CN106461673A - 用于检测嗜铬粒蛋白a的免疫测定与抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测嗜铬粒蛋白A(或其片段)的免疫测定方法，其包括以下步骤：将怀疑包含嗜铬粒蛋白A的样品与对嗜铬粒蛋白A具有特异性的第一抗体或其抗原结合片段或衍生物，以及对嗜铬粒蛋白A具有特异性的第二抗体或其抗原结合片段或衍生物，在允许嗜铬粒蛋白A与所述两种抗体或其抗原结合片段或衍生物之间形成三元复合体的条件下接触，并检测所述两种抗体或其抗原结合片段或衍生物与嗜铬粒蛋白A的结合。还提供了针对嗜铬粒蛋白A的124位至144位氨基酸残基和280位至301位氨基酸残基的抗体及其在所述免疫测定方法中的用途。

Description

用于检测嗜铬粒蛋白A的免疫测定与抗体
背景技术
嗜铬粒蛋白A(Chromogranin A，CgA)为1965年从牛肾上腺髓质的嗜铬细胞中鉴定并分离的蛋白质(Banks等1965.Biochem J 97：40C-1C；Taupenot等2010.New Eng JMed.348：1134-49)。嗜铬细胞为主要发现于哺乳动物肾上腺髓质中的神经内分泌细胞。嗜铬粒蛋白A是已建立的多种神经内分泌肿瘤的肿瘤标志物，来自于神经内分泌细胞的罕见瘤的异质组包括多发性内分泌瘤形成1型和2型(MEN1/MEN2)、髓样甲状腺癌、类癌肿瘤、胰岛细胞肿瘤、嗜铬细胞瘤/副神经节瘤、低分化/小细胞/非典型肺类癌、肺小细胞癌、Merkel细胞癌(Deftos等1991.Endocr.Rev.12：181-7；Corti等1996.Br J Cancer 73：924-32)并且在若干指南中被提及(Ramage等2012.Gut 61：6-32；Vinik等2010.NANETS Pancreas 39(6)：713-734；Pape等2012.ENETS 95：135-156)。
人嗜铬粒蛋白A具有439个氨基酸残基的序列(参见SEQ ID NO：1)，构成49kDa的酸性糖蛋白，其在内分泌细胞、神经元和神经内分泌细胞的嗜铬颗粒中储存，并且与它们各自的激素、神经递质和神经肽一起从其中释放(Kim等2001.Cell 106：499-509)。
嗜铬粒蛋白A是嗜铬粒蛋白/分泌粒蛋白家族的主要成员，其由一组来源于不同基因但共享许多特征的蛋白质组成，所述特征即大量的酸性氨基酸残基和很多成对的碱性氨基酸作为用于翻译后加工(Metz-Boutigue等1993.Eur.J.Biochem 217：247-257)和切割的潜在位置。
CgA是若干生物活性肽片段的前体，其已被描述于人和其他物种中：血管形成抑制素(Drees等1991.Endocrinology 129：3381-7)、嗜铬粒抑制蛋白(Galindo等1991.ProcNatl Acad Sci U S A 88：1426-30)、chromacin(Strub等1997.J Biol Chem 272：11928-36)、胰抑制素(Tatemoto等1986.Nature 324：476-8)、WE-14(Curry等1992.FEBS Lett301：319-321)、儿荼酚抑素(catestatin)(Mahata等1997.J Clin Invest 100：1623-33)、旁腺抑制素(Fasciotto等1993.Endocrinology 133：461-6)和GE-25(Kirchmair等1995.Biochem J 310(Pt 1)：331-6)。在UniProt数据库中，提到了额外的人嗜铬粒蛋白A的肽(登录号：P 10645)，基于切割位点，其可预测待释放的肽：血管形成抑制素-1包含氨基酸序列1-76，血管形成抑制素-2包含氨基酸序列1-113，EA-92包含氨基酸序列116-207，ES-43包含氨基酸序列210-242，胰抑制素包含氨基酸序列254-301，SS-18包含氨基酸序列304-321，WE-14包含氨基酸序列324-337，WA-8包含氨基酸序列324-331，LF-19包含氨基酸序列340-358，AL-11包含氨基酸序列362-372，GV-19包含氨基酸序列375-393，GR-44包含氨基酸序列395-438并且ER-37包含氨基酸序列402-438。此外，已示出不同的神经内分泌细胞可区别地加工分子(Portela-Gomes等2001.J Histochem Cytochem 4：483-90)。
嗜铬粒蛋白A被描述为许多疾病和病症的生物标志物，所述疾病和病症包括癌症，例如前列腺癌(WO 2013/070088 A1；WO 2013/070089 A1；US 6,238,877 B1；WO 2012/065025 A2)。
目前，4种用于检测嗜铬粒蛋白A的非放射性CE-标记的市售测定是可用的：Cis-Bio ELISA测定(Cisbio Bioassays，Codolet，France)使用2个单克隆抗体，其针对对应于145位至197位氨基酸和219位至234位氨基酸的表位；DAKO ELISA测定(Dako Denmark A/S，Glostrup，Denmark)使用兔多克隆抗体，其针对23kDa的C端片段；Euro-DiagnosticaNEOLISATM夹心ELISA测定(Euro Diagnostica AB，Sweden)使用2个单克隆抗体，其针对对应于236位至251位氨基酸和264位至279位氨基酸的表位(也参见WO 2011/135035A1和WO 99/58980 A1)。
