CN102395887B - 用于检测降钙素原的免疫测定法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在源自于从对象获得的体液的生物样品中检测降钙素原或其长度为至少20个氨基酸残基的片段的体外方法，所述方法包含下列步骤：(i)将所述样品与针对降钙素原不同表位的至少两种抗体或其功能片段相接触，以及(ii)定性或定量检测所述至少两种抗体与降钙素原或其所述片段的结合，其中结合指示了所述样品中降钙素原或所述片段的存在或浓度，其中至少一种抗体或其功能片段针对包含在跨越降钙素原的第2至52位氨基酸残基的序列中的表位。本发明还涉及针对降钙素原的N-末端表位的抗体以及包含针对PCT的抗体的试剂盒。

Description

用于检测降钙素原的免疫测定法
发明领域
本发明属于临床诊断学领域。具体来说，本发明涉及在源自于对象体液的样品中测定降钙素原(PCT)水平。
发明背景
降钙素原(PCT)已知作为反映出局部和系统性细菌感染、即脓毒症的存在和严重性的生物标志物(Assicot等，Lancet 1993；341：515-8；Muller等，Crit Care Med 2000；28：977-83；Harbarth等，Am J Respir CritCare Med 2001；164：396-402；Becker等，Crit Care Med 2008；36：941-52；Becker等，J Clin Endocrinol Metab 2004；89：1512-25；Nobre等，Am JRespir Crit Care Med 2008；177：498-505；Christ-Crain等，Lancet2004；363：600-7；Stolz等，Chest 2007；131：9-19；Christ-Crain等，Am JRespir Crit Care Med 2006；174：84-93；Briel等，Arch Intern Med2008；168：2000-7；讨论7-8)。
抗原特异性抗体是开发免疫测定法的关键工具。已经描述了几种针对PCT来源的肽的抗体，它们已用于在免疫测定法中检测PCT，但是仅对很少几种测试了它们在夹心免疫测定法中检测天然PCT的用途(表1)。已经开发了利用针对PCT的降钙素和钙抑肽部分的抗体的夹心免疫测定法，用于常规测量人类样品中的PCT。
对于与PCT浓度升高相关的病症(不包括甲状腺髓样癌)、特别是细菌感染和脓毒症来说，据信不仅全长的PCT(约13kDa)、而且PCT来源的片段也存在于患者的血液循环中。具体来说，已经讨论过就在PCT的降钙素部分的紧上游发生的蛋白水解切割(Muller等，Crit CareMed 2000；28：977-83；Whang等，J Clin Endocrinol Metab1998；83：3296-301)，其将产生两个片段(均为约6-7kDa)。然而，关于此的实验证据很少：已经使用针对PCT的降钙素部分的抗体通过亲和层析从脓毒症患者分离到循环中的PCT，并且已经得出结论，即PCT3-116是主要的循环PCT物质(Weglohner等，Peptides2001；22：2099-103.)。然而，在该分析中进行了几个选择步骤，即只纯化了具有含降钙素表位的肽，并且不是所有来自随后的反相HPLC的相关级分都进行了分析。用于PCT的免疫测定法还不适合于解决PCT片段化问题，因为或是使用了包含单一抗体的竞争性测定法(Whang，等，J Clin Endocrinol Metab 1998；83：3296-301)，或是使用了包含了两种抗体的夹心免疫测定法，但所述两种抗体的表位彼此接近位于PCT的C-端部分上而没有覆盖PCT的大范围部分(Morgenthaler等，Clin Chem2002；48：788-90)。
