CN103597357B - 生长抑素原的诊断用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于患者中不包括生长抑素瘤的胃肠道活动和/或功能紊乱和/或营养状况紊乱的诊断、预后、监测和风险评估的方法，其包括步骤：提供患者的体液样品；测定所述样品中生长抑素原1-64或其片段的水平；使生长抑素原1-64或其片段的水平与所述患者中不包括生长抑素瘤的胃肠道活动和/或功能紊乱和/或营养状况紊乱的诊断、预后和风险评估相关，其中所述片段具有至少6个氨基酸残基长度。本发明也涉及抗体和含有至少两种抗体的试剂盒。

Description

生长抑素原的诊断用途
发明领域
发明涉及检测生物样品中的生长抑素原1-64(proSomatostatin1-64)及其片段和检测生长抑素原1-64及其片段用于患有胃肠道活动和/或功能紊乱和/或营养状况紊乱(不包括生长抑素瘤)的患者的诊断、预后、监测和风险评估的用途。
发明背景
生长抑素(SST，也称作SRIF)首先被描述为作为人生长激素分泌(hGH)的强力抑制剂发挥作用的下丘脑分泌产物(Siler等人,1973.J ClinEndocrinolMetab37:632-634)。后来，发现生长抑素在许多组织中例如在中枢及外周神经系统、胰、胃肠道内合成并且在甲状腺、肾、肾上腺髓质、下颌腺、前列腺和胎盘中以较低量合成。
人成熟生长抑素源自较大的前体分子(前生长抑素原1-116(前SST原1-116；SEQIDNO:1)；生长抑素原1-92(SST原1-92；SEQIDNO:2)。该序列由第3号染色体编码。在切除信号序列(24个氨基酸长度)之后，激素原SST原1-92进一步加工成生物活性肽：生长抑素-28(SST-28；28个氨基酸长度；SST原65-92)或生长抑素-14(SST-14；14个氨基酸长度；SST原79-92)。片段SST-28(1-12)从SST-28推断出来(Benoit等人,1990.Metabolism39:22-25)。另外，已经鉴定到生长抑素原1-76，一种在其C-末端含有SST-28(1-12)的肽(Benoit等人,1990. Metabolism39:22-25)。
成熟生长抑素，即SST-14和SST-28，在血浆中具有非常短的约1-3分钟半寿期(Sheppard等人,1979.JClinEndocrinolMetab 48:50-53；Hildebrand等人,1994.EurJClinInvest24:50-56)。归因于其不稳定性，很难实现循环型SST-14和SST-28的可靠测量。
生长抑素的血清浓度在餐后增加(Penman等人,1981. Gastroenterology81:692-699；Polonsky等人,JClinInvest71: 1514-1518)。Ensinck等人显示SST-28在摄入混合餐食之后以及在摄入蛋白质和脂肪之后增加，但是SST-14不增加，其中假定脂肪是主要刺激(Ensinck等人,1990.Gastroenterology98:633-638；Ensinck等 人,1989.JClinInvest83:1580-1589)。相比之下，SST-14和SST-28的浓度在摄入碳水化合物之后未改变(Ensinck等人,1990. Gastroenterology98:633-638)。由混合餐食和纯葡萄糖所刺激的SST-14和SST-28释放的这种差异可以通过选择性刺激来自胃、胰的细胞和肠道D-细胞来引起，因为SST-28是肠粘膜的主要产物，而SST-14在胰中占优势(Baldissera等人,1985.BiochemBiophysActa 838:132-143)。
生长抑素通过抑制胃排空调节胃肠道运动性，抑制胆囊的收缩并且具有作为中枢神经系统内部神经递质的功能。生长抑素参与对胰岛素、胰高血糖素、胃泌素、葛瑞林(Norrelund等人,2002.Clin Endocrinol(Oxf.)57:539-546)、分泌素、胆囊收缩素和血管活性肠肽(VIP)、去甲肾上腺素、TRH(TSH释放激素)、TSH、ACTH和CRH(促皮质素释放激素)、胃酸和胃蛋白酶的抑制。
显示SST原的N端片段(生长抑素原1-64、NT-SST原)存在于大鼠中Aron等人,1984.BiochemBiophysResComm124:450-456；Aron 等人,1986.Endocrinology118:218-222和人(Aron等人,1986.JClin EndocrinolMetab62:1237-1242)甲状腺髓样癌细胞中。此外，在猪胰、小肠粘膜中和血浆中鉴定到SST原1-64(Bersani等人,1989.JBiol Chem264:10633-10636；Holst等人,1988.Pancreas3:653-661； Skak-Nielsen等人,1987.RegulPept19:183-195)。Rabbani和同事在门脉血中和在来自培养的胰岛肿瘤细胞的培养基中鉴定到作为分泌产物的大鼠SST原1-64(Rabbani和Patel1990.Endocrinology 126:2054-2061)。在生长抑素瘤患者的血浆中，SST原1-64以高浓度存在并且因此讨论了这种分子作为诊断生长抑素瘤的可能标记(Holst等人,1991.Theendocrinepancreas.NewYork:RavenPress,第 125-152页)。生长抑素瘤是产生生长抑素的胰或十二指肠恶性肿瘤。
一项在大鼠中使用充分表征的抗血清的免疫组织化学研究揭示在大鼠脑的特定区域内存在免疫反应性神经纤维和神经末梢，其中针对与SST原分子的氨基酸残基20-36相同的合成肽产生所述抗血清(Mikkelsen等人,1991.Neuroendocrinology54:469-476)。经历大小排阻层析和RP-HPLC分析的来自健康大鼠的垂体后叶提取物显示与SST原1-64大小相对应的单一SST原免疫反应性分子的存在。这些作者宣称该分子在下丘脑-垂体系统中的位置表明加工SST原的这种终产物释放入门脉循环并且也可能释放入体循环。SST原1-64的功能未知。SST原1-64的片段：SST原1-10(称作antrin)也已经在猪肠中(Benoit等人,1987.Science238:1126-1129)和SST原1-32(Schmidt等 人,1985.FEBSLett192:141-146)以及在大鼠的胃粘膜和肠粘膜提取物及血浆中(Ravazzola等人,1989.JClinInvest83:362-366)鉴定到。另外，报道存在来自人胰腺肿瘤的N端SST原1-63(Conlon等人,1987. BiochemJ248:123-127)。此外，已经显示，据认为与SST原1-63或SST原1-64等同的SST原分子N端部分的7-kDa肽片段以高浓度存在于大鼠神经系统中(Patel等人,JBiolChem263:745-751；Rabbani 和Patel1990.Endocrinology126:2054-2061)，并且在免疫组织化学上，Lechan等人(Lechan等人,1983.ProcNatlAcadSciUSA80: 2780-2784)具有展示大鼠脑中的SST原43-57免疫反应性神经元，所述神经元可能含有相同的SST原片段。另外，Odum和Johnston描述了精液中的人生长抑素原片段29-92，所述片段在其C-末端含有完整的成熟SST(Odum和Johnston1994.BiochemJ303(Pt1):263-268)。
用于确定SST原20-36免疫反应性的放射免疫测定由Bersani等人描述(Bersani等人,1989.JBiolChem264:10633-10636)。借助这种测定中使用的抗血清，从胰和肠粘膜分离SST原1-64。Aron等人合成了含有大鼠SST原的前13个氨基酸的十四肽以开发涉及生长抑素原氨基端部分的放射免疫测定(Aron等人,1984.BiochemBiophysRes Comm124:450-456)。