用于检测嗜铬粒蛋白A的仅有的可用的全自动化测定为嗜铬粒蛋白A KRYPTOR测定(Thermo Fisher Scientific B.R.A.H.M.S GmbH，Hennigsdorf，Germany)，其使用2个单克隆抗体，一个单克隆抗体结合对应于250位至301位氨基酸的表位(Popovici等2014.ClinBiochem 47：87-91)。
由于分子的高蛋白质水解作用，这些测定中所测量的浓度可根据所收集样品的储存随时间并且根据在该测定中通过抗体测量的片段而变化，因此对于嗜铬粒蛋白A的改善的测定应着眼于分子最稳定的片段并依据在不同储存条件下的样品稳定性进行评估。
不同的公开描述了抗体表位和测定设计对嗜铬粒蛋白A免疫测定之临床性能的影响(Corti等1996.Eur J.Biochem 235：275-280，Stridsberg等2003.J Endocrinol 177：337-41)。
发明内容
本发明涉及用于检测嗜铬粒蛋白A或其片段的新测定设计。该测定使用一种或更多种与表位结合的抗体，其之前表征为结合不良或不结合的抗原位点(Corti等1996.EurJ.Biochem 235：275-280)。本发明的测定出人意料地示出相比于现有的全自动化嗜铬粒蛋白A KRYPTOR测定(B.R.A.H.M.S GmbH，Hennigsdorf，Germany)，在样品中提高的分析物稳定性。本文所提供的免疫测定还具有广泛的检测范围，即对靶蛋白的检测在至少约9ng/ml至约3mg/ml的浓度范围内是可能的。因为需要稀释更少的样品，所以广泛的检测范围导致了经济的优势。因此，本发明的测定可例如用作研究工具，并且在临床应用中用于在广泛的浓度范围中以高特异性进行嗜铬粒蛋白A的检测。在临床应用的情况下，本发明的测定可用于检测患者样品中的嗜铬粒蛋白A，以用于病症或医学状况的诊断、预后、风险评估、风险分级、治疗控制和/或术后控制。
特别地，本发明提供了用于检测嗜铬粒蛋白A或其片段的免疫测定方法，其包括以下步骤：
a)将怀疑包含嗜铬粒蛋白A的样品与对嗜铬粒蛋白A具有特异性的第一抗体或其抗原结合片段或衍生物，以及对嗜铬粒蛋白A具有特异性的第二抗体或其抗原结合片段或衍生物，在允许嗜铬粒蛋白A与所述两种抗体或其抗原结合片段或衍生物之间形成三元复合体(ternary complex)的条件下接触，并且
b)检测所述两种抗体或其抗原结合片段或衍生物与嗜铬粒蛋白A的结合。
在根据本发明的免疫测定方法中，所述第一抗体可对嗜铬粒蛋白A序列(SEQ IDNO：1)中的表位具有特异性，优选在跨越SEQ ID NO：1的124位至144位氨基酸的序列中的表位。
本发明的免疫测定方法可用于诊断方法的背景中。本发明还涉及用于本发明方法中的抗体和试剂盒。
附图说明
图1示出了使用实施例4的免疫测定方法，利用不同浓度的嗜铬粒蛋白A的标准曲线。
图2示出了相比于现有技术的KRYPTOR嗜铬粒蛋白A测定(Thermo FisherScientific B.R.A.H.M.S GmbH，Hennigsdorf，Germany)，本发明的免疫测定的精确谱(precision profile)(实施例5)。
发明详述
本发明涉及用于检测嗜铬粒蛋白A或其片段的免疫测定方法。所述免疫测定方法基于使用对嗜铬粒蛋白A具有特异性的一种或更多种抗体(优选单克隆抗体)对嗜铬粒蛋白A进行检测。优选地，该免疫测定检测在跨越根据SEQ ID NO：1的嗜铬粒蛋白A序列的124位至144位和/或280位至301位氨基酸残基之序列中的表位。因此，也可以用本文提供的免疫测定检测涵盖嗜铬粒蛋白A序列的124位至144位和/或280位至301位氨基酸残基的嗜铬粒蛋白A的片段。本文中，因此术语“嗜铬粒蛋白A或其片段”或者“嗜铬粒蛋白或其片段”涵盖嗜铬粒蛋白A及其所有包含由本发明的免疫测定所检测之表位的片段，即其可使用本发明的免疫测定检测。优选地，该测定利用至少1种抗体，其检测跨越根据SEQ ID NO：1的嗜铬粒蛋白A序列的124位至144位氨基酸残基之序列中的表位。嗜铬粒蛋白A或根据情况的其片段可根据本发明的免疫测定，通过一种或优选两种抗体与嗜铬粒蛋白A或其片段的结合进行定性和/或定量的检测。在夹心免疫测定(即利用2种抗体)的情况下，如果这两种抗体均结合嗜铬粒蛋白A或其片段，则嗜铬粒蛋白A或其片段的存在将得以检测。换言之，本发明在一个实施方案中涉及用于检测样品中的嗜铬粒蛋白A或其片段的免疫测定，其包括以下步骤：将所述样品与第一抗嗜铬粒蛋白A抗体(或其抗原结合片段或衍生物)，和第二抗嗜铬粒蛋白A抗体(或其抗原结合片段或衍生物)接触，并且检测所述抗体和嗜铬粒蛋白A(或其片段)的三元免疫复合体的存在。所述免疫复合体将在允许所述抗体与所述样品之间发生免疫反应的条件下形成(即在允许所述抗体与嗜铬粒蛋白A或其片段结合的条件下，即夹心测定情况下的三元复合体的形成)。在所述免疫测定中，优选地可使用两种抗体的组合，例如在夹心形式中(参见下文)。因此，本发明涉及用于检测嗜铬粒蛋白A(或其片段)的免疫测定方法，其包括以下步骤：
a)将怀疑包含嗜铬粒蛋白A(或其片段)的样品与对嗜铬粒蛋白A或其片段具有特异性的第一抗体或其抗原结合片段或衍生物，以及对嗜铬粒蛋白A或其片段具有特异性的第二抗体或其抗原结合片段或衍生物接触，并且
b)检测所述两种抗体或其抗原结合片段或衍生物与嗜铬粒蛋白A或其片段的结合。在根据本发明的免疫测定方法中，所述第一抗体优选对嗜铬粒蛋白A序列(SEQ ID NO：1)中的表位具有特异性，优选在跨越SEQ ID NO：1的124位至144位氨基酸之序列中的表位。所述第一抗体优选为单克隆抗体。
本发明还涉及用于检测嗜铬粒蛋白A(或其片段)的免疫测定方法，其包括以下步骤：
a)将怀疑包含嗜铬粒蛋白A(或其片段)的样品与对嗜铬粒蛋白A或其片段具有特异性的第一抗体或其抗原结合片段或衍生物，以及对嗜铬粒蛋白A或其片段具有特异性的第二抗体或其抗原结合片段或衍生物，在允许嗜铬粒蛋白A或其片段与所述两种抗体或其抗原结合片段或衍生物之间形成三元复合体的条件下接触，并且