在夹心测定法中，已经将抗PCT的最N-末端的抗体与抗PCT的钙抑肽部分的抗体联合使用，在脓毒症患者样品中检测具有完整N-末端的PCT物质类型(DE 10 2007 009 751)。发现N-末端完整的PCT物质与利用抗PCT的降钙素和钙抑肽部分的抗体的夹心免疫测定法所检测到的PCT免疫反应性相比，具有不同的体内动力学。此外，发现这些N-末端完整的PCT物质，占利用抗PCT的降钙素和钙抑肽部分的抗体的夹心免疫测定法所检测到的PCT免疫反应性的约10-20％。然而，还不清楚在PCT的最N-末端与降钙素部分之间的哪些位点进行蛋白水解切割，能够产生观察到的不同被分析物浓度。尽管可以推测PCT1-116由DPPIV的作用在N-末端切开产生PCT3-116(Weglohner等，Peptides2001；22：2099-103；Wrenger等，FEBS Lett 2000；466：155-9)，但不清楚PCT1-116是否可以另外或可选地在分子中间的另一个位点处被切开。
因此，还不清楚具有大致位于PCT的降钙素部分上游(精确来说在53位的上游)、不包含PCT的最N-末端(即PCT1-116的第1位)的表位的抗体，与具有另一个表位、例如第53位下游的表位(例如PCT的降钙素或钙抑肽部分中的表位)的抗体联合，是否可用于夹心免疫测定法中，以与使用具有PCT的降钙素部分中的表位的抗体和具有其下游的表位的抗体、例如具有PCX的钙抑肽部分中的表位的抗体的夹心免疫测定法相当的方式，检测患者样品中的天然PCT。最近已经描述了使用重组PCT作为被分析物的这种夹心免疫测定法，但是从患者样品回收天然PCT还没有被评估，并且我们推测的PCT片段化的可能问题从未被讨论(Kramer等，Anal Bioanal Chem 2008；392：727-36)。
本发明部分是基于本发明人的令人吃惊的发现，即针对包含在降钙素原的2-52氨基酸位置中的表位的抗体，适合用于通过夹心免疫测定法测量PCT，因为PCT不在分子中间切开。
发明描述
基于针对PCT的抗体的新的组合，本发明提供了改进的测定方法，用于测定体液样品中的PCT水平。
因此，本发明涉及用于在源自于从对象获得的体液的生物样品中检测降钙素原或其长度为至少20个氨基酸残基的片段的体外方法，所述方法包含下列步骤：
a.将所述样品与针对降钙素原不同表位的至少两种抗体或其功能片段相接触，
b.定性或定量检测所述至少两种抗体与降钙素原或其所述片段的结合，其中结合指示了所述样品中降钙素原或所述片段的存在或浓度，
其中至少一种抗体或其功能片段针对包含在跨越降钙素原的第2至52位氨基酸残基的序列中的表位。
在本发明的文本中，针对包含在跨越降钙素原的第2至52位氨基酸残基的序列中的表位的抗体或其功能片段，是多克隆或单克隆抗体。
优选情况下，在本发明的文本中，针对包含在跨越降钙素原的第2至52位氨基酸残基的序列中的表位的抗体或其功能片段是单克隆抗体。
优选情况下，另一个抗体或其功能片段针对包含在跨越降钙素原的第53至116位氨基酸残基的序列中的表位。
在本发明的方法中使用的至少两种抗体，优选对相应的另一个或另一些抗体的表位不表现出显著(即＞10％)的交叉反应性。针对跨越降钙素原的第2至52位氨基酸残基的序列中的表位的抗体，对于该表位是特异性的，并因此对跨越降钙素原的第53至116位氨基酸残基的序列中的表位不表现出显著的交叉反应性，反之亦然。因此，本发明的抗体对它们在PCT中的表位是特异性的，并且对该肽中的其他表位、特别是不交叠表位不表现出显著的交叉反应性。
在本文中，优选情况下，包含在跨越降钙素原的第2至52位氨基酸残基的序列中的表位，是包含在跨越降钙素原的第16至40位氨基酸残基的序列中的表位。更优选情况下，包含在跨越降钙素原的第16至40位氨基酸残基的序列中的表位选自包含在跨越降钙素原的第21至40位氨基酸残基的序列中的表位、包含在跨越降钙素原的第16至35位氨基酸残基的序列中的表位和包含在跨越降钙素原的第25至37位氨基酸残基的序列中的表位。
包含在跨越降钙素原的第53至116位氨基酸残基的序列中的表位，优选是包含在跨越降钙素原的第96至116位氨基酸残基的序列中的表位或包含在跨越降钙素原的第60至91位氨基酸残基的序列中的表位。
在本发明的方法的具体实施方案中，对样品中降钙素原或其片段的浓度进行定量。
优选情况下，本发明的对象是人类或非人类动物，优选为哺乳动物，最优选情况下对象是人类。
在本发明的上下文中，针对包含在跨越降钙素原的第53至116位氨基酸残基的序列中的表位的抗体或其功能片段，是多克隆或单克隆抗体。优选情况下，针对包含在跨越降钙素原的第53至116位氨基酸残基的序列中的表位的抗体或其功能片段是单克隆抗体。