研究了胃肠道疾病中成熟生长抑素的血浆水平，存在矛盾结果，这最可能归因于基于如上文所述的成熟生长抑素的不稳定性的不足用检测方法。即使可能没有实际评价这些结果，但是我们简要总结文献中所述的研究结果。在传输延迟的顽固性便秘患者中，基础SST浓度未改变，其中血浆SST的餐后增加延长(Peracchi等人,1999.ScandJ Gastroenterol34:25-28)。患有炎性肠病(包括M.Crohn和溃疡性结肠炎)的患者显示肠粘膜组织中与组织学炎症评级相关的降低的SST水平(Yamamoto等人,1996.JGastroenterol31:525-532)。在来自活跃溃疡性结肠炎患者的结肠粘膜的细胞培养物中观察到SST产生的下降，其中处于缓解的患者的结肠粘膜的生长抑素产生与对照没有显著差异(Eliakim等人,1991.Gastroenterology100:A578)。然而，由于SST产生的这些变化定位于结肠粘膜，无法引出对SST循环浓度影响的结论。相反，在患有活跃期溃疡性结肠炎的患者中，与健康受试者相比，发现成熟血浆生长抑素的日周期(24小时)节律性具有更高的24小时幅度、更高的平均水平和更长时间的峰水平(Payer等人,1994. Hepatogastroenterology41:552-553)。与健康对照相比时，含有SST的内分泌粘膜细胞和粘膜下细胞的数目在患有Crohn病和溃疡性结肠炎的患者中显著减少，这也与炎症的程度相关(Watanabe等人,1992.Dis ColonRectum35:488-494)。Koch等人展示患有Crohn病和溃疡性结肠炎的患者中降结肠粘膜内的SST下降(Koch等人,1988.DisColon Rectum31:198-203)。然而，Watanabe等人和Koch等人均未研究生长抑素血浆水平。在慢性胰腺炎患者中不存在血浆SST的差异(El-Eryani等人,2000.Hepatogastroenterology47:869-874)，而在急性胰腺炎患者中存在增加的浓度(Aleryani等人,1997.VnitrLek 43:733-737)。Milutinovic及同事展示SST的血浆浓度在幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)感染的胃炎患者中降低并且成功的疗法导致这些患者中SST浓度增加(Milutinovic等人,2003.EuropeanJ GastroenterolHepatol15:755-766)。在患有胃溃疡和非典型胃病的患者中揭示出24小时生长抑素水平的显著差异，这在患有非典型病症的患者中更高(Payer等人,1995.VntrLek41:367-370)。研究了患有大肠息肉的患者中的血浆生长抑素日周期节律，显示显著差异(例如更高的24小时幅度)(Payer等人,1995.Hepatogastroenterology42:775-777)。
研究了癌症患者中的生长抑素，再次获得矛盾结果。Waisberg等人已经描述了一种显示SST表达的神经内分泌胃癌(非常良性但是罕见类型的肿瘤)(Waisberg等人,2006.WorldJGastroenterol 12:3944-3947)。此外，描述了产生SST的胰岛肿瘤(胰腺肿瘤)的病例报告，伴随血浆SST浓度增加(Karasawa等人,2001.InternMed 40:324-330；Howard等人1989.Surgery105:227-229；Patel等人1983. JClinEndocrinolMed57:1048-1053；Permert等人1997.Pancreas 15:60-68)。文献中将SST作为诊断甲状腺髓样癌的血浆标记讨论，伴以矛盾结果，显示SST增加(Roos等人,1981.JClinEndocrinolMed 52:187-194；Saito和Saito,1982.HormMetabRes14:71-76；Pacini等 人,1989.Cancer63:1189-1195)、无差异(Neradilova等人,1989. Oncology46:378-380)或轻微但不显著的下降(Grauer等人,1995. Thyroid5:287-291)。Wood和同事报道了SST在来自支气管癌患者的病例中增加，其中SST浓度在血浆中不可检测(Wood等人,1982.JClin EndocrinMetab53:1310-1312)。在小肺细胞癌患者中，SST的血浆水平略微增加(Noseda等人,1987.Thorax42:784-789)。El-Salhy等人显示产生SST的细胞的数目在结肠癌患者的结肠组织中减少(El-Salhy 等人,1998.EurJGastroenterolHepatol10:517-522)。将患有大肠癌的患者中24小时时间范围内的血浆SST水平与健康受试者和患有其他大肠疾病s(溃疡性结肠炎，大肠息肉)的患者比较，没有显示显著患者组之间在24小时SST分泌方面的差异(Payer等人,1997. Hepatogastroenterology44:72-77)。Holst等人检测到生长抑素瘤患者的血浆中高浓度的SST原1-64并且提出这种分子作为诊断生长抑素瘤的可能标记。(Holst等人,1991.Theendocrinepancreas.NewYork: RavenPress,第125-152页)。即使在这些患者中检测到高浓度的SST原1-64，成熟SST-14的浓度仅显示略微升高，这最可能归因于SST-14的极短半寿期。这些结果清楚地表明，成熟SST的可靠测量极难进行并且必须仔细评价文献中所报道的生长抑素浓度。
也描述成熟生长抑素的日周期节律(Payer等人,1997. Hepatogastroenterology44:72-77；Strazzulla等人,1990. Chronobiologia17:219-225；Payer等人,1994.Hepatogastroenterology 41:552-553)。
在患有糖尿病和胃肠道疾病的患者中报道针对生长抑素和生长抑素细胞的自身抗体(Bottazzo等人,1976.Lancet2:873-876；Jones等人, 1983.Gut24:427-432)。
WO00/22439A2公开用于诊断败血症和其他感染的生长抑素原。
发明简述
本发明的主要主题是一种用于患者中不包括生长抑素瘤的胃肠道活动和/或功能紊乱和/或营养状况紊乱的诊断、预后、监测和风险评估的方法，其包括步骤：
i)提供患者的体液样品，
ii)测定所述样品中生长抑素原1-64(SEQIDNO:6)或其片段的水平，
iii)使生长抑素原1-64(SEQIDNO:6)或其片段的水平与所述患者中不包括生长抑素瘤的胃肠道活动和/或功能紊乱和/或营养状况紊乱的诊断、预后、监测和风险评估相关，
其中所述片段具有至少6个氨基酸残基长度。
在从属权利要求中描述优选的方法变体。本发明也涉及如权利要求16中所述的抗体和如权利要求17中所述的含有至少两种抗体的试剂盒。
附图简述
现在将参考附图更详细地描述本发明，所述附图显示：
图1：多克隆抗体组合A和B的相关性
图2：多克隆抗体组合A和C的相关性
图3：多克隆抗体组合B和C的相关性
图4：采用单克隆抗体的免疫测定法的剂量-反应曲线
图5：SST原分析物的离体稳定性
图6：SST原在来自健康禁食受试者的n=201份EDTA-血浆样品中的正态分布
图7：SST原水平和身体质量指数(BMI)之间的相关性
图8：食物摄入(混合餐食)对SST原水平的影响
图9：患有胃肠道活动和/或功能紊乱和/或营养状况紊乱的患者中的SST原浓度。
发明详述
本发明的主要主题是一种用于患者中不包括生长抑素瘤的胃肠道活动和/或功能紊乱和/或营养状况紊乱的诊断、预后、监测和风险评估的方法，其包括步骤：
(i)提供患者的体液样品，
(ii)测定所述样品中生长抑素原1-64(SEQIDNO:6)或其片段的水平，
(iii)使生长抑素原1-64(SEQIDNO:6)或其片段的水平与所述患者中不包括生长抑素瘤的胃肠道活动和/或功能紊乱和/或营养状况紊乱的诊断、预后、监测和风险评估相关，
其中所述片段具有至少6个氨基酸残基长度。
如本文所用，人胃肠道(GI)指从口至肛门的全部结构。胃肠道由上胃肠道和下胃肠道组成。上胃肠道由食道、胃和十二指肠组成。下胃肠道包括大部分小肠和全部大肠。小肠由三部分：十二指肠、空肠和回肠组成，其中大肠分成盲肠、结肠和直肠。
在本发明的情境下，人胃肠道活动和/或功能紊乱和/或营养状况紊乱是胃肠道结构和/或功能病理改变或营养状况病理学变化的结果。影响胃肠道活动和/或功能的胃肠道病症和/或营养状况紊乱包括炎性、感染性、结构性和功能性胃肠道疾病。
胃肠道感染，包括最常见形式的胃肠炎，可以由病毒、由细菌(如沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)或大肠杆菌)或由肠道寄生虫(如阿米巴病和贾第虫病)引起。
胃肠炎(也称作胃肠感冒或胃感冒，虽然与流感无关)是胃肠道发炎，涉及胃和小肠并导致急性腹泻和呕吐。可以因接触于污染的食品和水而传播。这种炎症最经常因来自某些病毒的感染引起或较不常见地由细菌、其毒素(例如SEB)、寄生虫或膳食或药物中某成分的不良反应引起。至少50%归因于食源性疾病的胃肠炎病例由诺如病毒引起。另外20%的病例和儿童中的大部分严重病例归因于轮状病毒。其他有意义的病毒性病因包括腺病毒和星状病毒。不同细菌物种可以引起胃肠炎，包括沙门氏菌属、志贺氏菌(Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)、梭菌属(Clostridium)、大肠杆菌，耶尔森菌属、霍乱弧菌(Vibriocholerae)和其他。胃肠炎经常涉及胃疼痛或痉挛、腹泻和/或呕吐，伴随上小肠的非炎性感染或结肠的炎性感染。该病状通常急性发作，正常情况下持续1-6日，并且是自限性的。
胃肠道炎性疾病包括炎性肠病(IBD)，如Crohn病和溃疡性结肠炎；胰腺炎、阑尾炎和乳糜泻。
炎性肠病(IBD)是结肠和小肠的一组炎性病状。主要类型的IBD是Crohn病和溃疡性结肠炎。其他形成的IBD包括胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、Behcet病和未定型结肠炎。
Crohn病，也称作局限性肠炎，是肠的一种炎性疾病，它可以影响从口至肛门的胃肠道的任何部分，造成多种症状。它主要造成腹痛、腹泻(如果炎症处于最严重的情况下，其可以带血)、呕吐或体重减轻，但是也可以造成胃肠道以外的并发症外部，如皮肤皮疹、关节炎、眼部炎症、疲倦和注意力缺乏(Baumgart和Sandborn,2007.TheLancet 369:1641-1657)。认为Crohn病是一种自身免疫性疾病，其中身体的免疫系统攻击胃肠道，造成炎症。它一般表现在胃肠道内并且可以借助受累的具体消化道区域归类。回肠(小肠的最末部分，与大肠连接)和大肠的疾病，回结肠Crohn病占据50%的病例。
溃疡性结肠炎(Colitisulcerosa)是一种形式的炎性肠病(IBD)。溃疡性结肠炎是一种形式的结肠炎，肠、尤其大肠或结肠的疾病，其包括结肠中的特征性溃疡或开放疼痛。活动疾病的主要症状通常是逐步发作的经常腹泻，混有血液。与Crohn病具有相似性的溃疡性结肠炎是一种间歇病，伴有症状恶化时期和相对无症状的时期。虽然溃疡性结肠炎的症状有时可以本身减弱，但是该疾病通常需要治疗以达到缓解。溃疡性结肠炎患者存在增加的形成结直肠癌的风险(Kulaylat和 Dayton,2010.JSurgOncol101:706-712)。
胰腺炎是可以按两种非常不同的形式发生的胰炎症。急性胰腺炎骤起，而慢性胰腺炎以伴有或不伴有脂肪泻或糖尿病的复发或持续性腹痛为特征。胰腺炎的诊断标准是以下三个特征中的两种：1)作为急性胰腺炎之特征的腹痛、2)血清淀粉酶和/或脂肪酶≥3倍正常上限和3)急性胰腺炎在CT扫描上的特征性结果(Banks和Freeman,2006.Am JGastroenterol101:2379-2400)。
阑尾炎是以盲肠炎症为特征的病状。将它划归为医学紧急情况并且许多病例需要通过剖腹术或腹腔镜检查术摘除发炎的盲肠。未治疗时，死亡率高，主要原因是腹膜炎和休克(Hobler1998.The PermanenteJournal2:5-8)。
乳糜泻是小肠的自身免疫紊乱，它出现于具有遗传素质的从中龄幼儿起全部年龄段的人群中。症状包括慢性腹泻、发育停滞(儿童中)和乏力，但是这些症状可能不存在，并且已经描述其他器官系统中的症状。乳糜泻由针对麦醇溶蛋白(一种在小麦中存在的谷醇溶蛋白(面筋蛋白))和小麦族作物(包括其他常见谷物如大麦和黑麦)中存在的相似蛋白质的反应引起。当暴露于麦醇溶蛋白并且尤其暴露于谷醇溶蛋白中存在的三种肽时，组织酶转谷氨酰胺酶修饰该蛋白质并且免疫系统与小肠组织交叉反应，造成炎症反应。这导致小肠绒毛衬层的截短(称作绒毛萎缩)。这干扰养分吸收，因为肠绒毛负责吸收。唯一已知的有效治疗是终生无谷蛋白膳食(Sabatino和Corazza,2009.Lancet 373:1480-1493)。尽管本疾病由针对小麦蛋白的反应引起，但是它不同于小麦过敏。这种病状具有几个其他名称，包括：脂泻病、乳糜口炎性腹泻（c(o)eliacsprue）、非热带性口炎性腹泻、地方性口炎性腹泻、谷蛋白肠病或谷蛋白敏感性肠病和谷蛋白不耐受。
结构性病症是其中胃肠道部分出现结构性异常的那些，包括憩室炎、消化性溃疡以及癌症。
憩室炎是特别在大肠中存在的常见消化性疾病。憩室炎从憩室病形成，憩室病涉及在结肠外侧上形成小袋(憩室)(Bogardus2006.JClin Gastroenterol40Suppl3:S108-S111)。如果这些憩室之一变得发炎，则憩室炎产生。患者经常表现出经典三联症：左下象限疼痛、发热和白细胞增多(血液检查中白细胞计数上升)。患者也可以主诉恶心或腹泻；其他症状可以是便秘。
胃肠道癌指胃肠道的恶性病状，所述胃肠道包括食道、唾液腺、胃、肝脏、胆道系统、肠、结肠和肛门。
新生癌定义为现存肿瘤的新生长。
消化性溃疡或消化性溃疡疾病是通常呈酸性的胃肠道区域的溃疡(定义为等于或大于0.5cm的粘膜侵蚀)并且因此极端疼痛。多达70-90%的溃疡与幽门螺杆菌(一种生活在胃部酸性环境下的螺旋形细菌)相关；然而，这些病例中仅40%就医。溃疡也可以由药物如阿司匹林、Plavix(氯吡格雷)、布洛芬(ibuprofen)和其他NSAID造成或加重。与通常认识相反，更多消化性溃疡源自十二指肠(小肠的第一部分，就在胃之后)，而非胃中。约4%的胃溃疡由恶性肿瘤引起，需要多次活组织检查样品以排除癌症。十二指溃疡通常是良性的。
功能性胃肠道病症(FGID)包括影响胃肠道不同部分的许多独立的特发性病症。FGIDS由不存在基础性结构异常情况下出现的慢性腹部复合症状定义。根据Rome标准(http://www.romecriteria.org；Gastroenterology2006.第130卷(第5期):1377-1552)，FGID包括成人中的6个主要病症：功能性食管病症(例如功能性胃灼热、功能性吞咽困难)、功能性胃十二指肠障碍病症(例如功能性消化不良、嗳气病症、恶心和呕病症)、功能性肠病症(例如肠激惹综合征(IBS])、功能性腹痛综合征、功能性胆囊和奥狄括约肌病症和功能性肛门直肠病症。
肠激惹综合征(IBS或痉挛性结肠)是不存在任何可检测器质性病因下以慢性腹痛、不适、胃气胀、和排便习惯改变为特征的功能性肠病症(Mayer2008.NEJM.358:1692-1699)。在一些情况下，症状因肠运动缓解。腹泻或便秘可能占优势，或它们可以交替出现。IBS可以在感染(感染后)、应激性生活事件或成熟发作之后开始，而没有任何其他医学指标。
消化不良，也称作肚子痛或不消化，指消化受损的状况。它是医学状况以上腹部中慢性或反复疼痛在中，上腹部胀满和就餐时比预期更早感到饱满为特征。它可以伴有胃气胀、嗳气、恶心或胃灼热。消化不良是常见问题，并且经常归因于胃食管反流病(GERD)或胃炎，但是在一小部分人中可以是消化性溃疡疾病(胃或十二指肠溃疡)和偶尔地癌症的第一症状。功能性消化不良是“没有可能解释所述症状的明显器质性疾病”的消化不良证据并且据估计侵袭西方国家约15%的一般群体(Saad和Chey2006.Aliment.Pharmacol.Ther.24:475-92)。
吞咽困难是吞咽困难症状的医学术语。功能性吞咽困难定义为没有可以找到的器质性吞咽困难病因。
在本发明的一个优选实施方案中，通过检测生物样品中的生长抑素原1-64及其片段实施对患者的诊断、预后和风险评估，所述患者患有炎性肠病(包括Crohn病和溃疡性结肠炎)、憩室炎、胃肠炎、肠激惹综合征、胰腺炎、阑尾炎、消化性溃疡疾病、乳糜泻和胃肠道癌，不包括生长抑素瘤。
术语“营养状况”定义为相对于消耗和利用养分以及这些养分维持正常代谢完整性的能力而言的身体状态。
生长抑素在生理上与胃肠道的几个调节过程相关(例如通过抑制几种激素调节胃肠道运动性)。发明人展示，对其测量逊常水平SST原的疾病共有胃肠道活动和/或功能降低的共同特征，所述胃肠道活动和/或功能降低可以直接或间接地由病变引起。令人惊讶地，胃肠道的活动和/或功能和/或营养状况是与SST原的血浆水平相关的唯一或至少优势的参数，并且甚至令人惊讶的是当胃肠道的活动和/或功能和/或营养状况受损时，SST原水平是逊常的。
在本发明的一个实施方案中，除生长抑素原1-64或其片段，还测定至少一种与胃肠道相关的其他前体肽或其片段，所述的其他前体肽选自葛瑞林、胆囊收缩素、胃泌素、促胃动素、肽YY、胰腺多肽、分泌素、胰高血糖素、血管活性肠肽、肠抑胃肽(GIP)、胰淀素、神经降压肽、P物质、胃泌素释放肽(GRP)和铃蟾肽。
在本发明的一个优选实施方案中，在来自禁食患者的样品中测量生长抑素原。这里，将禁食定义为戒绝全部食品和除水之外的饮料至少8小时。
在本发明的一个特定实施方案中，额外地测定选自年龄、性别、身体质量指数(BMI)、存在糖尿病和当前吸烟习惯的至少一个临床参数。
将身体质量指数(BMI)定义为个人体重除以他或她的身高。医学中通用的这个公式产生度量单位kg/m2。WHO将小于18.5的BMI视为体重不足并且可以表示营养不良、进食障碍或其他健康问题，而大于25的BMI视为超重并且将高于30的BMI视为肥胖，高于40的数字表示此人病态性肥胖(WHO2000.TechnicalReportSeries894. Geneva:WorldHealthOrganization,2000)。
在本发明的一个优选实施方案中，测量了包含生长抑素原(SEQIDNO:2)的氨基酸1-64(SEQIDNO:6)的N端生长抑素原片段。
如本文在激素原如生长抑素原的语境中提到，术语“片段”指从较大蛋白质或肽可衍生的较小蛋白质或肽，因此它包含较大蛋白质或肽的部分序列。所述片段是从较大蛋白质或肽，通过其一个或多个肽键的皂化而可衍生的。这类片段优选地用如本文所述的免疫学测定法可检测。
测定生物样品中生长抑素原1-64及其片段的水平可以使用本领域已知的任何适合的分析技术实施。这类方法包括但不限于免疫测定法、质谱法、免疫印迹分析、免疫组织化学方法、蛋白质微阵列方法和电泳方法。
本发明还包括与代表生长抑素原(SEQIDNO:2)的氨基酸43至64的肽(SEQIDNO:5)中所包含的表位结合的抗体和用于测定生长抑素原1-64(SEQIDNO:6)或其片段的水平的试剂盒，其含有至少两种抗体，所述抗体选自与代表生长抑素原(SEQIDNO:2)的氨基酸1至21的肽(SEQIDNO:3)中所包含的表位结合的抗体；与代表生长抑素原(SEQIDNO:2)的氨基酸22至42的肽(SEQIDNO:4)中所包含的表位结合的抗体；和与代表生长抑素原(SEQIDNO:2)的氨基酸43至64的肽(SEQIDNO:5)中所包含的表位结合的抗体。该抗体和试剂盒可以在本发明的方法中使用。
在本发明的一个优选实施方案中，检测方法包括各种形式的免疫测定法，例如放射免疫测定(RIA)、化学发光免疫测定法和荧光免疫测定法、酶联免疫测定法(ELISA)、基于Luminex的珠阵列、蛋白质微阵列测定法和快速检测形式，例如免疫层析试纸条检测。
测定法可以是均相或多相测定法、竞争性和非竞争性测定法。在一个特别优选的实施方案中，测定法处于夹心测定法的形式，所述夹心测定法是非竞争性免疫测定法，其中待检测和/或定量的分子与第一抗体结合并且与第二抗体结合。第一抗体可以与固相(例如珠、板孔或其他容器的表面、芯片或试纸条)结合，并且第二抗体是(例如用染料、用放射性同位素或反应性或催化活性部分)标记的抗体。随后通过适宜的方法测量与分析物结合的标记抗体的量。涉及“夹心测定法”的一般组成和程序是充分建立的并且是技术人员已知的(TheImmunoassay Handbook,编者DavidWild,ElsevierLTD,Oxford；第3版(2005年5 月),ISBN-13:978-0080445267；HultschigC等人,CurrOpinChemBiol. 2006Feb;10(1):4-10.PMID:16376134，通过引用方式并入本文)。
在一个特别优选的实施方案中，测定法包含两种捕获分子，优选地包含均作为分散体存在于液体反应混合物中的抗体，其中第一标记组分与第一捕获分子连接，其中所述第一标记物组分是基于荧光猝灭或化学发光猝灭或扩增的标记系统的部分，并且所述标记系统的第二标记组分与第二捕获分子连接，从而一旦两种捕获分子与分析物结合，则生成可度量信号，所述可度量信号允许检测包含样品的溶液中所形成的夹心复合物。
甚至更优选地，所述标记系统包含与荧光染料或化学发光染料、尤其花青型染料组合的稀土元素穴状化合物或稀土元素螯合物。在本发明的上下文中，基于荧光的测定法包括使用染料，所述染料可以例如选自FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、IRD-700/800、菁染料，如CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7、呫吨、6-羧基-2',4',7',4,7-六氯荧光素(HEX)、TET、6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素(JOE)、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明110、BODIPY染料，如BODIPYTMR、俄勒冈绿、香豆素类，如伞形酮、苯甲酰亚胺类，如Hoechst33258；菲啶，如德克萨斯红、Yakima黄、AlexaFluor、PET、溴化乙啶、吖啶染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、卟啉染料、聚甲炔染料等。
在本发明的上下文中，基于化学发光的测定法包括基于在下述文献中对化学发光材料所述的物理原理使用染料Kirk-Othmer, Encyclopediaofchemicaltechnology,第4版,执行编辑,J.I. Kroschwitz；编辑,M.Howe-Grant,JohnWiley&Sons,1993,第15卷, 第518-562页，所述文献通过引用方式并入本文，包括第551-562页上的引文。优选的化学发光染料是吖啶酯。
甚至更优选，所述标记系统包含与荧光染料组合的稀土元素穴状化合物或稀土元素螯合物。
如本文中提到，“测定法”或“诊断测定法”可以是诊断领域中应用的任何类型测定法。这种测定法可以基于待检测的分析物以某种亲和力与一个或多个捕获探针结合。就捕获分子和靶分子或目的分子之间的相互作用而言，亲和力常数优选地大于108M-1。
在本发明的上下文中，“捕获分子”是可以用来结合来自样品的靶分子或目的分子即分析物(即在本发明的上下文中，心血管肽)的分子。捕获分子因此必须在空间上并且就表面特征，如表面电荷、疏水性、亲水性、存在或不存在路易斯供体和/或受体而言充分地成型，以特异性结合靶分子或目的分子。因此，结合可以例如由捕获分子和靶分子或目的分子之间离子性、范德瓦尔斯、π-π、σ-π、疏水性或氢键相互作用或两种或更多种前述相互作用的组合介导。在本发明的上下文中，捕获分子可以例如选自核酸分子、糖分子、PNA分子、蛋白质、抗体、肽或糖蛋白。优选地，捕获分子是抗体，包括对靶分子或目的分子具有足够亲和力的其片段并且包括重组抗体或重组抗体片段，以及所述抗体或其片段的化学和/或生物化学修饰的衍生物，所述片段源自具有至少12个氨基酸长度的变体链。
在本发明的另一个实施方案中，使用质谱方法测量生长抑素原1-64或其片段的水平。术语“质谱法”指基于质荷比(或“m/z”)过滤、检测和测量离子的方法。通常，质谱法涉及电离含有一种或多种目的分子的样品并且随后在质量分析器如四极滤质器、四极离子阱、飞行时间分析仪、FT/ICR分析仪或Orbitrap中n/z分离并检测所产生的离子(或源自其中的产物离子)，以产生代表处于不同m/z值的已检测离子的丰度的质谱。
在一个优选实施方案中，样品在质谱法之前经历一个或多个以下步骤：亲和力富集分析物、富集与载体蛋白结合的肽片段；样品还原、烷基化和/或脱盐；一维SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；胰蛋白酶蛋白酶解；或液相色谱。
在本发明的上下文中，术语“水平”涉及取自患者样品的标记肽浓度(优选地表述为重量/体积；w/v)。
如本文所用的术语“患者”指正在接受医疗护理或因疾病而应当接受医疗护理的活人或非人生物。这包括未患有限定疾病的人，其中对这些人就病变的体征研究。因此，本文所述的方法和测定法适用于人类和兽类疾病。
在本发明的上下文中，术语“诊断”涉及识别和(早期)检测受试者中的疾病或临床病状并且也包含差异性诊断、风险分级、预后、为施加预防性和/或治疗性措施和/或控制将患者分级、疗法监测、和对疾病或临床病状的疗法指导。
预后涉及预测患有具体疾病或临床病状的受试者的转归或特定风险。这种可以包括估计所述受试者恢复的几率或其不良转归的几率。
在本发明中，术语“风险分级”涉及将受试者根据他们的进一步预后分成不同的风险组。风险分级也涉及为施加预防性和/或治疗性措施分级。
如本文所用，术语“样品”指出于受试者(如患者)的诊断、预后或评价目的所获得的体液样品。优选的测试样品包括血清、血浆、脑脊液、尿、唾液、痰、和胸腔积液。此外，本领域技术人员会认识到在分级或纯化方法(例如，将全血分离成血清或血浆组分)后将更容易地分析一些试样。
因此，在本发明的一个优选实施方案中，样品选自血液样品、血清样品、血浆样品、脑脊液样品、唾液样品和尿样或前述任何样品的提取物。优选地，该样品是血液样品、更优选地是血清样品并最优选地是血浆样品。
在适宜的情况下，样品可能在本发明中使用之前需要均化或用溶剂提取以获得液体样品。液体样品因而可以是溶液或悬液。液体样品可以在本发明中使用之前经历一个或多个预处理。这类预处理包括但不限于稀释、过滤、离心、浓度、沉降、沉淀、透析。预处理也可以包括向溶液添加化学或生物化学物质，如酸、碱、缓冲剂、盐、溶剂、活性染料、去垢剂、乳化剂、螯合剂。
诊断和/或预后试验的灵敏度和特异性不只是取决于检验的分析“品质”，它们还取决于构成异常结果的定义。在实践中，接受者操作特征曲线(ROC曲线)一般通过将变量的值对其在“正常”群体(即，表观健康)和“疾病”群体(即患有糖尿病、胰岛素抵抗和/或代谢综合征的患者)中的相对频率作图进行计算。对于任何特定标记，针对患病或不患病的受试者的标记水平的分布将可能重叠。在这类条件下，检验不以100%准确度绝对地区分正常与患病，并且重叠区域表示该检验在何处不能区分正常与患病。选择阈值，其中高于所述阈值(或低于所述阈值，这取决于标记怎样随疾病变化)，则将该检验视为异常；低于所述阈值，则将该检验视为正常。ROC曲线下面积是所构思量值将导致正确鉴定某病状的概率的量度。甚至当检验结果并不必然地给出精确数字时，可以使用ROC曲线。只要可以将结果排序，就可以产生ROC曲线。例如，可以根据程度将对“患病”样品检验的结果排序(例如1=低，2=正常，和3=高)。这种排序可以与“正常”群体中的结果相关，并且产生ROC曲线。这些方法是本领域熟知的(见例如，Hanley等人,1982. Radiology143:29-36)。优选地，选择阈值以提供大于约0.5、更优选地大于约0.7、仍更优选地大于约0.8、甚至更优选地大于约0.85并且最优选地大于约0.9的ROC曲线面积。术语“约”在这种语境下指给定量值的+/-5%。
ROC曲线的水平轴代表(1-特异性)，其随假阳性率而增加。该曲线的垂直轴代表灵敏度，其随真阳性率而增加。因此，对于选择的特定截值，可以测定(1-特异性)的值，并且可以获得相应的灵敏度。ROC曲线下面积是所测量的标记水平将导致正确鉴定某疾病或病状的概率的量度。因此，ROC曲线下面积可以用来确定检验的有效性。
在某些实施方案中，选择标记和/或标记组以显示至少约70%灵敏度、更优选地至少约80%灵敏度、甚至更优选地至少约85%灵敏度、仍更优选地至少约90%灵敏度并且最优选地至少约95%灵敏度，前者与至少约70%特异性、更优选地至少约80%特异性、甚至更优选地至少约85%特异性、仍更优选地至少约90%特异性并且最优选地至少约95%特异性组合。在特别优选的实施方式中，灵敏度和特异性均是至少约75%、更优选地至少约80%、甚至更优选地至少约85%、仍更优选地至少约90%并且最优选地至少约95%。术语“约”在这种语境下指给定量值的+/-5%。
根据该方法，当所测定的生长抑素原水平低于预定阈值水平时，诊断该患者具有增加的胃肠道活动和/或功能紊乱和/或营养状况紊乱的概率。优选地，预定阈值水平是低于400pmol/L、更优选地在300pmol/L和180pmol/L之间、甚至更优选在250pmol/L和180pmol/L之间、最优选地在200pmol/L和180pmol/L之间。在一个优选实施方案中，当所测定的生长抑素原水平是低于400pmol/L、优选地低于300pmol/L、更优选地低于250pmol/L、甚至更优选地低于200pmol/L、最优选地低于180pmol/L时，诊断该患者患有胃肠道活动和/或功能紊乱。
上文提到的值可能在检测生长抑素原1-64或其片段的其他测定法中是不同的，如果这些测定法已经按不同方式校准。考虑到校准中的差异，上文提到的值应当因此适用于这类按不同方式校准的SST原1-64测定法。一种对校准中差异量的可能性是所讨论的SST原1-64测定法与通过使用两种方法测量样品中SST原1-64或其片段的在本发明中使用的SST原1-64测定法的方法比较分析(相关性)。另一个可能性是鉴于这个检验法具有足够的分析性灵敏度，采用所讨论的SST原1-64测定法确定；将代表性正常群体的中位数SST原1-64水平与如本文所述的中位数SST原1-64水平比较；并且基于借助这种比较所获得的差异，重新计算校准。
优选地，生长抑素原1-64或其片段的预定阈值水平是低于健康禁食受试者的中位数的112%、更优选地在84%和50%之间、甚至更优选在70%和50%之间、最优选地在56%和50%之间。在一个优选实施方案中，当所测定的生长抑素原1-64或其片段的水平是低于健康禁食受试者的中位数的112%、优选地低于84%、更优选地低于70%、甚至更优选地低于56%、最优选地低于50%时，诊断该患者患有胃肠道活动和/或功能紊乱。
优选地，生长抑素原1-64或其片段的预定阈值水平是低于健康禁食受试者的第63.5百分位数、更优选地在健康禁食受试者的第30和第0.25百分位数之间、甚至更优选地在第12.5和第0.25第百分位数之间、最优选地第2和第0.25百分位数。在一个优选实施方案中，当生长抑素原1-64或其片段的水平是低于健康禁食受试者的第63.5百分位数、优选地低于第30百分位数、更优选地低于第12.5百分位数、甚至更优选地低于第2百分位数、最优选地低于第0.25百分位数时，诊断该患者患有胃肠道活动和/或功能紊乱。
实施例
1.肽
以下4种与SST原1-64相关的肽由JPTPeptideTechnologiesGmbH化学合成、纯化(HPLC；>90%纯度)并质量控制(采用C18柱的HPLC和在220nm测量的吸光度)：在C末端具有一个额外半胱氨酸残基的SST原1-21(PAK22；SEQIDNO:3)、在N末端具有一个额外半胱氨酸残基的SST原22-42(PQD22；SEQIDNO:4)、在N末端具有一个额外半胱氨酸残基的SST原43-64(PAR23；SEQIDNO:5)和SST原1-64(PAR64；SEQIDNO:6)。
2.多克隆抗体
根据标准程序生成针对肽PAK22、PQD22和PAR23的多克隆抗体。使用MBS(间-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟琥珀酰亚胺酯)，使肽与载体蛋白KLH(匙孔槭血蓝蛋白)(PIERCE,Rockford,IL,USA)连接。根据以下方案，用肽缀合物免疫羊：羊起初用100μg缀合物(质量指缀合物的肽部分)免疫并且此后以4周间隔每次用50μg缀合物强化免疫。初始免疫之后4月，从每只羊获得300ml抗血清。将肽与来自Pierce(Boston、USA)的Sulfolink偶联凝胶根据供应商的说明书共价连接，并且通过亲和纯化从羊抗血清纯化出相应的多克隆抗体。将50ml相应的羊抗血清(抗PAK22抗血清CF0784、抗PQD22抗血清CF0788和抗PAR23抗血清CF0789)在室温与凝胶逐批次孵育4小时。将材料转移于柱中(空NAP25柱，Pharmacia)。弃去通流，将凝胶用100ml洗涤缓冲液(100mM磷酸钾，0.1%Tween20，pH6.8)洗涤、并且用50mM柠檬酸，pH2.7洗脱特异性结合的抗体。将洗脱物针对50mM磷酸钠，100mMNaCl，pH8.0透析。
3.单克隆抗体
通过标准程序生成针对肽PAK22、PQD22和PAR23的单克隆抗体(HarlowE,LaneD.Antibodies-ALaboratoryManual.ColdSpring Harbor:ColdSpringHarborLaboratory,1988；Lane1985.JImmunol Methods81:223-228.)。简而言之，通过使用Sulfo-MBS(间-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟琥珀酰亚胺酯)，使肽与BSA缀合。采用这些缀合物，免疫并强化免疫Balb/c小鼠，并且使脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞系。对细胞系筛选它们分泌将与免疫原性肽结合的抗体的能力，其中所述免疫原性肽包被在固态聚苯乙烯相上。采用这种方案，产生了分泌单克隆抗体313/1F11(针对PAK22)、314/1A11(针对PQD22)和315/1A9(针对PAR23)的细胞系。对于其他实验，通过蛋白G亲和层析法从培养上清液纯化单克隆抗体。
4.抗体的包被和标记
将聚苯乙烯起始管(Greiner)在22℃用纯化的抗体包被过夜(每管在300μL50mmol/LTris、100mmol/LNaCl、pH7.8中的2μg抗体)。将管用含有3%KarionFP(MERCK)、0.5%无蛋白酶的BSA(Sigma)的10mmol/L磷酸钠(pH6.5)封闭并且冻干。
将纯化抗体的浓度调节至1g/l，并且将抗体通过在室温以1:5摩尔比与化学发光标记物MACN-吖啶-NHS-酯(1g/l；InVentGmbH，Hennigsdorf，德国)孵育20分钟进行标记。通过添加1/10体积的1mol/LTris持续10分钟终止反应。通过在NAP-5柱(GEHealthcare，Freiburg，德国)和SEC-400-5HPLC柱(BIO-RAD)上的大小排阻层析，将标记的抗体与游离的标记物分离。
5.采用多克隆或单克隆抗体的免疫测定法
通过在每200μl含有106个相对发光单位(RLU)的MACN标记抗体的分析缓冲液(300mmol/L磷酸钾，100mmol/LNaCl，10mmol/LEDTA钠，5g/l无蛋白酶的牛血清白蛋白(Sigma)，1g/l非特异性羊IgG，1g/l非特异性牛IgG，1g/l非特异性小鼠IgG，0.9g/l叠氮钠，pH7.0)中稀释相应的标记抗体，产生示踪剂。
PAR64在空白血清(T3/T4游离血清，无剥离的脂质，来自Scantibodies)中浓度分别为2560、640、160、40、10pmol/L的肽稀释物充当校准物。通过在室温(18-27℃)搅拌下孵育50μL校准物或患者样品和200μL示踪剂2小时，进行免疫测定法。将管用1mL洗涤液(B.R.A.H.M.SGmbH)洗涤4次，并且用LB952T光度计(Berthold)测量结合的化学发光，每管1秒。
结果
1.采用多克隆抗体的免疫测定法的相关性
以三种免疫测定法变体(固相抗体抗-PQD22+标记的抗-PAR23抗体[组合A]、固相抗体抗-PQD22+标记的抗-PAK22抗体[组合B]和固相抗体抗-PAK22+标记的抗-PAR23抗体[组合C])测量来自患者(包括健康个体和患有Crohn病、胰腺炎和不同癌的患者)的30份EDTA血浆样品。采用全部三种抗体组合均可检测到生长抑素原免疫反应性。分别分析两两组合之间的相关性。组合A和B之间、组合A和C之间、和组合B和C之间的相关性分别是r=0.94(图1)、r=0.91(图2)和r=0.94(图3)。
2.采用单克隆抗体的免疫测定法的技术表征
分别采用PAR64标准肽高浓度(5600pmol/L)和具有低和高SST原浓度的来自患者的两份EDTA血浆汇集物测试使用不同抗体组合的6种夹心免疫测定法。将具有最高测量值的组合(抗-PAK22313/1F11作为固相并且抗-PQD22314/1A11作为标记抗体)用于全部其他实验。
检测下限(LoD)，如采用未剥离脂质的无T3/T4血清(10个确定值的平均相对发光单位外加2SD)所测定，是4pmol/L。对于>8300pmol/L的PAR64浓度，观察到大剂量钩形效应。
通过测量30份人EDTA-血浆样品确定测定法的总精度。由5位不同操作员使用一个批次和两台光度计，根据临床和实验室标准机构CLSI(先前的NCCLS)推荐的操作方案EP-5A2，对10个测定轮次生成这些数据。对于SST原浓度>25pmol/L的测量样品，CV<20%。通过稀释实验评估准确度。在5份EDTA-血浆样品中测试含有无效血清的线性稀释物(至多到1:16，其中通过混合等体积的样品和稀释剂制备1:2稀释物，并且通过混入一部分先前稀释的等体积稀释物制备1:4、1:8和1:16稀释物)。测量的浓度乘以稀释倍数并且与未稀释样品的值比较。5份样品在稀释期间均不显示偏离原始值超过20%。
图4中显示使用合成肽PAR64作为校准物时的常见剂量反应曲线。
3.分析物的离体稳定性
我们评价了天然分析物在22℃和37℃在10位不同个体的EDTA-血浆的稳定性。在22℃，分析物稳定(免疫反应性丧失<10%)72小时并且在37℃稳定24小时(见图5)。(在血清中的稳定性低得多；这里未显示数据)。在5份EDTA-血浆样品中，冷冻和融化4次对SST原的测量浓度没有影响(均值99.1%[范围，93.8%-104.3%]的原始值)。
4.临床数据
测量来自健康禁食受试者的201份EDTA-血浆样品中的SST原，中位数浓度为357pmol/L(范围191-637pmol/L)(图6)。分别地，第2.5百分位数是205pmol/L，第25百分位数是288pmol/L，第75百分位数是445pmol/L并且第97.5百分位数是609pmol/L。
在禁食受试者中，观察到SST原水平与身体质量指数(BMI)的关联(Spearman秩相关性r=0.23[P<0.05])(图7)。
在另一个实验中，6位健康受试者在过夜禁食时间(至少8小时)之后摄入混合餐食。连续获得EDTA-血浆样品并且测量SST原。SST原的浓度在摄入食物之后显著地增加(KruskalWallis检验P<0.0001)(图8)。
测量来自患有不同胃肠道疾病(例如炎性肠病如Crohn病；胰腺炎；憩室炎；和不同胃肠道癌类型)的禁食患者的样品，并且与健康禁食对照相比，SST原浓度显著地降低(KruskalWallis检验P<0.0001)(图9)。接收者操作特征分别对Crohn病患者产生1.0的曲线下面积(AUC)(95%CI1.0-1.0)，对胰腺炎患者产生0.82的曲线下面积(95%CI0.69-0.95)，对憩室炎患者产生0.94的曲线下面积(95%CI0.86-1.02)，对胰腺癌患者产生0.93的曲线下面积(95%CI0.87-0.99)，对胰腺新生癌患者产生0.95的曲线下面积(95%CI0.87-1.02)，对食管癌患者产生0.86的曲线下面积(95%CI0.77-0.96)，对胃癌患者产生0.66的曲线下面积(95%CI0.52-0.80)，对结肠癌患者产生0.92的曲线下面积(95%CI0.88-0.96)，并且对新生结肠癌患者产生0.93的曲线下面积(95%CI0.87-0.99)。汇总了不同患者组的示例性临界值连同所得到的特异性和灵敏度(表1)。
对其检测到逊常水平SST原的疾病共有共同特征，即降低的胃肠道活动/功能，这直接或间接地由病变引起。由于现有技术中生长抑素的生理作用已经与几种调节过程相关，所以令人惊讶的是，胃肠道的活动/功能明显是与SST原的血浆水平相关的唯一或至少优势的参数，并且甚至令人惊讶的是，当胃肠道的活动/或功能受损时，SST原水平是逊常的。
如已经报道，在患有糖尿病和胃肠道疾病的患者中可能存在针对生长抑素和生长抑素细胞的自身抗体(Bottazzo等人,1976.Lancet 2:873-876；Jones等人,1983.Gut24:427-432)，我们解决了下述问题：针对SST原的自身抗体是否可能存在并且可能影响在上文所述的实施例中获得的量值。当分析来自患有胃肠道疾病、其他疾病的患者和健康个体的样品时，通过本领域技术人员已知的稀释和回收实验所评估的SST原测量的准确度是理想的。因此，可以排除上文所述实施例中显示的SST原测量受损或是不精确的，并且显然不存在干扰所进行的SST原测量的抗SST原自身抗体。
序列
表1：患有不同GI-道疾病的患者组的示例性截断值(伴有相应的特异性和灵敏度值)

Claims (39)

1.用于测定SEQIDNO:6所示的生长抑素原1-64或其片段的水平的试剂在制备用于在患者中不包括生长抑素瘤的胃肠道活动和/或功能紊乱和/或营养状况紊乱的诊断、预后、监测和风险评估的方法中使用的试剂的用途，其中所述方法包括步骤：
i)提供患者的体液样品，
ii)测定所述样品中SEQIDNO:6所示的生长抑素原1-64或其片段的水平，
iii)使SEQIDNO:6所示的生长抑素原1-64或其片段的水平与所述患者中不包括生长抑素瘤的胃肠道活动和/或功能紊乱和/或营养状况紊乱的诊断、预后和风险评估相关联，
其中所述片段具有至少6个氨基酸残基的长度。
2.根据权利要求1所述的用途，其中体液样品取自至少8小时禁食期之后的所述患者。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述患者正患有胃肠道疾病，所述胃肠道疾病特征在于胃肠道活动和/或功能紊乱和/或营养状况紊乱，所述胃肠道疾病选自包括炎性胃肠道疾病、感染性胃肠道疾病、结构性胃肠道疾病和功能性胃肠道疾病的组。
4.根据权利要求2所述的用途，其中所述患者正患有胃肠道疾病，所述胃肠道疾病特征在于胃肠道活动和/或功能紊乱和/或营养状况紊乱，所述胃肠道疾病选自包括炎性胃肠道疾病、感染性胃肠道疾病、结构性胃肠道疾病和功能性胃肠道疾病的组。
5.根据权利要求3所述的用途，其中所述感染性胃肠道疾病由病毒、由细菌或由肠道寄生虫引起。
6.根据权利要求4所述的用途，其中所述感染性胃肠道疾病由病毒、由细菌或由肠道寄生虫引起。
7.根据权利要求3所述的用途，其中所述炎性胃肠道疾病选自包括炎性肠病、胰腺炎、阑尾炎和乳糜泻的组，所述炎性肠病包括Crohn病和溃疡性结肠炎。
8.根据权利要求4所述的用途，其中所述炎性胃肠道疾病选自包括炎性肠病、胰腺炎、阑尾炎和乳糜泻的组，所述炎性肠病包括Crohn病和溃疡性结肠炎。
9.根据权利要求3所述的用途，其中所述结构性胃肠道疾病选自包括癌症、憩室炎和消化性溃疡疾病的组。
10.根据权利要求4所述的用途，其中所述结构性胃肠道疾病选自包括癌症、憩室炎和消化性溃疡疾病的组。
11.根据权利要求9所述的用途，其中所述癌症选自食道、唾液腺、胃、肝脏、胆道系统、肠、结肠和肛门的癌症。
12.根据权利要求10所述的用途，其中所述癌症选自食道、唾液腺、胃、肝脏、胆道系统、肠、结肠和肛门的癌症。
13.根据权利要求3所述的用途，其中所述功能性胃肠道疾病选自包括功能性食管病症、功能性胃十二指肠病症、功能性肠病症、功能性腹痛综合征、功能性胆囊和奥狄括约肌病症以及功能性肛门直肠病症的组。
14.根据权利要求4所述的用途，其中所述功能性胃肠道疾病选自包括功能性食管病症、功能性胃十二指肠病症、功能性肠病症、功能性腹痛综合征、功能性胆囊和奥狄括约肌病症以及功能性肛门直肠病症的组。
15.根据权利要求13所述的用途，其中所述功能性食管病症包括功能性胃灼热和功能性吞咽困难。
16.根据权利要求14所述的用途，其中所述功能性食管病症包括功能性胃灼热和功能性吞咽困难。
17.根据权利要求13所述的用途，其中所述功能性胃十二指肠病症包括功能性消化不良、嗳气病症、恶心和呕病症。
18.根据权利要求14所述的用途，其中所述功能性胃十二指肠病症包括功能性消化不良、嗳气病症、恶心和呕病症。
19.根据权利要求13所述的用途，其中所述功能性肠病症包括肠激惹综合征。
20.根据权利要求14所述的用途，其中所述功能性肠病症包括肠激惹综合征。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的用途，其中所述体液样品选自血液、血清、血浆、脑脊液、尿或唾液。
22.根据权利要求1至20中任一项所述的用途，其中测定与胃肠道相关的至少一种其他标记肽或其前体或片段。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述其他标记肽选自包括葛瑞林、胆囊收缩素、胃泌素、促胃动素、肽YY、胰腺多肽、分泌素、胰高血糖素、血管活性肠肽、肠抑胃肽(GIP)、胰淀素、神经降压肽、P物质、胃泌素释放肽(GRP)和铃蟾肽的组。
24.根据权利要求1至20中任一项所述的用途，其中额外地测定选自包括年龄、性别、身体质量指数(BMI)、存在糖尿病和当前吸烟习惯的组中的至少一个临床参数。
25.根据权利要求1至20中任一项所述的用途，其中诊断并预测患有胃肠道活动和/或功能紊乱和/或营养状况紊乱的一位患者和/或多位患者中的胃肠道活动和/或功能紊乱和/或营养状况紊乱，当所述SEQIDNO:6所示的生长抑素原1-64或其片段的测定水平低于预定的阈值水平时，将患者分层至增加的风险。
26.根据权利要求25所述的用途，其中SEQIDNO:6所示的生长抑素原1-64或其片段的预定阈值水平是低于400pmol/L。
27.根据权利要求26所述的用途，其中SEQIDNO:6所示的生长抑素原1-64或其片段的预定阈值水平是在400和180pmol/L之间。
28.根据权利要求27所述的用途，其中SEQIDNO:6所示的生长抑素原1-64或其片段的预定阈值水平是在300和180pmol/L之间。
29.根据权利要求28所述的用途，其中SEQIDNO:6所示的生长抑素原1-64或其片段的预定阈值水平是在250pmol/L和180pmol/L之间。
30.根据权利要求29所述的用途，其中SEQIDNO:6所示的生长抑素原1-64或其片段的预定阈值水平是在200pmol/L和180pmol/L之间。
31.根据权利要求25所述的用途，其中SEQIDNO:6所示的生长抑素原1-64或其片段的预定阈值水平是低于健康禁食受试者的中位数的112％。
32.根据权利要求31所述的用途，其中SEQIDNO:6所示的生长抑素原1-64或其片段的预定阈值水平是在健康禁食受试者的中位数的84％和50％之间。
33.根据权利要求32所述的用途，其中SEQIDNO:6所示的生长抑素原1-64或其片段的预定阈值水平是在健康禁食受试者的中位数的70％和50％之间。
34.根据权利要求33所述的用途，其中SEQIDNO:6所示的生长抑素原1-64或其片段的预定阈值水平是在健康禁食受试者的中位数的56％和50％之间。
35.根据权利要求25所述的用途，其中SEQIDNO:6所示的生长抑素原1-64或其片段的预定阈值水平是低于健康禁食受试者的第63.5百分位数。
36.根据权利要求35所述的用途，其中SEQIDNO:6所示的生长抑素原1-64或其片段的预定阈值水平是在健康禁食受试者的第30和第0.25百分位数之间。
37.根据权利要求36所述的用途，其中SEQIDNO:6所示的生长抑素原1-64或其片段的预定阈值水平是在健康禁食受试者的第12.5和第0.25百分位数之间。
38.根据权利要求37所述的用途，其中SEQIDNO:6所示的生长抑素原1-64或其片段的预定阈值水平是在健康禁食受试者的第2和第0.25百分位数之间。
39.根据权利要求1至20中任一项所述的用途，其中测定SEQIDNO:6所示的生长抑素原1-64及其片段的水平。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2897245A1 (en) * 2013-01-08 2014-07-17 Sphingotec Gmbh A method for predicting the risk of getting cancer or diagnosing cancer in a subject
RU2525210C1 (ru) * 2013-05-06 2014-08-10 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ диагностики недостаточности сфинктера одди
WO2015042465A1 (en) * 2013-09-20 2015-03-26 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of appendicitis and differentiation of causes of abdominal pain
WO2017156313A1 (en) * 2016-03-09 2017-09-14 Biomerica, Inc. Compositions, devices, and methods of functional dyspepsia sensitivity testing

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3015058B2 (ja) * 1989-03-03 2000-02-28 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 表面レセプター活性のクラスｉｍｈｃ調節
DE19847690A1 (de) 1998-10-15 2000-04-20 Brahms Diagnostica Gmbh Verfahren und Substanzen für die Diagnose und Therapie von Sepsis und sepsisähnlichen systemischen Infektionen
US20080085524A1 (en) * 2006-08-15 2008-04-10 Prometheus Laboratories Inc. Methods for diagnosing irritable bowel syndrome
ES2652027T3 (es) * 2006-10-26 2018-01-31 B.R.A.H.M.S. Gmbh Estratificación de riesgo del síndrome coronario agudo por medio de fragmentos / péptidos parciales de la provasopresina, en particular copeptina o neurofisina II
DE102006052916A1 (de) * 2006-11-08 2008-05-15 Brahms Aktiengesellschaft Diagnose und Risikostratifizierung von Diabetes mellitus mittels MR-proADM
DE102006058266A1 (de) * 2006-12-08 2008-06-12 Brahms Aktiengesellschaft Diagnose und Risikostratifizierung von Herzinsuffizienz mittels Neurophysin
WO2009023125A1 (en) * 2007-08-14 2009-02-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Neuronostatin and its uses

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Prosomatostatin-specific antigen in rat brain: Localization by immunocytochemical staining with an antiserum to a synthetic sequence of preprosomatostatin;RONALD M. et al;《PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OFSCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA 》;19830531;第80卷(第9期);第2780-2784页 *

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