b)检测所述两种抗体或其抗原结合片段或衍生物与嗜铬粒蛋白A或其片段的结合。在根据本发明的免疫测定方法中，所述第一抗体优选对嗜铬粒蛋白A序列(SEQ ID NO：1)中的表位具有特异性，优选在跨越SEQ ID NO：1的124位至144位氨基酸之序列中的表位。所述第一抗体优选为单克隆抗体。
本发明还涉及用于检测嗜铬粒蛋白A或其片段的免疫测定方法，其包括以下步骤：
a)将怀疑包含嗜铬粒蛋白A的样品与对嗜铬粒蛋白A或其片段具有特异性的抗体或其抗原结合片段或衍生物在允许嗜铬粒蛋白A与所述抗体或其抗原结合片段或衍生物之间形成免疫复合体的条件下接触，其中所述第一抗体对跨越嗜铬粒蛋白A序列(SEQ ID NO：1)的124位至144位氨基酸的表位具有特异性。该对跨越嗜铬粒蛋白A序列的124位至144位氨基酸的表位具有特异性的抗体优选为由杂交瘤细胞系537/H2产生的抗体，所述细胞系于2014年2月20日以DSM ACC3231保藏于Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)，Inhoffenstraβe 7B，38124Braunschweig，Germany。
下文中，除非另有说明，否则术语“抗体”还包括抗原结合片段或衍生物。
术语“抗体”通常包括单克隆和多克隆抗体及其结合片段，特别是Fc-片段以及所谓的“单链抗体”(Bird R.E.等(1988)Science 242：423-6)，嵌合、人源化的，特别是CDR移植的抗体，以及双抗体或四抗体(Holliger P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-8)。还包括免疫球蛋白样蛋白，通过包括例如特异性结合样品中含有之目的分子的噬菌体展示的技术对其进行选择。在上下文中，术语“特异性”和“特异性结合”指针对目的分子或其片段产生的抗体。如果抗体对目的分子(此处为嗜铬粒蛋白A)或前文提及的其片段的亲和力比含有目的分子的样品中所包含的其他分子高至少50倍，优选高100倍，最优选高至少1000倍，则认为该抗体为特异性的。如何开发并选择具有给定特异性的抗体在本领域中是公知的。如上文所陈述的，优选单克隆抗体。
将在下文中更详细地讨论，本文所描述的免疫测定方法的(第一和/或第二)抗体或其抗原结合片段或衍生物可例如为多克隆抗体、单克隆抗体或经遗传改造的单克隆抗体。
在根据本发明的免疫测定方法中，所述第一抗体可对嗜铬粒蛋白A序列(SEQ IDNO：1)中的表位具有特异性，优选在跨越SEQ ID NO：1的124位至144位氨基酸之序列中的表位。所述第一抗体优选为单克隆抗体。
在根据本发明的免疫测定方法中，所述第二抗体可对嗜铬粒蛋白A序列(SEQ IDNO：1)中的表位具有特异性，优选在跨越SEQ ID NO：1的280位至301位氨基酸之序列中的表位。所述第二抗体优选为单克隆抗体。
在本发明免疫测定的一个具体实施方案中，所述第一抗体对在嗜铬粒蛋白A序列(SEQ ID NO：1)中跨越124位至144位氨基酸残基的表位具有特异性，并且所述第二抗体对在嗜铬粒蛋白A序列(SEQ ID NO：1)中跨越280位至301位氨基酸残基的表位具有特异性。所述第一和第二抗体优选为单克隆抗体。
所述第一抗体或其抗原结合片段或衍生物可例如由杂交瘤细胞系537/H2产生，该细胞系于2014年2月20日以DSM ACC3231保藏于DSMZ(Inhoffenstraβe 7B，38124Braunschweig，Germany)。由杂交瘤细胞系537/H2产生的抗体特异性地结合嗜铬粒蛋白A序列(SEQ ID NO：1)的124位至144位氨基酸残基，即结合SEQ ID NO：2。其针对SEQ ID NO：4的抗原肽产生。
所述第二抗体或其抗原结合片段或衍生物可例如由杂交瘤细胞系541/E2产生，该细胞系于2014年2月20日以DSM ACC3232保藏于DSMZ，Inhoffenstraβe 7B，38124Braunschweig，Germany。由杂交瘤细胞系541/E2产生的抗体特异性地结合嗜铬粒蛋白A序列(SEQ ID NO：1)的280位至301位氨基酸残基，即结合SEQ ID NO：3。其针对SEQ ID NO：5的抗原肽产生。
本发明免疫测定方法的一个具体实施方案中，所述第一抗体由杂交瘤细胞系537/H2产生，该细胞系于2014年2月20日以DSM ACC3231保藏于DSMZ，Inhoffenstraβe 7B，38124Braunschweig，Germany，并且所述第二抗体由杂交瘤细胞系541/E2产生，该细胞系于2014年2月20日以DSM ACC3232保藏于DSMZ，Inhoffenstraβe 7B，38124 Braunschweig，Germany。
抗体与嗜铬粒蛋白A(或其片段)的结合发生于合适的条件下(即允许免疫反应，即该抗体与嗜铬粒蛋白A结合并形成免疫复合体)。这样的条件对于技术人员是已知的，并且可使用免疫测定的标准形式，例如下文中所描述的。这样的条件优选为在生理温度、pH和离子强度下，并可在例如磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline，PBS)的介质中进行。
优选的测定方法包括多种形式的免疫测定，例如放射性免疫测定(radioimmunoassay，RIA)、化学发光和荧光免疫测定、酶免疫测定(enzyme immunoassay，EIA)、酶联免疫测定(Enzyme-linked immunoassays，ELISA)、基于Luminex的珠阵列、蛋白质微阵列测定，快速测试形式例如免疫层析试纸条测试(immunochromatographic striptest)，以及选择/多反应监测(Selected/Multiple reaction monitoring，SRM/MRM)。
所述测定可为均质或异质测定、竞争性和非竞争性测定。在一个特别优选的实施方案中，该测定为夹心测定的形式，其为非竞争性免疫测定，其中待检测和/或定量的分子与第一抗体结合和第二抗体结合。所述第一抗体可结合于固相，例如珠、孔或其他容器的表面、芯片或试纸条，并且所述第二抗体为例如用染料、用放射性同位素，或者反应或催化活性部分标记的抗体，反之亦然。然后通过适当的方法测量结合于分析物的经标记抗体的量。涉及“夹心测定”的一般组合物和过程已建立完善并为技术人员所知(The ImmunoassayHandbook，David Wild编辑，Elsevier LTD，Oxford；第三版(2005年5月)，ISBN-13：978-0080445267；Hultschig C等，Curr Opin Chem Biol.2006年2月；10(1)：4-10.PMID：16376134，其通过引用并入本文)。
在一个特别优选的实施方案中，所述测定包括两种抗体，其均以液体反应混合物中的分散体存在，其中第一标记组分连接第一抗体，其中所述第一标记组分为基于荧光或化学发光淬灭或放大的标记系统的一部分，并且所述标记系统的第二标记组分连接第二抗体，以使得当两种捕获分子均与分析物结合后，产生可测量的信号，其允许检测包含该样品的溶液中所形成的夹心复合体。
甚至更优选的，所述标记系统可包含稀土穴合物或稀土螯合物，其与荧光染料或化学发光染料，特别是花青型染料组合。
在本发明的上下文中，基于荧光的测定可包括使用染料，其可例如选自包括以下的组：FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate，FITC)、IRD-700/800、花青染料如CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7，呫吨(Xanthen)、6-羧基-2′，4′，7′，4，7-六氯荧光素(HEX)、TET、6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素(JOE)、N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明110、BODIPY染料如BODIPY TMR、Oregon Green、香豆素如伞形酮、苯甲亚胺如Hoechst 33258；菲啶如Texas Red、YakimaYellow、Alexa Fluor、PET、溴化乙锭、吖啶染料、咔唑染料、吩嗪染料、卟啉染料、多次甲基染料等。
在本发明的上下文中，基于化学发光的测定包括使用染料，其基于Kirk-Othmer，Encyclopedia of chemical technology，第4版，执行编辑，J.I.Kroschwitz；编辑，M.Howe-Grant，John Wiley&Sons，1993，第15卷，518-562页(其通过引用并入本文)中对化学发光材料的物理原理的描述，其包括551页至562页上的引用。优选的化学发光染料为吖啶酯。嗜铬粒蛋白A可例如使用B.R.A.H.M.S KRYPTOR紧凑型PLUS仪器(Thermo ScientificB.R.A.H.M.S GmbH，Hennigsdorf/Berlin，Germany)上的全自动化夹心免疫测定系统进行检测。该随机访问分析仪利用敏感的时间分辨扩大的穴合物发射(Time ResolvedAmplified Cryptate Emmission，TRACE)技术，其基于两个荧光团之间的非放射性转移。
在本发明的一些具体实施方案中，抗体之一(例如第一抗体)被标记且另一抗体(例如第二抗体)结合于固相或能够选择性地结合于固相。然而，如上文所提及，在本发明方法的上下文中，优选所述第一和第二抗体分散地存在于液体反应混合物中，并且其中作为基于荧光或化学发光消灭或放大的标记系统的一部分的第一标记组分结合于所述第一抗体，并且所述标记系统的第二标记组分结合于所述第二抗体，以使得在将这两种抗体均与嗜铬粒蛋白A(或其片段)结合后产生可测量的信号，其允许检测该测量溶液中的所得夹心复合体。
如本文中所提及的，“测定”或“诊断性测定”可为应用于诊断领域的任何类型。这样的测定可基于待检测的分析物与一种或更多种具有特定亲和力的捕获探针的结合。考虑到抗体与靶分子或目的分子之间的相互作用，亲和常数优选大于108 M-1。
本发明的免疫测定方法可用于诊断和/或预后方法的情况中，其中在来自于待诊断对象的样品中检测嗜铬粒蛋白A(或其片段)的水平或者存在与否。嗜铬粒蛋白A涉及许多疾病和病症，包括类癌肿瘤、神经内分泌肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、胃炎、肺部疾病、心肌梗塞、高血压、心力衰竭、肺部疾病、血栓溶解、肥胖和糖尿病。因此，本发明的免疫测定可用于选自以下的疾病或病症的诊断：癌症(包括类癌肿瘤、神经内分泌肿瘤、前列腺癌和膀胱癌)、胃炎、肺部疾病、心肌梗塞、高血压、心力衰竭、肺部疾病、血栓溶解、肥胖和糖尿病。
测定的“敏感性”指正确地鉴定的实际阳性的比例，即鉴定阳性结果的能力(真阳性的阳性结果/阳性的数量)。因此，用测定可检测的分析物的浓度越低，该测定越敏感。测定的“特异性”指正确地鉴定的阴性的比例，即鉴定阴性结果的能力(真阴性/阴性结果)。对于抗体，“特异性”定义为单独的抗原结合位点与仅一个抗原表位反应的能力。抗体的结合行为也可根据其“亲和力”及其“亲合力”进行表征。抗体的“亲和力”为单个抗原表位与单个抗原结合位点之间反应强度的度量。抗体的“亲合力”为具有许多表位的抗原与多价抗体之间结合的整体强度的度量。
诊断和/或预后测试的敏感性和特异性不仅取决于测试的分析“质量”，它们也取决于由什么构成了异常结果的限定。在实践中，通常通过相对于变量在“正常”(即未患有产前疾病或病症的表面健康个体)和“患病”群体中的相对频率绘制变量的值来计算接受者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic curve，ROC曲线)。对于任何特定的标志物，患有和未患有疾病的对象的标志物水平的分布将可能重叠。在这样的条件下，测试不会以100％的准确率绝对地区分正常与患病，并且重叠区域指示了该测试不能区分正常与患病的区域。选择阈值，在其下认为该测试是异常的，而在其上则认为该测试是正常的。ROC曲线下方的面积为感知的测量将允许正确鉴定病症之可能性的度量。甚至当测试结果不必然提供准确数字时也可使用ROC曲线。只要可将结果排列，即可创建ROC曲线。例如，某测试对于“疾病”样品的结果可根据程度进行排列(例如1＝低，2＝正常，而3＝高)。该排列可与“正常”群体的结果相关，并且创建ROC曲线。这些方法是本领域中公知的。参见例如Hanley等1982.Radiology 143：29-36。优选地，选择阈值以提供这样的ROC曲线面积：大于约0.5，更优选大于约0.7，仍然更优选大于约0.8，甚至更优选大于约0.85，并且最优选大于约0.9。术语“约”在该上下文中指给定测量值的+/-5％。
ROC曲线的水平轴代表(1-特异性)，其随着假阳性的比率而提高。该曲线的纵轴代表敏感性，其随着真阳性的比率而提高。因此，对于特别选择的截断(cut-off)，可确定(1-特异性)的值，并且可获得对应的敏感性。ROC曲线下的面积为所测量的标志物水平将允许正确鉴定疾病或病症之可能性的度量。因此，ROC曲线下的面积可用于确定测试的效力。
在另一些实施方案中，将阳性似然比、阴性似然比、比值比或风险比用作测试之预测风险或诊断疾病或病症(“患病组”)的能力的度量。在阳性似然比的情况下，1的值表示阳性结果在“患病”和“对照”组的对象中可能性相等；大于1的值表示在患病组中阳性结果更为可能；并且小于1的值表示在对照组中阳性结果更为可能。在阴性似然比的情况下，1的值表示阴性结果在“患病”和“对照”组的对象中可能性相等；大于1的值表示在测试组中阴性结果更为可能；并且小于1的值表示在对照组中阴性结果更为可能。
在比值比的情况下，1的值表示阳性结果在“患病”和“对照”组的对象中可能性相等；大于1的值表示在患病组中阳性结果更为可能；并且小于1的值表示在对照组中阳性结果更为可能。
在风险比的情况下，1的值表示终点(例如死亡)的相对风险在“患病”和“对照”组中相等；大于1的值表示在患病组中的风险更大；并且小于1的值表示在对照组中的风险更大。
技术人员将理解，将诊断或预后指示物与未来临床后果的诊断或预后风险相关联是统计学分析。例如，通过统计学显著性水平确定，低于X的标志物水平可指示患者比水平大于或等于X的患者更有可能遭受不良后果。此外，标志物浓度从基线水平发生变化可能反映患者的预后，并且标志物水平变化的程度可能与不良事件的严重程度相关。统计学显著性通常通过比较2个或更多群体确定，并且确定置信区间和/或p值。参见，例如，Dowdy和Wearden，Statistics for Research，John Wiley&Sons，New York，1983。本发明优选的置信区间为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％和99.99％，而优选的p值为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001和0.0001。
本发明还涉及用于检测嗜铬粒蛋白A的试剂盒，其包含：
(i)对嗜铬粒蛋白A或其片段具有特异性的第一抗体或其抗原结合片段或衍生物；以及
(ii)对嗜铬粒蛋白A或其片段具有特异性的第二抗体或其抗原结合片段或衍生物。
所述试剂盒的第一和第二抗体优选对相同的嗜铬粒蛋白A片段具有特异性。
例如，(i)第一抗体或其抗原结合片段或衍生物对包含于SEQ ID NO：1序列内的表位具有特异性；和/或(ii)第二抗体或其抗原结合片段或衍生物对包含于SEQ ID NO：1序列内的表位具有特异性。优选地，所述试剂盒的第一抗体为由保藏为DSM ACC3231的杂交瘤细胞系537/H2产生的单克隆抗嗜铬粒蛋白A抗体，和/或第二抗体为由保藏为DSM ACC3232的杂交瘤细胞系541/E2产生的单克隆抗嗜铬粒蛋白A抗体。
本发明还提供了选自保藏为DSM ACC3231的细胞系537/H2和保藏为DSM ACC3232的细胞系541/E2的杂交瘤细胞系。
本发明例如还涉及根据本发明的试剂盒在夹心免疫测定形式中用于对来自体液的生物样品中之嗜铬粒蛋白A或其片段进行检测和/或定量的用途。这样的片段在一个实施方案中至少包含跨越所述两种抗体针对的两个表位的序列，例如所述试剂盒可用于检测和/或定量嗜铬粒蛋白A。
术语“样品”优选为生物样品。本文所使用的“样品”可例如指所获得的用于诊断、预后或评估目的对象(如患者)之目的的体液或组织的样品。
用于本发明目的的“患者”或“对象”包括人类和其他动物，特别是哺乳动物，以及其他生物体。因此，该方法可用于人诊断和兽医学应用两者。在一个优选的实施方案中，所述患者为哺乳动物，并且在最优选的实施方案中，所述患者或对象为人。
本文中优选地，所述样品为对象的体液或组织的样品。优选体液样品。优选的测试样品包括血液、血清、血浆、脑脊液、尿、唾液、痰和胸腔积液。此外，本领域技术人员将意识到，一些测试样品在分级或纯化过程后将更加容易地分析，例如将全血分离为血清或血浆组分。
因此，在本发明的一个优选实施方案中，样品选自包括以下的组：血液样品、血清样品、血浆样品、脑脊液样品、唾液样品和尿样品或者任何前述样品的提取物。优选地，所述样品为血液样品，更优选为血清样品或血浆样品。在本发明的上下文中，血清样品为最优选的样品。
在本发明的上下文中，“血浆”实质上为在离心后获得的含有抗凝血剂之血液的无细胞上清液。示例性的抗凝血剂包括结合钙离子的化合物如EDTA或柠檬酸盐，以及凝血酶抑制剂如肝素盐类或水蛭素。无细胞的血浆可通过对抗凝的血液(例如柠檬酸化的、EDTA化或肝素化的血液)以2000g至3000g离心至少15分钟获得。
“血清”为使血液凝块后收集的全血的液体级分。当凝固的血液(凝块的血液)经离心时可获得作为上清液的血清。其不含有纤维蛋白原，尽管仍保留一些凝血因子。
适当时，在用于本发明之前，样品可能需要被均质化，或用溶剂提取以获得液体样品。以此方式的液体样品可为溶液或混悬液。液体样品可在用于本发明之前进行一个或更多个预处理。这样的预处理包括，但不限于稀释、过滤、离心、浓缩、沉降、沉淀、透析。预处理也可包括向溶液添加化学或生物化学物质，如酸、碱、缓冲液、盐、溶剂、反应性染料、洗涤剂、乳化剂、螯合剂。
本发明的方法还涉及在样品中确定嗜铬粒蛋白A(或其片段)的水平，以用于医学状况的诊断或预后或风险评估或筛选或治疗控制或术后控制。
因此，本发明的免疫测定、抗体或试剂盒可用于对象的病症或医学状况的诊断、预后、风险评估、风险分级、治疗控制和/或术后控制。
在本发明的上下文中，本发明的免疫测定、抗体或试剂盒因此可用于病症的治疗控制和术后控制，其中所述病症可为不同类型的癌症。
如上文中所提及，在本发明的上下文中，对象的病症或医学状况可优选地选自癌症(包括类癌肿瘤、神经内分泌肿瘤、前列腺癌和膀胱癌)、胃炎、肺部疾病、心肌梗塞、高血压、心力衰竭、肺部疾病、血栓溶解、肥胖和糖尿病。
在本发明的上下文中，对象的病症或医学状况优选地选自：包括神经内分泌肿瘤(neuroendocrine tumour，NET)，包括嗜铬细胞瘤、胰腺NET、胃肠NET、神经母细胞瘤、髓样甲状腺癌、小细胞肺癌、多发性内分泌瘤形成1和多发性内分泌瘤形成2综合征、前列腺癌、心血管疾病、涉及感染的病症和脓毒症。
术语“生物标志物”(生物学标志物)涉及可测量且可定量的生物学参数(例如，具体的酶浓度、具体的激素浓度、在群体中的具体基因表型分布、生物学物质的存在)，其充当健康和生理相关评估的指标，如疾病风险、精神疾病、环境暴露及其作用、疾病诊断、代谢过程、物质滥用、妊娠、细胞系发育、流行病学研究等。此外，生物标志物以这样的特征定义：作为正常生物学过程、致病过程，或对治疗介入的药理学响应的指标被客观地测量与评估。生物标志物可在生物样品(如血液、尿或组织测试)上测量，其可为获自人(血压、ECG或Holter)的记录，或其可为成像测试(子宫胎盘多普勒超声，或颈部透明带(Conde-Agudelo等2004.Obstet Gynecol 104：1367-1391；Bindra等2002.Ultrasound Obstet Gynecol20：219-225))。生物标志物可指示多种健康或疾病特征，包括暴露于环境因素的水平或类型、遗传易感性、对暴露的遗传响应、亚临床或临床疾病的生物标志物，或者对治疗响应的指示物。因此，考虑生物标志物的简单方式是作为疾病特征(风险因素或风险生物标志物)的指示物、疾病状态(临床前或临床)，或疾病速度(进程)。因此，生物标志物可被分类为前期生物标志物(鉴定发生疾病的风险)、筛选生物标志物(筛选亚临床疾病)、诊断生物标志物(识别明显的疾病)、分期生物标志物(将疾病严重程度归类)或预后生物标志物(预测未来疾病进程，包括复发和对治疗的响应，以及监测治疗的功效)。生物标志物也可充当替代的终点。替代的终点是这样的终点，其可用作临床试验中的结果以评估治疗的安全性和效力，以代替对目的真实结果的测量。基本原理是替代的终点的变化会密切地追踪目的结果的变化。替代的终点具有的优势为相比于需要大量临床试验用于评估的终点(如发病率和死亡率)，其可在较短的时间范围内采集并且费用较低。替代的终点的另外的价值包括这样的事实，它们与目的暴露/介入更为接近并且比更远的临床事件相比可更容易地因果相关。替代的终点的一个重要优势在于，如果目的临床结果受到多种因素(除了替代的终点之外)的影响，则残留的混杂因素可降低所述替代的终点的有效性。建议如果替代的终点可解释暴露或介入对目的结果至少50％的作用，则其有效性更大。例如，生物标志物可为蛋白质、肽或核酸分子。
本文中的“嗜铬粒蛋白A”指人嗜铬粒蛋白A。人嗜铬粒蛋白A的氨基酸序列在SEQID NO：1中给出。根据本发明的嗜铬粒蛋白A多肽或衍生物也可具有翻译后修饰，如糖基化、脂化或衍生化。
在本发明的上下文中，“诊断”涉及对象的疾病或临床状况的识别和(早期)检测，并且还可包括区别诊断。在某些实施方案中，术语“诊断”也涵盖疾病或临床状况严重程度的评估。
“预后”涉及预测对患有特定的疾病或临床病症之对象的结果或具体风险。这可包括估计所述对象恢复的机会或不良后果的机会。
在本发明中，术语“风险评估”或“风险分级”涉及将对象根据其进一步的预后分入不同的风险组中。风险分级也涉及用于应用预防性和/或治疗性措施的分级。
在本发明的上下文中，术语“治疗控制”指监测和/或调整所述患者的治疗处理。
在本发明的上下文中，术语“术后控制”指在所述患者的手术过程之后对所述患者进行监测。
在本发明的上下文中，术语“筛选”指调查群体的过程，其使用具体的标志物并限定筛选的截断水平，以鉴定群体中对特定病症具有更高风险的个体。筛选可应用于群体；诊断应用于个体患者水平。
以下实施例和图用于更详细地解释本发明，但不将本发明限制于所述实施例与图。
本文所引用的所有专利和非专利参考文献均通过引用以其整体并入本文。
序列：
序列1(SEQ ID NO：1)：无信号肽的人嗜铬粒蛋白A(CGA)(UniProt登录号P10645)；抗原表位以下划线标出：
序列2(SEQ ID NO：2)：人嗜铬粒蛋白A(CGA)的表位1(对应于SEQ ID NO：1的124位至144位残基)：
1 11 21
SGEATDGARP QALPEPMQES K
序列3(SEQ ID NO：3)：人嗜铬粒蛋白A(CGA)的表位2(对应于SEQ ID NO：1的280位至301位残基)：
1 11 21
EHSQQKEEEE EMAVVPQGLF RG
序列4(SEQ ID NO：4)：人嗜铬粒蛋白A(CGA)的抗原肽片段(对应于SEQ ID NO：1的124位至144位残基以及在N端的额外的半胱氨酸)：
1 11 21
CSGEATDGAR PQALPEPMQE SK
序列5(SEQ ID NO：5)：人嗜铬粒蛋白A(CGA)的抗原肽片段(对应于SEQ ID NO：1的280位至301位残基以及在N端的额外的半胱氨酸)：
1 11 21
CEHSQQKEEE EEMAVVPQGL FRG
实施例
实施例1：抗体的产生
单克隆抗体的开发
如下制备免疫原：将对应于嗜铬粒蛋白A分子的124位至144位氨基酸区域且在其N端具有额外的半胱氨酸的CSGEATDGARPQALPEPMQESK(SEQ ID NO：4)肽与载体(carrier)BSA共价交联。将对应于嗜铬粒蛋白A分子的280位至301位氨基酸区域且在其N端具有额外的半胱氨酸的CEHSQQKEEEEEMAVVPQGLFRG(SEQ ID NO：5)肽与载体BSA共价交联。
针对嗜铬粒蛋白A的124位至144位和280位至301位肽的单克隆抗体通过标准程序(Harlow E，Lane D.Antibodies-A Laboratory Manual.C0ld Spring Harbor：ColdSpring Harbor Laboratory，1988；Lane 1985.Journal of Immunology Methods 81：223-228)产生。
将8周龄的雌性Balb/c小鼠分别用稀释于完全弗氏佐剂的100μg124位至144位或280位至301位肽通过腹膜内注射进行免疫。使用不完全弗氏佐剂以50μg的剂量并在61天内以不同的时间间隔完成下一次注射。
在融合之前，使用ELISA用124位至144位或280位至301位固定的肽在接受者血清中对所需抗体的存在进行检测。然后，通过ELISA用固定的重组CGA(通过法国国家科学研究中心(French National of Scientific Research)，“Plate-forme de Production deProtéines Recombinantes”CRBM UMR 5237CNRS，Montpellier制备重组嗜铬粒蛋白A)筛选克隆537/H2和541/E2。
对于同种型表征，使用了小鼠单克隆抗体分型试剂盒(Roche)。
根据制造商的说明，通过蛋白质A快速流动亲和层析术(GE Healthcare LifeSciences)纯化抗体。
抗体的标记
在最终的测定中，将抗体537/H2与铕穴合物(CisBio Bioassays，Marcoule，France)偶联并且将抗体541/E2与Alexa Fluor(Life Technologies，现为ThermoFisher Scientific的一部分)偶联。根据制造商的方案进行偶联反应。
实施例2：使用124位至144位/280位至301位氨基酸区域靶向的抗体开发嗜铬粒蛋白A测定
开发了使用时间分辨扩大的穴合物发射(TRACE)技术(Mathis，1993.Clin Chem39(9)：1953-9)的均质夹心荧光免疫测定以用于检测稳定的嗜铬粒蛋白A片段。
在使用前，将储备的穴合物-537/H2缀合的抗体和Alexa-541/E2缀合抗体用测定缓冲液(100mM磷酸盐pH 7，422mM KF，0.1％牛血清白蛋白，0.15mg/ml小鼠Ig和0.07mg/ml牛Ig)分别稀释为0.265μg/ml和2.94μg/ml。
将重组嗜铬粒蛋白A在马血清中稀释以提供嗜铬粒蛋白A标准品。根据制造商的说明，通过在37℃下在B.R.A.H.M.S KRYPTOR仪器(Thermo Fisher Scientific B.R.A.H.M.SGmbH，Hennigsdorf/Berlin，Germany)上将14μl的样品/标准品、68μl的Alexa-541/E2缀合抗体溶液和68μl的穴合物-537/H2缀合的抗体溶液孵育来进行免疫测定。该测定的反应时间为29分钟。通过使用B.R.A.H.M.S KRYPTOR仪器在665nm和620nm的同时双波长测量来测量特异性荧光(RFU)。直接读取范围被限定为多至3000ng/ml并且估计功能测定敏感性为13.1ng/ml。
实施例3：使用CgA II测定进行的血清样品库中的嗜铬粒蛋白A的稳定性追踪(Stability following)
将收集后即冷冻于≤-16℃的三个血清样品库用于该研究。
一个库从健康个体血清样品制得(库1)并且另两个库从病理血清样品制得(库2和3)。
测量时间点为：在2-8℃，1天、2天和3天后；在18-25℃，1天、2天和3天后；1个、2个和3个冷冻/解冻循环后。
在KRYPTOR仪器上进行测量，用上文描述的试剂与条件完成该测量。
认为样品的稳定性可接受所规定的标准是在不同的条件下丧失≤10％。
所获得的结果(表1)示出，(537/H2-穴合物；541/E2-Alexa)KRYPTOR测定对多至3个冷冻/解冻循环，在2-8℃下1天或在18-25℃下1天不敏感。所述2个病理库的稳定性好于健康供体库所观察到的稳定性，因为在2-8℃或18-25℃下3天后仅观察到有限的浓度降低(≤11％)。
表1：使用537/H2-穴合物；541/E2-Alexa在KRYPTOR上进行的3个血清样品库的稳定性追踪
实施例4：校正曲线
图1示出了使用时间分辨扩大的穴合物发射(TRACE)技术的(537/H2-穴合物；541/E2-Alexa)KRYPTOR测定的剂量响应曲线。
基于该校正曲线，(537/H2-穴合物；541/E2-Alexa)KRYPTOR测定的直接读取范围被限定为多至3000ng/ml。
实施例5：精密度谱(precision profile)和敏感性
在上文所描述的条件以及现有技术KRYPTOR嗜铬粒蛋白A测定(Thermo FisherScientific B.R.A.H.M.S GmbH，Hennigsdorf，Germany)下，使用537/H2和541/E2抗体对91个样品(24个来自健康供体的样品和67个病理样品)平行地进行测量。重复进行测量并针对嗜铬粒蛋白A浓度在相同的图上绘制每个重复的变异系数。所述精密度谱对这两种测定等同。KRYPTOR嗜铬粒蛋白A测定所声称的功能测定敏感性为9.04ng/ml；用(537/H2-穴合物；541/E2-Alexa)KRYPTOR测定，对于10％CV估计的功能测定敏感性为13.1ng/ml。
PCT/RO/134表

Claims (15)

1.用于检测嗜铬粒蛋白A或其片段的免疫测定方法，其包括以下步骤：
a)将怀疑包含嗜铬粒蛋白A的样品与
(i)对嗜铬粒蛋白A具有特异性的第一抗体或其抗原结合片段或衍生物，其中所述第一抗体或其抗原结合片段或衍生物对包含于跨越根据SEQ ID NO：1之124位至144位氨基酸残基的序列中的表位具有特异性，以及
(ii)对嗜铬粒蛋白A具有特异性的第二抗体或其抗原结合片段或衍生物，
在允许嗜铬粒蛋白A与所述两种抗体或其抗原结合片段或衍生物之间形成三元复合体的条件下接触，并且
b)检测所述两种抗体或其抗原结合片段或衍生物与嗜铬粒蛋白A的结合。
2.根据权利要求1所述的免疫测定方法，其中所述第二抗体或其抗原结合片段或衍生物对包含于跨越根据SEQ ID NO：1之280位至301位氨基酸残基的序列中的表位具有特异性。
3.根据权利要求1或2所述的免疫测定方法，其中所述第一抗体由保藏为DSM ACC3231的杂交瘤细胞系537/H2产生。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫测定方法，其中所述第二抗体由保藏为DSMACC3232的杂交瘤细胞系541/E2产生。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫测定方法，其中所述样品来源于对象的体液或组织，例如选自血液、血清、血浆和尿的体液。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫测定方法，其中所述测定在均相中或异质相中进行。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的免疫测定方法，其中所述抗体之一被标记且另一抗体结合于固相或能够选择性地结合于固相。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的免疫测定方法，其中所述第一抗体和所述第二抗体分散地存在于液体反应混合物中，并且其中作为基于荧光或者化学发光熄灭或放大的标记系统的一部分的第一标记组分结合于所述第一抗体，并且所述标记系统的第二标记组分结合于所述第二抗体，以使得在这两种抗体均与待检测的所述嗜铬粒蛋白A结合后产生可测量的信号，所述信号允许检测测量溶液中所得的夹心复合体。
9.根据权利要求8所述的免疫测定方法，其特征在于所述标记系统包含稀土穴合物或螯合物，其与荧光或化学发光染料，特别是花青型染料组合。
10.单克隆抗体，其由选自保藏为DSM ACC3231的细胞系537/H2和保藏为DSM ACC3232的细胞系541/E2的杂交瘤细胞系产生。
11.用于检测嗜铬粒蛋白A的试剂盒，其包含
(i)对嗜铬粒蛋白A具有特异性的第一抗体或其抗原结合片段或衍生物，其中所述第一抗体或其抗原结合片段或衍生物对包含于跨越SEQ ID NO：1之124位至144位氨基酸的序列中的表位具有特异性，以及
(ii)对嗜铬粒蛋白A具有特异性的第二抗体或其抗原结合片段或衍生物。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述第二抗体或其抗原结合片段或衍生物对包含于跨越嗜铬粒蛋白A的SEQ ID NO：1之280位至301位氨基酸的序列中的表位具有特异性。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中
(i)所述第一抗体选自保藏为DSMACC3231的细胞系537/H2，
(ii)所述第二抗体选自保藏为DSMACC3232的细胞系541/E2。
14.根据权利要求1至9中任一项所述的免疫测定方法、根据权利要求10所述的抗体、根据权利要求11至13中任一项所述的试剂盒用于对象的病症或医学状况的诊断、预后、风险评估、风险分级、治疗控制和/或术后控制的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述病症或医学状况选自癌症、胃炎、肺部疾病、心肌梗死、高血压、心力衰竭、肺部疾病、血栓溶解、肥胖和糖尿病。
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