CN109507432A - 一种嗜铬蛋白a检测试剂及检测参考区间及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种嗜铬蛋白A检测试剂，包括：免疫复合体，抗体检测体系；所述免疫复合体由标记后的第一特定抗体，标记后的第二特定抗体，嗜铬蛋白A校准品，嗜铬蛋白A质控品，待测样本复合形成；第一特定抗体，第二特定抗体由抗体与人嗜铬蛋白A氨基酸序列中氨基酸位点进行表位特异性结合形成；氨基酸位点包括：第1‑113位，第131‑143位，第337‑364位，第373‑439位；检测试剂能够定量检测人体血浆中嗜铬蛋白A的浓度，临床上主要用于嗜铬细胞瘤和神经内分泌肿瘤辅助诊断和鉴别诊断；本发明的参考区间与临川诊断符合度高，提高辅助诊断的准确性；本发明再利用全自动磁珠化学发光平台开发出的检测方法，缩短了检测周期。

Description

一种嗜铬蛋白A检测试剂及检测参考区间及检测方法
技术领域
本发明属于试剂诊断研究领域，特别是一种嗜铬蛋白A检测试剂及检测参考区间及检测方法。
背景技术
嗜铬蛋白A或嗜铬粒蛋白A(ChromograninA，CGA)属嗜铬蛋白家族，嗜铬蛋白存在于所有神经内分泌细胞内能分泌儿茶酚胺或其他内分泌激素的分泌囊泡中，富含酸性氨基酸，为酸性可溶性蛋白质，最初从牛肾上腺髓质颗粒中提取，后发现广泛存在于神经系统和APUD(amine precursor uptake and decarboxylation)系统中。cDNA序列分析和生化研究表明CGA由439个氨基酸残基组成，分子量为48KD，等电点为4.8，具有抗热变形的特点。
CGA作为前体肽，在不同的组织中可分解为不同片段，参与保持机体内环境的稳定，诸如：调节能量代谢、细胞内外钙平衡；抑制儿茶酚胺的释放；抑制机体炎症反应；参与组织修复、疼痛缓解及保持胃肠道动力；并构成了天然免疫的第一道防线防卫外来微生物(包括细菌、真菌、酵母菌等)的侵袭；抑制肿瘤细胞生长及多瘤生长模式、增加肿瘤细胞凋亡；抑制成纤维细胞黏附、聚集等。
神经内分泌肿瘤(neuroendocrine neoplasm,NEN)起源于弥散性神经内分泌系统具有胺前体摄取和脱羧基功能的神经内分泌细胞，是一组异质性显著的肿瘤,具有从缓慢生长、惰性、低度恶性、显著恶性、高侵袭性和转移性的一系列生物学行为，部分NEN具有家族遗传性倾向。NEN以往相对少见,过去15年间,NEN的年发病率从2.48/100000上升至5.86/100000,呈逐年增加趋势,这可能与诊断技术进步,确诊率增加有关。NEN可发生于人体多个器官和组织,包括胃肠道、胰腺、肝脏、胆囊、胆管、支气管、肺、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺髓质、副神经节以及其他部位的神经内分泌细胞,其中胃肠胰神经内分泌肿瘤最为常见,约占所有NEN的55％-70％。
1997年Angelsen等报道，含有CGA肿瘤细胞的患者具有较高的血清CGA水平，CGA不仅在肿瘤原发灶释放，而且能在转移瘤中释放，对评估转移是可靠的指标。2000年Tomassetti等研究80例神经内分泌肿瘤患者，其中类癌34例，胰腺癌29例，MEN-I 17例。检测发现肿瘤患者血CGA浓度升高，说明血清CGA为预测肿瘤神经内分泌分化程度的有用的标记物。进一步证实检测患者血液CGA的浓度的可靠性及准确性。Giampaolo等研究CGA分泌规律，发现健康人群中体位变化不影响CGA水平，而可引起儿茶酚胺轻度升高。低血糖状态下补充糖元可提高肾上腺素水平，但对去甲肾上腺素、CGA水平无影响。提示测定CGA对体位或是否进食没有限制。Canale等研究血液CGA在嗜铬细胞瘤合并肾功能不全患者中诊断的应用，发现在肌酐清除率小于1.33ml/s(80ml/min)的患者中，CGA诊断敏感度、特异性、准确性、阳性预测值及阴性预测值均有下降。故在评估患者血液CGA水平时应了解其肾功能情况，排除假阳性。
CGA广泛存在于神经内分泌细胞中,其血浆水平升高提示存在神经内分泌细胞来源的肿瘤。肿瘤的类型纷繁复杂，例如，上皮细胞分化的实性胰腺肿瘤可分为胰母细胞瘤、腺泡细胞癌、内分泌肿瘤和实性假乳头肿瘤，上皮性肺肿瘤可分为腺癌、鳞状细胞癌、神经内分泌肿瘤、大细胞癌、腺鳞癌、巨细胞癌等，甲状腺癌可分为乳头状癌、滤泡状癌、未分化癌和髓样癌等，通过血液CGA水平的评估，可对神经内分泌细胞来源的肿瘤进行鉴别诊断。
几乎所有类型的神经内分泌肿瘤都会出现血浆CGA水平升高,因此对于神经内分泌肿瘤,CGA是极具诊断价值的非特异性肿瘤标志物。
目前，检测CGA的方法主要有酶联免疫分析法(ELISA)、免疫放射分析法(IRMA)及荧光免疫分析法等。研发生产CGA酶联免疫试剂盒的有美国EDI公司、法国CisbioBioassays公司、丹麦Dako等，CGA放射免疫试剂盒有法国Cisbio Bioassays公司、EuroDiagnostics等，荧光免疫分析法试剂盒有德国BRAHMS等。
但是上述上市产品由于其方法学固有的特性，均存在一定的缺陷。例如，酶联免疫分析法操作步骤繁琐、反应所需时间长，免疫放射分析法灵敏度差、不能绝对定量、存在放射线辐射和污染，荧光免疫分析法灵敏度差、检测结果受主观因素影响。
市场需要一种准确度高、检测周期短的嗜铬蛋白A检测试剂，本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种准确度高、检测周期短的嗜铬蛋白A检测试剂及检测参考区间及检测方法，主要用于定量检测人体血浆中嗜铬蛋白A的浓度，临床上主要用于嗜铬细胞瘤和神经内分泌肿瘤(如肺和小肠类癌、胰腺肿瘤等)辅助诊断和鉴别诊断。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种嗜铬蛋白A检测试剂，包括：免疫复合体，抗体检测体系；
所述免疫复合体由标记后的第一特定抗体，标记后的第二特定抗体，嗜铬蛋白A校准品，嗜铬蛋白A质控品，待测样本复合形成；
第一特定抗体，第二特定抗体由抗体与人嗜铬蛋白A氨基酸序列中氨基酸位点进行表位特异性结合形成；
氨基酸位点包括：第1-113位，第131-143位，第337-364位，第373-439位。
前述的一种嗜铬蛋白A检测试剂，抗体检测体系为磁珠化学发光检测体系。
前述的一种嗜铬蛋白A检测试剂，包括：嗜铬蛋白A多克隆抗体包被的磁珠，标记物标记的嗜铬蛋白A单克隆抗体，洗涤液，预激发液，激发液，嗜铬蛋白A校准品，嗜铬蛋白A质控品，待测样本。
前述的一种嗜铬蛋白A检测试剂，包括：生物素标记的嗜铬蛋白A多克隆抗体，标记物标记的嗜铬蛋白A包被单克隆抗体，嗜铬蛋白A校准品，嗜铬蛋白A质控品，待测样本，链霉亲和素包被的磁珠，洗涤液，预激发液，激发液。
前述的一种嗜铬蛋白A检测试剂，抗体包括：抗嗜铬蛋白A a段抗体，抗嗜铬蛋白Ab段抗体，抗嗜铬蛋白A c段抗体，抗嗜铬蛋白A d段抗体；
嗜铬蛋白A a段：人嗜铬蛋白A氨基酸序列第1-113位
vmkcivevis dtlskpnplp iseecletlr gderiisilr hqnllkelqe iaaqganertqqqkknsgfe delsevlesq nnknkqrdaa gerheeeqpt gslaelvaqk iqq；
嗜铬蛋白A b段：人嗜铬蛋白A氨基酸序列第124-143位
sleereprpr dadsgekedr；
嗜铬蛋白A c段：人嗜铬蛋白A氨基酸序列第322-364位
eeskrwnkmd elakqltskk rmeendsged pdrsmkmafr srk；
嗜铬蛋白A d段：人嗜铬蛋白A氨基酸序列第373-439位
dvrrswkhhs kedsseggfp lapmpeekkd eegsanrrte dqeleslaai
eaelervahk lhelrrg；
由多个抗体组成抗体组合。
前述的一种嗜铬蛋白A检测试剂，抗体组合由抗嗜铬蛋白Ac段抗体和抗嗜铬蛋白A全段抗体组成。
前述的一种嗜铬蛋白A检测试剂，抗体组合由抗嗜铬蛋白Ab段抗体和抗嗜铬蛋白Ac段抗体组成。
一种嗜铬蛋白A检测试剂的检测参考区间，检测试剂，包括：第一特定抗体，第二特定抗体，蛋白抗体分离载体，洗涤液，预激发液，激发液，嗜铬蛋白A校准品，嗜铬蛋白A质控品；
第一特定抗体，第二特定抗体为：抗体与人嗜铬蛋白A氨基酸序列中氨基酸位点进行表位特异性结合；
若检测出的嗜铬蛋白A含量＜48.1ng/mL，则预测为神经内分泌肿瘤阴性；
若检测出的嗜铬蛋白A含量在48.1-95ng/mL范围内，则预测为神经内分泌肿瘤弱阳性；
若检测出的嗜铬蛋白A含量在＞95ng/mL，则预测为神经内分泌肿瘤强阳性。
一种嗜铬蛋白A检测试剂的检测方法，嗜铬蛋白A检测试剂，包括：嗜铬蛋白A多克隆抗体包被的磁珠，标记物标记的嗜铬蛋白A单克隆抗体，洗涤液，预激发液，激发液，嗜铬蛋白A校准品，嗜铬蛋白A质控品，待测样本；
检测步骤包括：
在反应杯中每孔添加标记物标记的嗜铬蛋白A单克隆抗体；
添加的校准品、质控品和样本到指定孔；
在各孔添加嗜铬蛋白A多克隆抗体包被的磁珠；
18-37℃孵育15-60min；
用洗涤液洗涤微孔；
在各孔中添加预激发液；
在各孔中添加激发液；
2s内进行读数。
一种嗜铬蛋白A检测试剂的检测方法，嗜铬蛋白A检测试剂，包括：生物素标记的嗜铬蛋白A多克隆抗体，标记物标记的嗜铬蛋白A包被单克隆抗体，嗜铬蛋白A校准品，嗜铬蛋白A质控品，待测样本，链霉亲和素包被的磁珠，洗涤液，预激发液，激发液；
检测步骤包括：
在反应杯中每孔添加生物素标记的嗜铬蛋白A多克隆抗体；
各孔添加标记物标记的嗜铬蛋白A包被单克隆抗体；
添加嗜铬蛋白A校准品、嗜铬蛋白A质控品和待测样本到指定孔；
在各孔添加链霉亲和素包被的磁珠；
18-37℃孵育15-60min；
用洗涤液洗涤微孔；
在各孔中添加预激发液；
在各孔中添加激发液；
2s内进行读数。
本发明的有益之处在于：
本发明采用两个特定的抗体结合嗜铬蛋白A不同抗原决定簇的“双抗体夹心”技术，提高检测准确度，剪短检测周期；
本发明采用全自动磁珠化学发光平台开发出的检测方法，检测步骤简单，时间短；
本发明优选出由抗嗜铬蛋白Ac段抗体和抗嗜铬蛋白A全段抗体组成的抗体组合，从而有效区分正常人群和神经内分泌肿瘤患者，有利于灵敏度和特异性的提高，降低临床检测中出现假阴性和假阳性的概率；
本发明的检测参考区间与临床诊断相符合，提高了辅助诊断的准确性。
附图说明
图1是本发明CGA鉴别正常人和神经内分泌肿瘤的ROC曲线；
图2是人嗜铬蛋白A氨基酸结合位点序列图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种嗜铬蛋白A检测试剂，包括：免疫复合体，抗体检测体系；
免疫复合体由标记后的第一特定抗体，标记后的第二特定抗体，嗜铬蛋白A校准品，嗜铬蛋白A质控品，待测样本复合形成；
第一特定抗体，第二特定抗体由抗体与人嗜铬蛋白A氨基酸序列中氨基酸位点进行表位特异性结合形成。
其中至少一种抗体与人嗜铬蛋白A氨基酸序列中的第1-113位氨基酸的表位特异性结合，且其中有至少连续3个氨基酸位于片段38-63内；
其中至少一种抗体与人嗜铬蛋白A氨基酸序列中的第131-143位氨基酸的表位特异性结合；
其中至少一种抗体与人嗜铬蛋白A氨基酸序列中的第337-364位氨基酸的表位特异性结合；
其中至少一种抗体与人嗜铬蛋白A氨基酸序列中的第373-439位氨基酸的表位特异性结合，且其中有至少连续3个氨基酸位于片段394-441和/或425-439内；
与人嗜铬蛋白A氨基酸序列中的第1-113位、第131-143位、第337-364位或第373-439位氨基酸的表位特异性结合的抗体中，其中至少一种为捕捉抗体；
与人嗜铬蛋白A氨基酸序列中的第1-113位、第131-143位、第337-364位或第373-439位氨基酸的表位特异性结合的抗体中，其中至少一种抗体为示踪抗体。
嗜铬蛋白A的氨基酸序列表如下：
1 vmkcivevis dtlskpnplp iseecletlr gderiisilr hqnllkelqe iaaqganert
61 qqqkknsgfe delsevlesq nnknkqrdaa gerheeeqpt gslaelvaqk iqqnedsree
121 gknsleerep rprdadsgek edreevesne igdrrdvqre qaldnhiskd fsedeqqqqe
181 deeeeargpr dsleledegk qpsrqgqeqs kevagerver eddggddate edpteaersl
241 dlaeedeeae emqgddnndd algfgkdgqs seeeeeeeeq pralrggrhr ledegmqree
301 dtfqprdaks eemeeessre weeskrwnkm delakqltsk krmeendsge dpdrsmkmaf
361 rsrkydfssp eedvrrswkh hskedssegg fplapmpeek kdeegsanrr tedqelesla
421 aieaelerva hklhelrrg
a.人嗜铬蛋白A氨基酸序列第1-113位
vmkcivevis dtlskpnplp iseecletlr gderiisilr hqnllkelqe iaaqganertqqqkknsgfe delsevlesq nnknkqrdaa gerheeeqpt gslaelvaqk iqq
b.人嗜铬蛋白A氨基酸序列第124-143位
sleereprpr dadsgekedr
c.人嗜铬蛋白A氨基酸序列第322-364位
eeskrwnkmd elakqltskk rmeendsged pdrsmkmafr srk
d.人嗜铬蛋白A氨基酸序列第373-439位
dvrrswkhhs kedsseggfp lapmpeekkd eegsanrrte dqeleslaai
eaelervahk lhelrrg。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
捕捉抗体为生物素标记的抗体或者直接固定于固定相上，固定相为微孔板。
△抗体检测体系为酶联免疫检测体系。
(1)抗体直接包被的微孔板系统
一种嗜铬蛋白A检测试剂，采用两个特定的抗体结合嗜铬蛋白A不同抗原决定簇的“双抗体夹心”技术。在嗜铬蛋白A多克隆抗体包被的微孔板中加入校准品、质控品和待测样本。孵育，随后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的嗜铬蛋白A示踪抗体。孵育，形成“单克隆抗体-人嗜铬蛋白A-多克隆抗体”免疫复合体。洗涤，除去各孔中游离的蛋白质和游离的HRP标记抗体。加入HRP基质溶液，孵育，加入ELISA终止液结束反应，使用酶标仪读取吸光度值。微孔板内壁的示踪抗体酶活性与样本中的嗜铬蛋白A的浓度成正比。根据不同浓度的校准品绘制标准曲线，待测样品中的嗜铬蛋白A的浓度可以直接从标准曲线上读取。
嗜铬蛋白A检测试剂，主要包括如下组分：抗嗜铬蛋白A抗体微孔板、嗜铬蛋白A示踪抗体、嗜铬蛋白A检测缓冲液、洗涤液、HRP基质、终止液、嗜铬蛋白A校准品以及嗜铬蛋白A质控品。
嗜铬蛋白A示踪抗体的主要成分为嗜铬蛋白A抗体、辣根过氧化物酶，所述嗜铬蛋白A检测缓冲液的主要成分为磷酸盐、氯化钠、牛血清白蛋白，所述洗涤液的主要成分为磷酸盐、氯化钠、吐温20，所述HRP基质的主要成分为3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、过氧化氢，所述终止液的主要成分为0.5M硫酸，所述嗜铬蛋白A校准品和嗜铬蛋白A质控品的主要成分为人嗜铬蛋白A抗原。
(2)“链霉亲和素-生物素”体系
嗜铬蛋白A检测试剂，采用两个特定的抗体结合嗜铬蛋白A不同抗原决定簇的“双抗体夹心”技术。将校准品、质控品和待测样本加入链酶亲和素包被的微孔板，再加入嗜铬蛋白A抗体混合物。孵育，形成“生物素标记抗体-嗜铬蛋白A-HRP标记抗体”的免疫复合物。洗涤，除去各孔中游离的蛋白质和游离的HRP标记抗体。加入HRP基质溶液，孵育，加入终止液结束反应，使用酶标仪读取吸光度值。微孔板内壁的示踪抗体酶活性与样本中的嗜铬蛋白A的浓度成正比。根据不同浓度的校准品绘制标准曲线，待测样品中的嗜铬蛋白A的浓度可以直接从标准曲线上读取。
第二种嗜铬蛋白A检测试剂，主要包括如下组分：链酶亲和素包被的微孔板、生物素标记的嗜铬蛋白A抗体、HRP标记的嗜铬蛋白A抗体、嗜铬蛋白A检测缓冲液、洗涤液、HRP基质、终止液、嗜铬蛋白A校准品以及嗜铬蛋白A质控品。
嗜铬蛋白A检测缓冲液的主要成分为磷酸盐、氯化钠、牛血清白蛋白，所述洗涤液的主要成分为磷酸盐、氯化钠、吐温20，所述HRP基质的主要成分为3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、过氧化氢，所述终止液的主要成分为0.5M硫酸，所述嗜铬蛋白A校准品和嗜铬蛋白A质控品的主要成分为人嗜铬蛋白A抗原。
△抗体检测体系为板式化学发光检测体系。
(1)抗体直接包被的微孔板系统
嗜铬蛋白A检测试剂，采用两个特定的抗体结合嗜铬蛋白A不同抗原决定簇的“双抗体夹心”技术。在嗜铬蛋白A多克隆抗体包被的微孔板中加入校准品、质控品和待测样本。孵育，随后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的嗜铬蛋白A示踪抗体。孵育，形成“单克隆抗体-人嗜铬蛋白A-多克隆抗体”免疫复合体。洗涤，除去各孔中游离的蛋白质和游离的HRP标记抗体。加入发光底物混合物，测量相对发光值(RLU值)。免疫复合体的酶活性与样本中的嗜铬蛋白A浓度成正比。根据校准品中不同的嗜铬蛋白A浓度的RLU值，按“点到点(折线)”或“双对数”绘制校准曲线，样品中嗜铬蛋白A浓度可按RLU值从校准曲线上得到。
嗜铬蛋白A检测试剂，主要包括如下组分：抗嗜铬蛋白A抗体微孔板、嗜铬蛋白A示踪抗体、嗜铬蛋白A检测缓冲液、洗涤液、发光底物A液、发光底物B液、嗜铬蛋白A校准品以及嗜铬蛋白A质控品。
嗜铬蛋白A示踪抗体的主要成分为嗜铬蛋白A抗体、辣根过氧化物酶，嗜铬蛋白A检测缓冲液的主要成分为磷酸盐、氯化钠、牛血清白蛋白，洗涤液的主要成分为磷酸盐、氯化钠、吐温20，所述发光底物A液的主要成分为鲁米诺，发光底物B液的主要成分为过氧化氢，所述嗜铬蛋白A校准品和嗜铬蛋白A质控品的主要成分为人嗜铬蛋白A抗原。
(2)“链霉亲和素-生物素”体系
嗜铬蛋白A检测试剂，采用两个特定的抗体结合嗜铬蛋白A不同抗原决定簇的“双抗体夹心”技术。将校准品、质控品和待测样本加入链酶亲和素包被的微孔板，再加入嗜铬蛋白A抗体混合物。孵育，形成“生物素标记抗体-嗜铬蛋白A-HRP标记抗体”的免疫复合物。洗涤，除去各孔中游离的蛋白质和游离的HRP标记抗体。加入发光底物混合物，测量相对发光值(RLU值)。免疫复合体的酶活性与样本中的嗜铬蛋白A浓度成正比。根据校准品中不同的嗜铬蛋白A浓度的RLU值，按“点到点(折线)”或“双对数”绘制校准曲线，样品中嗜铬蛋白A浓度可按RLU值从校准曲线上得到。
嗜铬蛋白A检测试剂，主要包括如下组分：链酶亲和素包被的微孔板、生物素标记的嗜铬蛋白A抗体、HRP标记的嗜铬蛋白A抗体、嗜铬蛋白A检测缓冲液、洗涤液、发光底物A液、发光底物B液、嗜铬蛋白A校准品以及嗜铬蛋白A质控品。
嗜铬蛋白A检测缓冲液的主要成分为磷酸盐、氯化钠、牛血清白蛋白，洗涤液的主要成分为磷酸盐、氯化钠、吐温20，所述发光底物A液的主要成分为鲁米诺，发光底物B液的主要成分为过氧化氢，嗜铬蛋白A校准品和嗜铬蛋白A质控品的主要成分为人嗜铬蛋白A抗原。
△抗体检测体系为磁珠化学发光检测体系。
作为一种实施例，一种嗜铬蛋白A检测试剂，包括：嗜铬蛋白A多克隆抗体包被的磁珠，标记物标记的嗜铬蛋白A单克隆抗体，洗涤液，预激发液，激发液，嗜铬蛋白A校准品，嗜铬蛋白A质控品，待测样本。洗涤液的主要成分为磷酸盐、氯化钠、吐温20。预激发液的主要成分为过氧化氢。激发液的主要成分为氢氧化钠。嗜铬蛋白A校准品和嗜铬蛋白A质控品的主要成分为人嗜铬蛋白A抗原。作为一种实施例，标记物可以是吖啶脂，HRP或碱性磷酸酶。
嗜铬蛋白A检测试剂的检测方法包括以下步骤：
(1)反应杯中每孔添加100ul吖啶脂(HRP或碱性磷酸酶)标记的嗜铬蛋白A单克隆抗体
(2)添加25ul的校准品、质控品和样本到指定孔；
(3)在各孔添加10ul嗜铬蛋白A多克隆抗体包被的磁珠；
(4)18-37℃孵育15-60min；需要说明的是：自然非重组的嗜铬蛋白A在18～37℃条件下与所述两个特定的抗体发生免疫结合，而经历2～8℃后，与所述两个特定的抗体的结合能力大大下降，甚至会出现不结合的状况。
(5)用洗涤液洗涤微孔3次；
(6)在各孔中添加100ul预激发液；
(7)在各孔中添加100ul激发液；
(8)2s内进行读数。
作为一种实施例，一种嗜铬蛋白A检测试剂，包括：生物素标记的嗜铬蛋白A多克隆抗体，标记物标记的嗜铬蛋白A包被单克隆抗体，嗜铬蛋白A校准品，嗜铬蛋白A质控品，待测样本，链霉亲和素包被的磁珠，洗涤液，预激发液，激发液。洗涤液的主要成分为磷酸盐、氯化钠、吐温20。预激发液的主要成分为过氧化氢。激发液的主要成分为氢氧化钠。嗜铬蛋白A校准品和嗜铬蛋白A质控品的主要成分为人嗜铬蛋白A抗原。作为一种实施例，标记物可以是吖啶脂，HRP或碱性磷酸酶。
嗜铬蛋白A检测试剂的检测方法包括以下步骤：
(1)反应杯中每孔添加100ul生物素标记的嗜铬蛋白A抗体；
(2)各孔添加100ul吖啶脂标记的嗜铬蛋白A抗体；
(3)添加25ul的校准品、质控品和样本到指定孔；
(4)在各孔添加10ul嗜铬蛋白A多克隆抗体包被的磁珠；
(5)18-37℃孵育15-60min；需要说明的是：自然非重组的嗜铬蛋白A在18～37℃条件下与所述两个特定的抗体发生免疫结合，而经历2～8℃后，与所述两个特定的抗体的结合能力大大下降，甚至会出现不结合的状况。
(6)用洗涤液洗涤微孔3次；
(7)在各孔中添加100ul预激发液；
(8)在各孔中添加100ul激发液；
(9)2s内进行读数。
一，最佳抗体组合实验：
抗体包括：抗嗜铬蛋白A a段抗体，抗嗜铬蛋白A b段抗体，抗嗜铬蛋白A c段抗体，抗嗜铬蛋白A d段抗体；
嗜铬蛋白A a段：人嗜铬蛋白A氨基酸序列第1-113位
vmkcivevis dtlskpnplp iseecletlr gderiisilr hqnllkelqe iaaqganertqqqkknsgfe delsevlesq nnknkqrdaa gerheeeqpt gslaelvaqk iqq；
嗜铬蛋白A b段：人嗜铬蛋白A氨基酸序列第124-143位
sleereprpr dadsgekedr；
嗜铬蛋白A c段：人嗜铬蛋白A氨基酸序列第322-364位
eeskrwnkmd elakqltskk rmeendsged pdrsmkmafr srk；
嗜铬蛋白A d段：人嗜铬蛋白A氨基酸序列第373-439位
dvrrswkhhs kedsseggfp lapmpeekkd eegsanrrte dqeleslaai
eaelervahk lhelrrg；
为确定最佳抗体组合，将5种嗜铬蛋白A抗体进行特定的组合，得到7种不同的抗体组，即A、B、C、D、E、F、G组成7种试剂，
其中试剂A含抗嗜铬蛋白A a段抗体、抗嗜铬蛋白A c段抗体；
试剂B含抗嗜铬蛋白A a段抗体、抗嗜铬蛋白A d段抗体；
试剂C含抗嗜铬蛋白A b段抗体、抗嗜铬蛋白A c段抗体；
试剂D含抗嗜铬蛋白A c段抗体、抗嗜铬蛋白A d段抗体；
试剂E含抗嗜铬蛋白A a段抗体、抗嗜铬蛋白A全段抗体；
试剂F含抗嗜铬蛋白A c段抗体、抗嗜铬蛋白A全段抗体；
试剂G含抗嗜铬蛋白A d段抗体、抗嗜铬蛋白A全段抗体。
随机选取10例正常人样本和10例神经内分泌肿瘤患者样本，分别用这7种试剂进行平行对比试验，即将两组样本分别用A、B、C、D、E、F、G这7种试剂检测，所得嗜铬蛋白A的检测结果如表1所示。对表1数据进行ROC曲线分析，如图1、表2所示。AUC的值越大代表分类效果越好，C组的AUC最大，值为1，但C组中正常人的嗜铬蛋白A检测值过低，几乎检测不到；其次是F组，值为0.98，因此，选择F组抗体形成的试剂检测人体血浆中嗜铬蛋白A的浓度对神经内分泌肿瘤进行诊断最为有效。
由于嗜铬蛋白A在血液中以全段和其他不同断裂形式的片段存在，而检测试剂中不同的抗体组合导致了嗜铬蛋白A在正常人群及神经内分泌肿瘤患者中的检测值不同，因此，选择分类效果好的试剂是有效区分正常人群和神经内分泌肿瘤患者的关键所在，这将有利于灵敏度和特异性的提高，降低临床检测中出现假阴性和假阳性的概率。
表1使用不同抗体组合在正常人和神经内分泌肿瘤患者中血浆样本嗜铬蛋白A检测结果的差别
表2曲线下的面积
由表1、表2可知，试剂C和F是优选试剂，检测结果数值相比正常人区别大，能够明显鉴别出患病者。
由图1和表2可知，试剂F是最优试剂，线下面积最大，且由表1所示，神经内分泌肿瘤患者与正常人的检测结果数值区别大，能够明显鉴别出患病者。
实验二：为确定参考区间，采用F组试剂检测70例正常人血浆样本，其中男性37例，女性33例，年龄范围在22-68岁，年龄中位数为34岁，经测定，该正常人群的血浆中嗜铬蛋白A的范围为1.0-64.4ng/mL，其中中位数(P50)为14.6ng/mL，用百分位数法求得参考范围，P97.5为48.1ng/mL。
采用F组试剂检测60例患有内分泌性质而非神经内分泌肿瘤疾病的人血浆样本，其中甲旁抗19例、肾衰竭例14例、心力衰竭11、内分泌腺体增生16例，其中男性31例，女性29例，年龄范围在24-65岁，年龄中位数为40岁，经测定，该人群的血浆中嗜铬蛋白A的范围为43.6-121.8ng/mL，其中中位数(P50)为67.2ng/mL，用百分位数法求得参考范围，P97.5为95.0ng/mL。
阴阳性 嗜铬蛋白A含量
阴性 ＜48.1ng/mL
弱阳性 48.1-95ng/mL
强阳性 ＞95ng/mL
嗜铬蛋白A检测试剂对于检验结果的解释如下：
1.若检测到的嗜铬蛋白A的含量低于48.1ng/mL，则可排除神经内分泌肿瘤。
2.若检测到的嗜铬蛋白A的含量在48.1-95ng/mL，则分析如下：
A.有吸烟、酗酒等不良生活习惯；
B.患有甲状旁腺机能亢进、肾衰竭、心力衰竭、内分泌腺体增生等疾病；
C.排除以上两种情况下，提示患有神经内分泌肿瘤。建议用CT、磁共振等影像学检查做最终的定位诊断。
3.若检测到的嗜铬蛋白A的含量高于95ng/mL，提示患有嗜铬细胞瘤和神经内分泌肿瘤(如类癌等)。建议用CT、磁共振等影像学检查做最终的定位诊断。
因为是由F试剂检测得出的参考范围，使用本发明的参考范围，准确度高，检测周期短。
本发明提供一种准确度高、检测周期短的嗜铬蛋白A检测试剂及检测参考区间及检测方法，主要用于定量检测人体血浆中嗜铬蛋白A的浓度，临床上主要用于嗜铬细胞瘤和神经内分泌肿瘤(如肺和小肠类癌、胰腺肿瘤等)辅助诊断和鉴别诊断。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种嗜铬蛋白A检测试剂，其特征在于，包括：免疫复合体，抗体检测体系；
所述免疫复合体由标记后的第一特定抗体，标记后的第二特定抗体，嗜铬蛋白A校准品，嗜铬蛋白A质控品，待测样本复合形成；
所述第一特定抗体，第二特定抗体由抗体与人嗜铬蛋白A氨基酸序列中氨基酸位点进行表位特异性结合形成；
氨基酸位点包括：第1-113位，第131-143位，第337-364位，第373-439位。
2.根据权利要求1所述的一种嗜铬蛋白A检测试剂，其特征在于，所述抗体检测体系为磁珠化学发光检测体系。
3.根据权利要求2所述的一种嗜铬蛋白A检测试剂，其特征在于，包括：嗜铬蛋白A多克隆抗体包被的磁珠，标记物标记的嗜铬蛋白A单克隆抗体，洗涤液，预激发液，激发液，嗜铬蛋白A校准品，嗜铬蛋白A质控品，待测样本。
4.根据权利要求2所述的一种嗜铬蛋白A检测试剂，其特征在于，包括：生物素标记的嗜铬蛋白A多克隆抗体，标记物标记的嗜铬蛋白A包被单克隆抗体，嗜铬蛋白A校准品，嗜铬蛋白A质控品，待测样本，链霉亲和素包被的磁珠，洗涤液，预激发液，激发液。
5.根据权利要求1所述的一种嗜铬蛋白A检测试剂，其特征在于，所述抗体包括：抗嗜铬蛋白A a段抗体，抗嗜铬蛋白A b段抗体，抗嗜铬蛋白A c段抗体，抗嗜铬蛋白A d段抗体；
嗜铬蛋白A a段：人嗜铬蛋白A氨基酸序列第1-113位
vmkcivevis dtlskpnplp iseecletlr gderiisilr hqnllkelqe iaaqganertqqqkknsgfe delsevlesq nnknkqrdaa gerheeeqpt gslaelvaqk iqq；
嗜铬蛋白A b段：人嗜铬蛋白A氨基酸序列第124-143位
sleereprpr dadsgekedr；
嗜铬蛋白A c段：人嗜铬蛋白A氨基酸序列第322-364位
eeskrwnkmd elakqltskk rmeendsged pdrsmkmafr srk；
嗜铬蛋白A d段：人嗜铬蛋白A氨基酸序列第373-439位
dvrrswkhhs kedsseggfp lapmpeekkd eegsanrrte dqeleslaai eaelervahklhelrrg；
由多个抗体组成抗体组合。
6.根据权利要求5所述的一种嗜铬蛋白A检测试剂，其特征在于，所述抗体组合由抗嗜铬蛋白Ac段抗体和抗嗜铬蛋白A全段抗体组成。
7.根据权利要求5所述的一种嗜铬蛋白A检测试剂，其特征在于，所述抗体组合由抗嗜铬蛋白Ab段抗体和抗嗜铬蛋白Ac段抗体组成。
8.一种嗜铬蛋白A检测试剂的检测参考区间，其特征在于，检测试剂，包括：第一特定抗体，第二特定抗体，蛋白抗体分离载体，洗涤液，预激发液，激发液，嗜铬蛋白A校准品，嗜铬蛋白A质控品；
第一特定抗体，第二特定抗体为：抗体与人嗜铬蛋白A氨基酸序列中氨基酸位点进行表位特异性结合；
若检测出的嗜铬蛋白A含量＜48.1ng/mL，则预测为神经内分泌肿瘤阴性；
若检测出的嗜铬蛋白A含量在48.1-95ng/mL范围内，则预测为神经内分泌肿瘤弱阳性；
若检测出的嗜铬蛋白A含量在＞95ng/mL，则预测为神经内分泌肿瘤强阳性。
9.一种嗜铬蛋白A检测试剂的检测方法，其特征在于，嗜铬蛋白A检测试剂，包括：嗜铬蛋白A多克隆抗体包被的磁珠，标记物标记的嗜铬蛋白A单克隆抗体，洗涤液，预激发液，激发液，嗜铬蛋白A校准品，嗜铬蛋白A质控品，待测样本；
检测步骤包括：
在反应杯中每孔添加标记物标记的嗜铬蛋白A单克隆抗体；
添加的校准品、质控品和样本到指定孔；
在各孔添加嗜铬蛋白A多克隆抗体包被的磁珠；
18-37℃孵育15-60min；
用洗涤液洗涤微孔；
在各孔中添加预激发液；
在各孔中添加激发液；
2s内进行读数。
10.一种嗜铬蛋白A检测试剂的检测方法，其特征在于，嗜铬蛋白A检测试剂，包括：生物素标记的嗜铬蛋白A多克隆抗体，标记物标记的嗜铬蛋白A包被单克隆抗体，嗜铬蛋白A校准品，嗜铬蛋白A质控品，待测样本，链霉亲和素包被的磁珠，洗涤液，预激发液，激发液；
检测步骤包括：
在反应杯中每孔添加生物素标记的嗜铬蛋白A多克隆抗体；
各孔添加标记物标记的嗜铬蛋白A包被单克隆抗体；
添加嗜铬蛋白A校准品、嗜铬蛋白A质控品和待测样本到指定孔；
在各孔添加链霉亲和素包被的磁珠；
18-37℃孵育15-60min；
用洗涤液洗涤微孔；
在各孔中添加预激发液；
在各孔中添加激发液；
2s内进行读数。
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