针对包含在跨越降钙素原的第2至52位氨基酸残基的序列中的表位的抗体或其功能片段，优选为IgG或源自于IgG。同样地，针对包含在跨越降钙素原的第53至116位氨基酸残基的序列中的表位的抗体或其功能片段，优选为IgG或源自于IgG。
在本发明的方法的上下文中，体液优选自血液、血清、血浆、脑脊液、尿液、唾液、痰液和胸膜腔积液。
在本发明的方法的优选实施方案中，至少两种抗体或其功能片段中的至少一种被固定化在固相表面上。更优选情况下，至少两种抗体或其功能片段中的一种被固定化在固相表面上。优选情况下，另一种或另一些抗体中的至少一种被标记，优选通过共价连接化学发光或荧光染料进行标记。
在方法的具体实施方案中，针对包含在跨越降钙素原的第2至52位氨基酸残基的序列中的表位的抗体或其功能片段被固定化在固相表面上。在另一个具体实施方案中，针对包含在跨越降钙素原的第53至116位氨基酸残基的序列中的表位的抗体或其功能片段被固定化在固相表面上。
本发明还涉及针对包含在跨越降钙素原的第16至40位氨基酸残基的序列中的表位的抗体或其功能片段。
优选情况下，抗体或其功能片段所针对的表位选自包含在跨越降钙素原的第21至40位氨基酸残基的序列中的表位、包含在跨越降钙素原的第16至35位氨基酸残基的序列中的表位和包含在跨越降钙素原的第25至37位氨基酸残基的序列中的表位。优选情况下，抗体是单克隆抗体。
优选情况下，本发明的抗体可以通过遗传免疫接种来生产。简单来说，可以例如基本上按照Costagliola等，J Immunol 1998；160：1458-65中提出的步骤，通过遗传免疫接种来生产针对PCT的单克隆抗体。可以通过标准程序将PCT编码序列克隆到载体中。然后可以用所述载体注射动物例如小鼠。可以在例如3和6周后重复注射。在例如18周后处死动物。然后将被处死动物的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞系，然后筛选所述杂交瘤细胞分泌与固定化重组人类PCT结合的抗体的能力。
本发明的针对包含在跨越降钙素原的第16至40位氨基酸残基的序列中的表位的单克隆抗体，优选情况下可以由保藏在DSMZ的登记号为DSM ACC2993、DSM ACC2996或DSM ACC2997的杂交瘤细胞系来生产。这些细胞系产生本发明的针对包含在跨越降钙素原的第16至40位氨基酸残基的序列中的表位的特定单克隆抗体。生产单克隆抗体FX7A7的杂交瘤细胞系已经于2009年6月4日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)，登记号为DSM ACC2997。生产单克隆抗体FW5H6的杂交瘤细胞系已经于2009年6月4日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)，登记号为DSM ACC2996。生产单克隆抗体FX1G5的杂交瘤细胞系已经于2009年4月29日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)，登记号为DSMACC2993。所有杂交瘤细胞系按照上文所述的原理产生，并在实施例1中更详细地描述。
另一方面，本发明涉及试剂盒，所述试剂盒至少包含：
a.第一种抗体或其功能片段，其针对包含在跨越降钙素原的第2至52位氨基酸残基的序列中的表位，以及
b.第二种抗体或其功能片段，其针对包含在跨越降钙素原的第53至116位氨基酸残基的序列中的表位。
优选情况下，试剂盒的第一种抗体针对包含在跨越降钙素原的第16至40位氨基酸残基的序列中的表位，优选针对选自包含在跨越降钙素原的第21至40位氨基酸残基的序列中的表位、包含在跨越降钙素原的第16至35位氨基酸残基的序列中的表位和包含在跨越降钙素原的第25至37位氨基酸残基的序列中的表位。
优选情况下，第一种抗体是单克隆抗体。优选情况下，第二种抗体也是单克隆抗体。
在试剂盒的优选实施方案中，第二种抗体针对包含在跨越降钙素原的第60至91位氨基酸残基的序列中的表位或针对包含在跨越降钙素原的第96至116位氨基酸残基的序列中的表位.
本发明还涉及以夹心免疫测定法格式使用本发明的试剂盒，用于检测或定量来自体液的生物样品中的降钙素原或其片段。这样的片段至少包含跨越两种抗体所针对的两个表位的序列。
此外，本发明涉及使用本发明的方法、本发明的抗体或本发明的试剂盒，用于在来自体液的生物样品中确定降钙素原或其片段的存在或不存在，或用于降钙素原或其片段的定量。
优选情况下，方法、抗体和试剂盒用于与降钙素原水平升高相关的疾病或病症的诊断、预后、风险分层、疗法监测、疗法指导或治疗措施的应用分层。
疾病或病症优选选自局部细菌感染(特别是气管和肺中)、脓毒症、重症脓毒症、脓毒性休克。疾病或病症还可以选自非感染性疾病包括但不限于心血管疾病(急性冠状动脉综合征、心力衰竭、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、中风)、癌症、糖尿病、慢性胃肠疾病、慢性肾病、高血压、骨科疾病包括骨质疏松症和神经变性疾病包括阿兹海默氏病。上面提到的所有疾病或病症可以伴有或不伴有一种或多种并发疾病。
本发明的抗体对它们的相应表位的亲和性，优选在108至1011M-1的范围内，优选大于109M-1。
术语“抗体”一般包含单克隆和多克隆抗体及其结合片段特别是Fc片段和所谓的“单链抗体”(Bird R.E.等，(1988)Science 242：423-6)、嵌合抗体、人源化抗体特别是CDR移植抗体，以及双链或四链抗体(Holliger P.等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-8)。还包括通过包括例如噬菌体展示等技术筛选的与样品中包含的目标分子特异性结合的免疫球蛋白样蛋白。在本发明的上下文中，“特异性结合”是指针对目标分子或其片段产生的抗体。如果抗体对目标分子或其上面提到的片段的亲和性，与针对含有目标分子的样品中包含的其他分子的亲和性相比，优选高至少50倍、更优选高100倍、最优选高至少1000倍，则该抗体被认为是特异性的。如何制造抗体和选择具有给定特异性的抗体，在本技术领域中是公知的。正如上文中所述，单克隆抗体是优选的。
本发明的优选测定法和检测方法包括各种格式的免疫测定法，例如放射免疫测定法(RIA)、化学发光和荧光免疫测定法、酶联免疫测定法(ELISA)、基于Luminex的珠子阵列、蛋白质微阵列测定法，以及快速检测格式例如免疫层析条样试验。
测定法可以是均相或非均相测定法、竞争和非竞争性夹心测定法。在本发明的使用两种抗体的特别优选的实施方案中，测定法采用夹心测定法形式，其是非竞争性免疫测定法，其中待检测和/或定量的PCT或其片段与第一抗体并与第二抗体结合。第一抗体可以结合到固相例如珠子、孔或其他容器的表面、芯片或条上，并且第二抗体是例如用染料、放射性同位素或反应性或催化活性部分标记的抗体。然后通过适合的方法测量与被分析物结合的标记抗体的量。“夹心测定法”所涉及的通用组合物和步骤是已确立的，并为专业技术人员所公知。(《免疫测定手册》(The Immunoassay Handbook)，David Wild主编，Elsevier LTD，Oxford；第三版(2005年5月)，ISBN-13：978-0080445267；Hultschig C等，Curr Opin Chem Biol.2006 Feb；10(1)：4-10.PMID：16376134)，在此引为参考。
在特别优选实施方案中，测定方法包含两种本发明的抗体，其都作为分散相存在于液体反应混合物中，其中第一种标记组分附着在第一种抗体上，其中所述第一种标记组分是基于荧光或化学发光-淬灭或扩增的标记系统的一部分，并且所述标记系统的第二种标记组分附着于第二种抗体上，使得当两种抗体与被分析物结合后产生可测量信号，允许检测在包含样品的溶液中形成的夹心复合物。
在更优选情况下，所述标记系统包含稀土穴状化合物或稀土螯合物与荧光染料或化学发光染料、特别是花青类型的染料的组合。
在本发明的情形中，基于荧光的测定方法包含使用染料，所述染料可以例如选自FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、IRD-700/800、花青染料例如CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7、占吨、6-羧基-2’，4’，7’，4，7-六氯荧光素(HEX)、TET、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素(JOE)、N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明110、BODIPY染料例如BODIPY TMR、俄勒冈绿、香豆素类例如伞形酮、苯并亚胺类例如Hoechst 33258；菲啶类例如德克萨斯红、雅吉瓦黄、Alexa Fluor、PET、溴化乙锭、吖啶类染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、卟啉染料、聚甲炔染料等。
在本发明的情形中，基于化学发光的测定方法包含使用基于化学发光材料的物理原理的染料，所述原理描述在Kirk-Othmer的《化学技术百科全书》(Encyclopedia of chemical technology)第四版，J.I.Kroschwitz执行主编，M.Howe-Grant编辑，John Wiley & Sons，1993，vol.15，p.518-562中，在此引为参考，包括在551-562页中的引用文献。优选的化学发光染料是吖啶酯。
最后，本发明还涉及保藏在DSMZ，登记号为DSM ACC2993、DSM ACC2996和DSM ACC2997的杂交瘤细胞系。这些杂交瘤细胞系产生本发明的优选抗体，其针对PCT的N-末端表位、特别是21至40和第25至37位的表位，并且如实施例1中所述来产生。
序列
SEQ ID NO：1(PCT的氨基酸序列)
1   APFRSALESS PADPATLSED EARLLLAALV QDYVQMKASE LEQEQEREGS
51  SLDSPRSKRC GNLSTCMLGT YTQDFNKFHT FPQTAIGVGA PGKKRDMSSD
101 LERDHRPHVS MPQNAN
附图描述
图1：用于与现有测定法(A和B：分别为B·R·A·H·M·S PCT LIA和B·R·A·H·M·S PCT灵敏LIA)进行比较的测定法(C、D和E)的示意图。图示了PCT及其降钙素和钙抑肽部分，并显示了抗体及其表位。A和B：一种抗体针对PCT的降钙素部分，其他抗体针对钙抑肽部分；C：其中一种抗体针对跨越PCT的21-40位氨基酸残基的序列中的表位，其他抗体针对PCT的钙抑肽部分的测定法。D、E：其中一种抗体针对跨越PCT的第21-40位氨基酸残基的序列中的表位，其他抗体针对PCT的降钙素部分的测定法。
图2：按大小分级的含PCT血清的PCT免疫反应性分布图。级分在测定法A(命名如图1)中进行测量，并将测量值与每次分级操作中每次测定的最大测量值相关联。显示了平均值+标准误差(SEM)。
图3：按大小分级的含PCT血清的PCT免疫反应性分布图。级分在测定法C和D(分别为图A和B；命名如图1)中进行测量，并将测量值与每次分级操作中每次测定的最大测量值相关联。显示了平均值+标准误差(SEM)。
图4：三种PCT夹心免疫测定法的剂量响应曲线。测定体系温育30分钟(图A)或2小时(图B)。PCT LIA和PCT LIA sens分别对应于B·R·A·H·M·S PCT LIA和B·R·A·H·M·S PCT灵敏LIA(在图1中命名为A和B)。FX1G5/anti-Calc.表示测定法E。
图5：降钙素原(PCT)的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)
实施例
实施例1：
材料和方法
A.单克隆抗体的产生
针对PCT的单克隆抗体原则上按照已描述的程序通过遗传免疫接种来生产(Costagliola等，J Immunol 1998；160：1458-65)。简单来说，通过标准程序，将PCT编码序列克隆到载体pcDNAIII(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)中。将在25％蔗糖中的100mg pcDNAIII-PCT在第0日注射到BALB/c小鼠的前胫骨肌中。在3和6周后重复注射。在最初免疫接种后8和11周以及在处死时从眼后毛细血管获得血样，所述处死是在18周后，并在同时取出脾脏和甲状腺。将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤细胞系。筛选细胞系分泌与固定化的重组人类PCT(InVivo GmbH，Hennigsdorf，Germany)结合的抗体的能力。使用这种方法，产生了分泌单克隆抗体FX7A7(由2009年6月4日保藏在DSMZ的登记号为DSM ACC2997的杂交瘤细胞系产生)、FW5H6(由2009年6月4日保藏在DSMZ的登记号为DSM ACC2996的杂交瘤细胞系产生)和FX1G5(由2009年4月29日保藏在DSMZ的登记号为DSM ACC2993的杂交瘤细胞系产生)的细胞系。
B.表位作图
三个单克隆抗体FX7A7、FW5H6和FX1G5的PCT中表位的作图，通过标准程序在肽微阵列上进行(JPT GmbH，Berlin，Germany)。肽微阵列由玻璃表面上的74个肽构成，它们显示为交叠的肽扫描(格式13/11：53个肽；格式20/15：21个肽)并因此覆盖了整个PCT序列。将微阵列用阻断缓冲液(Pierce，Superblock；室温下2小时)预处理，然后用pH 8的TBS缓冲液和水清洗(各三次)。将每个与处理过的微阵列用Axon Genepix 4000B扫描仪进行扫描用作背景对照(不能检测到信号)。将各个微阵列与抗体在测定缓冲液中温育(终浓度为60μg/mL，在Pierce Superblock缓冲液中；总测定体积为350μl，温育时间3h)。将微阵列用pH 8的TBS缓冲液清洗，然后与荧光标记的第二抗体温育(抗小鼠-Dylight-647抗体；Pierce 31015，1μg/mL，温育时间45min)。与所述试验平行地进行与荧光标记的第二抗体(抗小鼠-Dylight-647抗体；Pierce 31015，1μg/mL，温育时间45min)的对照温育。使用Axon Genepix 4000B扫描仪，使用适合的波长设置对微阵列进行扫描。使用SPOT识别软件包ArrayPro进行数据处理。使用每个微阵列图像上3个相同子阵列的信号强度(对局部背景进行了校正)的平均值进行数据评估。
C.免疫测定法
采取化学发光/包被管格式的夹心免疫测定法如下设置：
测定方法A：
使用了用于PCT的可商购夹心测定体系(BRAHMS PCT LIAsensitive)，其使用一种针对PCT的钙抑肽部分的抗体作为固相，以及一种针对PCT的降钙素部分的抗体作为标记抗体(BRAHMS AG，Hennigsdorf，德国)。使用各种浓度的重组PCT作为标准品。为了与测定方法E(参见下文)进行比较，采取了对测定方法E所描述的温育条件；即使用50μl样品和200μl标记抗体溶液，并在试管中在一步反应中温育30分钟或2小时。
测定方法B：
使用了用于PCT的可商购夹心测定体系(BRAHMS PCT LIA)，其使用一种针对PCT的钙抑肽部分的抗体作为固相，以及一种针对PCT的降钙素部分的单克隆抗体作为标记抗体(BRAHMS AG，Hennigsdorf，德国)。使用各种浓度的重组PCT作为标准品。为了与测定方法E(参见下文)进行比较，采取了对测定方法E所描述的温育条件；即使用50μl样品和200μl标记抗体溶液，并在试管中在一步反应中温育30分钟或2小时。
对于其他测定方法来说，测定组分如下产生：
抗体的标记
抗体FXlG5的标记通过标准程序(EP 1488209，EP 1738178)来进行：将纯化抗体的浓度调整至1g/L，并通过与化学发光标记物MACN-吖啶-NHS-酯(1g/L；InVent GmbH，Hennigsdorf，德国)以1∶5的摩尔比在室温下温育20分钟来标记。通过加入1/10体积的50mmol/L甘氨酸，在室温下放置10分钟来终止反应。在NAP-5柱(GE Healthcare，Freiburg，德国)和SEC-400-5 HPLC柱(BIO-RAD)上通过孔径排阻层析将标记过的抗体与游离标记物分离开。
抗体的包被
针对PCT的降钙素部分的单克隆抗体(BRAHMS AG，Hennigsdorf，德国)的包被，通过标准程序(EP 1488209，EP 1738178)来进行：将聚苯乙烯startube(Greiner)用纯化的抗体(每个管，2μg抗体在300μl 10mmol/L Tris，100mmol/L NaCl，pH 7.8中)在22℃下包被过夜。然后将管用含有30g/L Karion FP(Merck)、5g/L无蛋白酶的牛血清白蛋白(Sigma)的10mmol/L磷酸钠(pH 6.5)阻断，并冷冻干燥。
对于这些组分，建立了下列测定方法：
测定方法C：
用抗钙抑肽抗体包被的管和标准品(重组PCT)从B.R.A.H.M.SPCT LIA sensitive测定体系(B.R.A.H.M.S AG，Hennigsdorf，德国)获得。将MACN标记的抗体FX1G5用作标记抗体。测定缓冲液是300mmol/L磷酸钾，pH 7.0，100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，0.9g/L叠氮化钠，5g/L无蛋白酶的牛血清白蛋白(Sigma)，1g/L非特异性牛IgG，1g/L非特异性绵羊IgG，1g/L非特异性小鼠IgG，并且每200μl含有2x106个相对光单位(RLU)的MACN标记抗体。将100μl标准品或样品和200μl含有MACN标记抗体的测定缓冲液吸取到包被的管中。将管在22℃下，在搅拌下温育2小时。然后，将管用1mLB.R.A.H.M.S清洗缓冲液(B.R.A.H.M.S AG，Hennigsdorf，德国)洗涤5次，并使用LB952T照度计(Berthold)对每个管的结合的化学发光测量1秒。使用软件MultiCalc(Spline Fit)计算样品浓度。
测定方法D：
使用抗降钙素抗体包被的管。标准品(重组PCT)从B.R.A.H.M.SPCT LIA sensitive测定体系(B.R.A.H.M.S AG，Hennigsdorf，德国)获得。将MACN标记的抗体FX1G5用作标记抗体。测定缓冲液是300mmol/L磷酸钾，pH 7.0，100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，0.9g/L叠氮化钠，5g/L无蛋白酶的牛血清白蛋白(Sigma)，1g/L非特异性牛IgG，1g/L非特异性绵羊IgG，1g/L非特异性小鼠IgG，并且每200μl含有2x106个相对光单位(RLU)的MACN标记抗体。将100μl标准品或样品和200μl含有MACN标记抗体的测定缓冲液吸取到包被的管中。将管在22℃下，在搅拌下温育2小时。然后，将管用1mLB.R.A.H.M.S清洗缓冲液(B.R.A.H.M.S AG，Hennigsdorf，德国)洗涤5次，并使用LB952T照度计(Berthold)对每个管的结合的化学发光测量1秒。使用软件MultiCalc(Spline Fit)计算样品浓度。
测定方法E：
使用FX1G5抗体包被的管。标准品(重组PCT)和标记的多克隆抗降钙素抗体从B.R.A.H.M.S PCT LIA sensitive测定体系(B.R.A.H.M.S AG，Hennigsdorf，德国)获得。将50μl标准品或样品和200μl含有MACN标记抗体的测定缓冲液吸取到包被的管中。将管在22℃下，在搅拌下温育30分钟或2小时。然后，将管用1mLB.R.A.H.M.S清洗缓冲液(B.R.A.H.M.S AG，Hennigsdorf，德国)洗涤5次，并使用LB952T照度计(Berthold)对每个管的结合的化学发光测量1秒。
D.孔径排阻层析
使用SEC-125-5 HPLC柱(BIO-RAD)对来自9个具有高PCT浓度的患者(包括患有脓毒症的患者)的血浆样品进行分级。样品体积是100μl。运行缓冲液是pH 7.4的PBS。流速为0.8mL/min。收集0.4mL级分在测定方法A、C、D中测量。使用下列肽作为校准物：重组PCT(MW＝约13kDa；InVivo GmbH，Hennigsdorf，德国)，preproADM 45-92(序列为ELRMSS SYPTGLADVK AGP AQTLIRPQDMKGASRSP EDSSPDAARI RV；MW＝5.1kDa；JPT GmbH，Berlin，德国)，维生素B12(MW 1.3kDa)。将重组PCT和preproADM 45-92溶解在从BRAHMS PCT LIA sensitive和BRAHMS MR-proADM LIA测定体系(BRAHMS AG，Hennigsdorf，德国)获得的标准基质中，并使用这些测定体系测定它们的孔径分级HPLC洗脱情况。维生素B12在运行缓冲液中洗脱并进行层析；记录280nm处的吸收。
E.样品测量
在测定方法A、C、D中测量了患有局部细菌感染、脓毒症、脓毒性休克的患者的30个血清样品。
结果
单克隆抗体
使用整个PCT编码序列通过遗传免疫接种产生了三种小鼠单克隆抗体。对于所有三种抗体来说，表位作图显示出相似、尽管不一致的结果(表2)。抗体FW5H6和FX7A7显示出与肽EARLLLAALVQDYVQMKASE(PCT中的21-40位)的最强结合，而对于抗体FX1G5来说，观察到的最强结合是在源自于前一个肽上，即LLAALVQDYVQMK(25-37位)。在这些区域之外，对于三种抗体来说没有鉴定到PCT序列中的其他明显结合位点。这里使用的免疫接种方法仅仅是一个实例。可以可选地用于产生针对所述区域中的表位、更通常为53位上游的表位的抗体的其他方法是公知的，例如可以使用与载体蛋白偶联的化学合成的肽作为抗原。
孔径排阻层析
通过使用孔径排阻HPLC对来自具有高天然PCT浓度的患者(包括脓毒症患者)的血清样品进行分级，来评估天然PCT的表观分子量和使用各种夹心免疫测定法的可检测性。无论级分的测量是使用测定方法A、C还是D，基本上观察到相同的免疫反应性分布情况(图1)：天然PCT与重组PCT(13kDa)的洗脱时间不能区分(图2和3)。事实上，使用三种测定方法中的任一种，没有检测到对应于分子量小于13kDa的PCT免疫反应性。尤其是，通过测定方法A没有检测到对应于分子量约为6kDa的PCT免疫反应性；而如果当前技术的假设是正确的，即PCT能够在PCT的降钙素部分的紧上游切开，这种现象预计将会出现。这些结果证实，与当前技术的推测相反，在具有高PCT浓度(不包含甲状腺髓样瘤)的患者中，没有检测到在分子中央切开的PCT，并且A、C或D型夹心免疫测定法检测相同的抗原。
样品测量
在测定方法A、C、D中测量了患有局部细菌感染、脓毒症、脓毒性休克的患者的30个血清样品。得出如下的Spearman相关系数：测定法A比C：r＝0.9893；测定法A比D：r＝0.9844。这些源自于患有各种严重性程度感染的患者的大量样品的测量值的理想的相关系数，清楚地证实了通过孔径排阻层析所获得的结果，使得人们不得不得出下述通用结论，即当高于正常时(不包含甲状腺髓样瘤)，PCT不在分子的中央被切开。
测定方法的性质
在使用抗降钙素抗体作为第二抗体的夹心测定法(测定方法E)中，对本发明描述的抗体之一、即具有对应于PCT的第25-37位的表位的FX1G5的使用进行了分析，并与使用相同检测技术(包被管/化学发光标记)的现有技术的PCT测定方法、即BRAHMS PCT LIA sensitive(测定方法A)和BRAHMS PCT LIA(测定方法B)进行了比较。令人吃惊的是，测定方法E与两种现有测定方法相比，表现出明显更加动态的剂量响应曲线，而不依赖于温育时间(图4)。
表1：所描述的抗PCT抗体及其在免疫测定法中的应用
表2：表位作图结果：三种抗体与所显示的表示完整PCT序列的子序列的肽的观察到的结合信号，与每种抗体获得的最强结合相关联(B/Bmax)

Claims (21)

1.一种用于在源自于从对象获得的体液的生物样品中检测降钙素原或其长度为至少20个氨基酸残基并且包含至少两种抗体的识别位点的片段的体外方法，所述方法包含下列步骤：
a.将所述样品与针对降钙素原不同表位的至少两种抗体或其功能片段相接触，以及
b.定性或定量检测所述至少两种抗体与降钙素原或其所述片段的结合，其中结合指示所述样品中降钙素原或所述片段的存在或浓度，
其中至少一种抗体或其功能片段针对包含在跨越降钙素原的第16至40位氨基酸残基的序列中的表位。
2.权利要求1的方法，其中针对包含在跨越降钙素原的第16至40位氨基酸残基的序列中的表位的抗体或其功能片段是单克隆抗体。
3.权利要求1或2的方法，其中一种其它抗体或其功能片段针对包含在跨越降钙素原的第53至116位氨基酸残基的序列中的表位。
4.权利要求1的方法，其中包含在跨越降钙素原的第16至40位氨基酸残基的序列中的表位选自包含在跨越降钙素原的第21至40位氨基酸残基的序列中的表位、包含在跨越降钙素原的第16至35位氨基酸残基的序列中的表位和包含在跨越降钙素原的第25至37位氨基酸残基的序列中的表位。
5.权利要求3的方法，其中包含在跨越降钙素原的第53至116位氨基酸残基的序列中的表位是包含在跨越降钙素原的第96至116位氨基酸残基的序列中的表位或包含在跨越降钙素原的第60至91位氨基酸残基的序列中的表位。
6.权利要求3的方法，其中针对包含在跨越降钙素原的第53至116位氨基酸残基的序列中的表位的抗体或其功能片段，是单克隆抗体。
7.一种抗体或其功能片段，其针对包含在跨越降钙素原的第16至40位氨基酸残基的序列中的表位。
8.权利要求7的抗体或其功能片段，其中抗体或其功能片段所针对的表位选自包含在跨越降钙素原的第21至40位氨基酸残基的序列中的表位、包含在跨越降钙素原的第16至35位氨基酸残基的序列中的表位和包含在跨越降钙素原的第25至37位氨基酸残基的序列中的表位。
9.权利要求7或8的抗体或其功能片段，其中抗体是单克隆抗体。
10.权利要求9的抗体或其功能片段，其中抗体由保藏在DSMZ的登记号为DSM ACC2993、DSM ACC2996或DSM ACC2997的杂交瘤细胞系产生。
11.一种试剂盒，其至少包含：
a.针对包含在跨越降钙素原的第16至40位氨基酸残基的序列中的表位的第一种抗体或其功能片段，以及
b.针对包含在跨越降钙素原的第53至116位氨基酸残基的序列中的表位的第二种抗体或其功能片段。
12.权利要求11的试剂盒，其中第一种抗体针的表位选自包含在跨越降钙素原的第21至40位氨基酸残基的序列中的表位、包含在跨越降钙素原的第16至35位氨基酸残基的序列中的表位和包含在跨越降钙素原的第25至37位氨基酸残基的序列中的表位。
13.权利要求11的试剂盒，其中第二种抗体针对包含在跨越降钙素原的第60至91位氨基酸残基的序列中的表位或针对包含在跨越降钙素原的第96至116位氨基酸残基的序列中的表位。
14.权利要求11的试剂盒在夹心免疫测定法中的应用，所述夹心免疫测定法用于在来自体液的生物样品中检测和或定量降钙素原。
15.权利要求1至6任一项的方法、权利要求7至10任一项的抗体或其功能片段、或权利要求11至13任一项的试剂盒在来自体液的生物样品中确定降钙素原或其片段的存在或不存在或用于降钙素原或其片段的定量中的应用。
16.两种抗体或其功能片段在制备试剂盒中的应用，其中第一抗体或其功能片段针对包含在跨越降钙素原的第16至40位氨基酸残基的序列中的表位，以及第二抗体或其功能片段针对包含在跨越降钙素原的第53至116位氨基酸残基的序列中的表位，所述试剂盒用于与降钙素原水平升高相关的疾病或病症的诊断、预后、风险分层、疗法监测、疗法指导或治疗措施的应用分层。
17.权利要求16的应用，其中疾病或病症选自局部细菌感染、脓毒症、脓毒性休克和非感染性疾病。
18.权利要求16的应用，其中疾病或病症选自重症脓毒症、心血管疾病、癌症、糖尿病、慢性胃肠疾病、慢性肾病、高血压、骨科疾病和神经变性疾病。
19.权利要求16的应用，其中疾病或病症选自心力衰竭、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、中风、骨质疏松症和阿兹海默氏病。
20.权利要求16的应用，其中疾病或病症选自急性冠状动脉综合征。
21.杂交瘤细胞系，其保藏在DSMZ，登记号为DSM ACC2993、DSM ACC2996或DSM ACC2997中的任一个。
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