粉碎机粉碎，粉碎物过50目筛，收集筛下物作为提取凝集素的花生粉；花生粉加入20倍（花生粉质量与石油醚体积比）石油醚，30℃恒温水浴振荡处理5h，抽滤，弃滤液，保留滤渣，滤渣通风橱中晾干后加入5倍体积的PBS缓冲液，混匀溶解后以10000转超速离心20分钟，弃沉淀，保留上清得到花生凝集素粗提液; 花生凝集素粗提液与醛化血细胞按照1:3的比例混合，反应30-60分钟，期间摇动混合液2-3次；上述混合液2000转离心5分钟，弃上清，沉淀中加入含有200mm乳糖的PBS缓冲液洗脱之后离心，上清浓缩、冻干得到花生凝集素纯品，花生凝集素提取率在96.0%以上。
从上述实施例可以看出，利用醛化后血细胞对花生种子中凝集素进行特异性吸附，再利用乳糖对凝集素的特异结合能力进行洗脱，从而达到凝集素纯化的目的，本方法具有经济、简便、条件温和且回收率高的优点，符合高通量、大规模纯化需要。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种醛化血细胞纯化花生种子中凝集素的方法，其特征在于：将制得的花生粉经石油醚脱脂处理之后，与醛化后血细胞混合、偶联，经洗脱、冷冻干燥得到凝集素；其具体步骤如下：
一、将新鲜的血液加入抗凝剂，用两倍体积的灭菌磷酸缓冲液重悬，2000转离心5分钟，再用灭菌磷酸缓冲液重悬2-3次，最后将血细胞的比容稀释为0.05备用；
二、步骤一中得到的0.05血细胞取10倍体积与1倍体积的neuraminidase混合反应后，用灭菌磷酸缓冲液洗涤3-4次，重悬为比容0.2-0.4的酶处理血细胞；
三、步骤二中得到的0.2-0.4酶处理血细胞取4倍体积与1倍体积的醛化剂反应后，用灭菌磷酸缓冲液洗涤3-4次，将血细胞用灭菌磷酸缓冲液稀释为比容0.4-0.6的醛化血细胞备用;
四、将花生晒干、粉碎，加入石油醚中，恒温水浴振荡处理，抽滤，弃滤液，保留花生粉滤渣，并置于通风橱中晾干；
五、将步骤四中得到的花生粉滤渣中加入5倍体积的灭菌磷酸缓冲液，混匀溶解后以10000转超速离心20 min，弃沉淀，保留上清液，得到花生凝集素粗提液;
六、将步骤五中得到的花生凝集素粗提液与步骤三中得到的醛化血细胞按照1:1-1:3的比例混合，反应30-60 min，期间摇动混合液2-3次；
七、上述混合液2000转离心5 min，弃上清液，沉淀中加入含有200mm乳糖的灭菌磷酸缓冲液洗脱之后离心，上清浓缩、冻干得到花生凝集素纯品。
2.根据权利要求1所述的醛化血细胞纯化花生种子中凝集素的方法，其特征在于：所述新鲜血液可以是小鼠、鸡、鸭或人的新鲜血液。
3.根据权利要求1所述的醛化血细胞纯化花生种子中凝集素的方法，其特征在于：所述步骤三中的醛化剂为甲醛或戊二醛或二者的混合溶液，浓度为1-3%，反应时间为10-30min。
4.根据权利要求1所述的醛化血细胞纯化花生种子中凝集素的方法，其特征在于：所述步骤二中neuraminidase浓度为0.1u/ml，与0.05血细胞的反应温度37℃，反应时间1h。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310276043.8A CN103304654B (zh) | 2013-07-03 | 2013-07-03 | 一种醛化血细胞纯化花生种子中凝集素的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310276043.8A CN103304654B (zh) | 2013-07-03 | 2013-07-03 | 一种醛化血细胞纯化花生种子中凝集素的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103304654A CN103304654A (zh) | 2013-09-18 |
| CN103304654B true CN103304654B (zh) | 2015-03-18 |
Family
ID=49130409
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310276043.8A Active CN103304654B (zh) | 2013-07-03 | 2013-07-03 | 一种醛化血细胞纯化花生种子中凝集素的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103304654B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111233986B (zh) * | 2020-02-28 | 2020-11-06 | 盐城师范学院 | 一种表达链球菌溶血素成熟蛋白的工程菌及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101817876A (zh) * | 2010-03-26 | 2010-09-01 | 山东省花生研究所 | 一种花生种子中凝集素的纯化方法 |
-
2013
- 2013-07-03 CN CN201310276043.8A patent/CN103304654B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101817876A (zh) * | 2010-03-26 | 2010-09-01 | 山东省花生研究所 | 一种花生种子中凝集素的纯化方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 甲壳纲动物凝集素的结构特征和分离纯化方法;孙 杰;《海洋科学》;20061231;第30卷(第6期);73-76页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103304654A (zh) | 2013-09-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105578883A (zh) | 植物免疫系统功能的调节 | |
| CN104311676B (zh) | 一种从橡籽仁中提取食用淀粉并副产单宁酸的方法 | |
| CN103804480A (zh) | 一种虾原肌球蛋白过敏原基准物的制备方法 | |
| CN104351752B (zh) | 一种来源于食用菌\海藻的多糖蛋白复配功能胶囊产品的生产方法 | |
| CN105779541A (zh) | 天麻肽的制备方法 | |
| CN105801690A (zh) | 一种胰蛋白酶抑制剂及其制备方法和应用 | |
| CN106748923B (zh) | 一种从黑蒜中提取蒜氨酸的方法 | |
| CN101508730A (zh) | 一种豆类植物凝集素的提取方法 | |
| CN104367987B (zh) | 兽用黄芪制剂及其制备方法 | |
| CN103304654B (zh) | 一种醛化血细胞纯化花生种子中凝集素的方法 | |
| CN104817633B (zh) | 一种红菇凝集素的制备方法及应用 | |
| CN103202859B (zh) | 藏制羊胎盘善姆饮片的制备方法 | |
| CN103805669B (zh) | 提高机体糖原储备的牦牛皮大分子胶原蛋白的制备方法 | |
| CN104327175B (zh) | 一种分离抗菌肽的方法 | |
| CN102432681A (zh) | 一种从绿豆中分离纯化胰蛋白酶抑制剂的方法 | |
| CN106188259A (zh) | 一种反胶束分离纯化大豆凝集素的方法 | |
| CN106011091A (zh) | 一种从三角帆蚌的蚌肉中提取纯化sod冻干粉的方法 | |
| CN103815210B (zh) | 抑制燕窝中亚硝酸根或亚硝酸盐产生的方法 | |
| CN104353057B (zh) | 含有稠李花色苷的降血压保健品 | |
| CN105010404B (zh) | 一种杀虫活性物质及其制备方法和应用 | |
| CN103059111A (zh) | 一种抗过敏高纯度r-藻蓝蛋白的制备方法 | |
| CN102600217A (zh) | 一种常山碱的提取工艺 | |
| CN105076234A (zh) | 一种防治玉米象的植物源杀虫剂其制备工艺 | |
| CN101817876B (zh) | 一种花生种子中凝集素的纯化方法 | |
| CN103012581B (zh) | 制备白蛋白的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |