CN106153943B - 用作糖尿病预测生物标志物的精氨酸加压素激素原 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用作糖尿病预测生物标志物的精氨酸加压素激素原。更具体而言，本发明的主题是用于预测对象发生代谢综合征和/或糖尿病的风险和用于诊断代谢综合征的测定方法和体外方法，其包含测定对象样品中的精氨酸加压素激素原或其片段的水平。

Description

用作糖尿病预测生物标志物的精氨酸加压素激素原
本申请为国际申请日2009年10月29日、国际申请号PCT/EP2009/007923于2011年5月3日进入中国国家阶段、申请号200980143882.4、发明名称“用作糖尿病预测生物标志物的精氨酸加压素激素原”的分案申请。
发明领域
本发明属于预后生物标志物和预后测定方法领域。具体来说，本申请涉及糖尿病的预测和代谢综合征的诊断。
背景技术
精氨酸加压素(AVP)，也称为抗利尿激素(ADH)，在下丘脑中产生，并在高血浆重量克分子渗透压浓度、低血浆体积和低血压的情况下从神经垂体腺释放。AVP结合到三种不同受体上(V1aR、V1bR和V2R)。V1aR广泛表达(Nature 1993:356:523-526)，而V1bR和V2R更特异地分别表达在垂体腺和肾脏集合管中(Nature 1992:336-339和FEBS Lett 1994:356:215-220)。AVP的抗利尿效应通过V2R介导，并且V2R的药物阻断在低钠血症和心力衰竭的治疗中具有有利效应，而可在临床上用于出血和低血压病症的AVP的血栓前和血管收缩效应，主要通过V1aR介导。此外，已经提出AVP的作用与调节ACTH释放(V1bR)、刺激肝脏糖原生成(V1aR)以及刺激胰岛素和胰高血糖素分泌(V1aR)相关(Morel等，Nature 1992；356(6369):523-6；de Keyzer等，FEBS letters 1994；356(2-3):215-20；Ventura等，Journal ofmolecular endocrinology 1999；22(3):251-60)。
以前对人类和动物模型的研究，已经表明了AVP系统在葡萄糖体内平衡、胰岛素抗性和糖尿病中的作用。在具有控制不良的糖尿病和高重量克分子渗透压浓度的患者中，血浆AVP显著升高(Lolait等，Nature 1992；357(6376):336-9)，并且在健康对象中，AVP灌输导致血糖水平增加(Schrier等，N Engl J Med 2006；355(20):2099-112)。缺少V1aR的小鼠显示出受损的葡萄糖耐受性、胰岛素抗性和升高的AVP水平(Gheorghiade等，Jama 2007；297(12):1332-43；Federici等，Annals of medicine 2007；39(5):346-58)，而缺少V1bR的小鼠具有与正常小鼠相比较低的禁食血浆葡萄糖水平和胰岛素灵敏性升高的相反表型(Dunser等，Circulation 2003；107(18):2313-9)。
血管加压素基因编码前体蛋白(pre-pro-AVP)，其包含19个氨基酸的信号序列、精氨酸加压素和两个相关蛋白，即后叶激素运载蛋白II和一种糖肽——和肽素。和肽素是AVP前体C-端的无生物活性的切割产物，并以与AVP等摩尔的量产生。然而，与AVP相反，和肽素稳定、具有长的半衰期、不与血小板结合，因此与AVP相比以明显更高的浓度在血浆中发现，并且已经提出将它作为评估血管加压素释放的可替选的诊断靶(Struck J,MorgenthalerNG,Bergmann A.“和肽素，一种源自于血管加压素前体的稳定的肽，在脓毒症患者的血清中升高”(Copeptin,a stable peptide derived from the vasopressin precursor,iselevated in serum of sepsis patients)，Peptides.2005Dec；26(12):2500-4)。
已经将AVP描述为糖尿病的诊断标志物，并且使用I型糖尿病动物模型，已经了解到AVP水平作为急性或慢性应激物与糖尿病相关(Sun Shin Yi等，“在2型糖尿病大鼠的下丘脑室旁核和视上核中精氨酸加压素(Avp)的增强表达”(Enhanced expressions ofarginine vasopressin(Avp)in the hypothalamic paraventricular and supraopticnucleic of type 2diabetic rats,Neurochem Res(2008)33:833-841)。
发明内容
本发明人令人吃惊地发现，在精氨酸加压素(AVP)激素原或其片段的相对增加的水平与存在代谢综合征和发生糖尿病的风险之间存在关联。在此背景下，由本发明提供了包含至少一种单克隆抗体的灵敏精确的和肽素测定方法。
因此，本发明的主题是用于预测对象发生糖尿病和/或代谢综合征的风险，或用于鉴定具有发生糖尿病和/或代谢综合征的高风险的对象，或用于诊断对象代谢综合征的体外方法，所述方法包含下列步骤：
a.提供来自所述对象的样品，
b.测定所述样品中精氨酸加压素激素原或其片段的水平，
c.使用精氨酸加压素激素原或其片段的所述水平预测对象发生糖尿病和/或代谢综合征的可能性，或用于从其推断出所述对象发生糖尿病和/或代谢综合征的风险，或用于诊断所述对象的代谢综合征。
本发明的另一个主题是灵敏精确的和肽素测定方法。
具体实施方式
本发明涉及用于预测对象发生糖尿病和/或代谢综合征的风险，或用于鉴定具有发生糖尿病和/或代谢综合征的高风险的对象，或用于诊断对象代谢综合征的方法，所述方法包含下列步骤：
a.提供来自所述对象的样品，
b.测定所述样品中精氨酸加压素激素原或其片段的水平，
c.使用精氨酸加压素激素原或其片段的所述水平预测对象发生糖尿病和/或代谢综合征的可能性，或用于从其推断出所述对象发生糖尿病和/或代谢综合征的风险，或用于诊断所述对象代谢综合征。
在本文中，“使用精氨酸加压素激素原或其片段的所述水平预测对象发生糖尿病和/或代谢综合征的可能性，或用于从其推断出所述对象发生糖尿病和/或代谢综合征的风险，或用于诊断所述对象代谢综合征”，可以具有“将精氨酸加压素激素原或其片段的所述水平与对象发生糖尿病和/或代谢综合征或与诊断所述对象代谢综合征相关联”的意义。
在本发明所有情况的优选实施方案中，所述对象是表观健康的。
当在本文中使用时，“表观健康的”是指个体不患有糖尿病。在某些实施方案中，表观健康的对象患有代谢综合征。本发明的方法可用于诊断对象是否患有代谢综合征。
当在本文中使用时，术语“对象”是指活的人类或非人类生物体。在本文中，优选情况下对象是人类对象。
优选情况下，所述对象是非糖尿病人。
在非常特定的实施方案中，表观健康的对象是以前没有或没有意识到具有心血管或冠状动脉事件或心力衰竭或未患有心血管疾病的个体。冠状动脉事件被定义为致死性或非致死性急性冠状动脉综合征，包括心肌梗塞或由缺血性心脏病引起的死亡。心血管事件被定义为致死性或非致死性急性冠状动脉综合征，包括心肌梗塞、致死性或非致死性中风或由心血管疾病引起的死亡。此外，在非常特定的实施方案中，表观健康的对象可以不患有急性传染病。
在另一个非常特定的实施方案中，表观健康的对象可能患有心血管疾病和/或可能已具有心血管或冠状动脉事件或心力衰竭。在某些实施方案中，他们可能患有传染病。
在一个实施方案中，对象表现出受损的禁食血糖(受损的禁食葡萄糖)，即血液中的禁食葡萄糖水平(禁食血糖(FBG)或禁食血液糖(FBS))低于6.1但高于5.4mmol/L。因此，在特别优选实施方案中，所述对象是禁食血糖低于6.1mmol/L但高于5.4mmol/L的非糖尿病人。
在另一个特别优选实施方案中，所述对象是没有受损的禁食血糖的对象。因此，在特别优选实施方案中，所述对象是禁食血糖低于5.4mmol/L的对象。
禁食血糖在对象最后一次摄入食物后至少8小时、典型在最后一次食物摄入后8至10小时测量。
本文中的(禁食)血糖水平根据全血葡萄糖水平给出。一般来说，可以在全血、血清或血浆中测量葡萄糖，但是参考值根据样品的类型而有所不同。
在本文中，精氨酸加压素激素原或其片段的水平的测定(或测量或检测)，使用下面解释的诊断测定方法来进行。
精氨酸加压素激素原(pro-AVP)的优选片段是C-端pro-AVP(CT-pro-AVP或和肽素)，即覆盖pro-AVP的107-145(pre-pro-AVP的126-164)氨基酸位置的翻译后修饰(糖基化)的肽。
在优选实施方案中，精氨酸加压素激素原(pro-AVP)的片段不是成熟的AVP。
在方法的特别优选实施方案中，测定和肽素的水平。
在本文中，当在激素原和其他肽的上下文中提到时，术语“片段”是指可以从较大蛋白或肽得到的较小蛋白或肽，因此其包含较大蛋白或肽的部分序列。所述片段可以从较大蛋白或肽通过其一个或多个肽键的皂化作用而产生。
精氨酸加压素激素原(pro-AVP)的“片段”优选是指长度为至少6个氨基酸、最优选长度为至少12个氨基酸残基的片段。这样的片段优选可以使用本文描述的免疫测定方法检测。
在本发明的文本中，在表述例如“激素原的水平”和类似表述中，术语“水平”是指在相应上下文中提到的分子实体的量，或在酶的情况下它也可以是指酶活性。
本发明的方法尤其适用于预测发生II型糖尿病的风险。
在一个实施方案中，对象发生糖尿病和/或代谢综合征的风险的预测或代谢综合征的诊断，可以通过附加地测定和使用至少一种实验室参数或其他标志物来改进，所述实验室参数和其他标志物选自禁食血液或血浆葡萄糖、甘油三酯、HDL胆固醇或其亚级分、LDL胆固醇或其亚级分、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、胰岛素、CRP、A型和B型利尿钠肽以及包括ANP、proANP、NT-proANP、MR-proANP、BNP、proBNP、NT-proBNP的它们的前体及其片段、GDF15、ST2、降钙素原及其片段、肾上腺髓质素原及其包括ADM、PAMP、MR-proADM、CT-proADM的片段、内皮素原-1及其包括CT-proET-1、NT-proET-1、大内皮素-1和内皮素-1的片段。
在本发明的特定实施方案中，附加测定了至少一种临床参数，其选自年龄、性别、收缩压、舒张压、抗高血压治疗(AHT)、体重指数、腰围、腰臀比、当前吸烟、糖尿病遗传和以前的心血管疾病(CVD)。
根据世界卫生组织(World Health Organization)(WHO)的定义，糖尿病是当胰腺不能产生足够胰岛素、或当身体不能有效使用它所产生的胰岛素时发生的慢性疾病。这导致血液中葡萄糖浓度升高(高血糖)。1型糖尿病(以前称为胰岛素依赖型或儿童糖尿病)的特征为胰岛素生产不足。2型糖尿病(以前称为非胰岛素依赖型或成年糖尿病)由身体利用胰岛素的效率低引起。它通常起因于体重超重和身体缺乏活动。
2型糖尿病是一种代谢障碍，其主要特征为胰岛素抗性、胰岛素相对不足和高血糖。世界卫生组织的糖尿病定义涉及单一升高的葡萄糖读数和症状，换句话说在两种情况的任一种下的升高值：(i)禁食血浆葡萄糖>7.0mmol/1(126mg/dl)或(ii)使用葡萄糖耐受性测试(GTT)，口服药剂后2小时血浆葡萄糖>11.1mmol/1(200mg/dl)。2型糖尿病常见的初始症状是呼气中微弱的水果或蔬菜气味。这由对胰岛素缺乏响应、导致细胞内缺乏葡萄糖所诱导的酮病引起。它通常伴有高血糖水平，其也是对胰岛素敏感性降低的结果。
代谢综合征是医学病症的组合，其增加发生心血管疾病和糖尿病的风险。它影响大量人群，并且普遍性随年龄增加。某些研究估计在美国的患病率高达人群的25％。代谢综合征也称为代谢综合征X、综合征X、胰岛素抗性综合征、Reaven's综合征和CHAOS(澳大利亚)。重要的是尽早鉴定具有代谢综合征的个体，以便生活方式干预和治疗可能阻止糖尿病和/或心血管疾病的发生。代谢综合征下潜伏的原因对专家来说仍是挑战。胰岛素抗性和躯干性肥胖被认为是重要因素。遗传、身体缺乏活动、衰老、前炎性状态和激素变化也可能具有因果效应，但是它们的作用可能随着种族组而变。由于代谢综合征的机理原因的不确定性，关于代谢综合征的定义存在大量混乱。代谢综合征多种定义的存在已经引起混乱，并产生了许多比较每种定义的优点的研究和研究论文。根据国家胆固醇教育项目(NCEP)专家委员会关于成人高血液胆固醇的检测、评估和治疗的第三次报告的计划概要(AdultTreatment Panel III)(JAMA.2001；285(19):2486-2497)，代谢综合征被定义为存在下列要素中的三种或三种以上：(1)腰围在女性中≥88cm(35英寸)或在男性中≥102cm(40英寸)，(2)BP≥130/85mmHg或进行高血压治疗，(3)禁食甘油三酯≥150mg/dL，(4)HDL胆固醇在男性中≤40mg/dL或在女性中≤50mg/dL，以及(5)禁食血糖≥110mg/dL或进行糖尿病治疗。更近些时候由国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation)给出了具有一些修改的定义(http://www.idf.org/webdata/docs/IDF_Meta_def_final.pdf)。因为定义代谢综合征的目的是鉴定处于发生糖尿病和/或心血管疾病的高风险中的对象，因此与这些风险独立相关的预后因子可以与代谢综合征直接相关，并且在这种意义上用于诊断代谢综合征的存在。因此，可用于独立预测糖尿病发生的标志物、例如本发明中显示的和肽素，必须在同时被当作代谢综合征存在的诊断标志物(与其他诊断性实验室和临床参数一起)，并且甚至能够预期它在将来将变成代谢综合征定义的一部分。
因此，对象样品中精氨酸加压素激素原或其片段的预定水平，可以与其他临床和/或实验室参数联合，用于帮助将“代谢综合征”定义为医学病症。换句话说，精氨酸加压素激素原或其片段的水平可用作附加参数，以在决定性判据方面改进代谢综合征的定义，因为上面概述的现有判据不是在所有情况下都产生令人满意的结果。
胰岛素抗性(IR)是其中给定浓度的胰岛素产生低于预期的生物学效应的状态。胰岛素抗性也已被任意定义为每天需要200或以上单位的胰岛素才能获得血糖控制并阻止酮病。由胰岛素抗性引起的高血浆胰岛素和葡萄糖水平，通常导致代谢综合征和2型糖尿病，包括其并发症。IR的症状可以包括疲劳、大脑迷糊、注意力无法集中、低血糖、肠膨胀、嗜睡、体重增加、脂肪储存、减肥困难、高血液甘油三酯水平、高血压和抑郁。
本发明还涉及如上所述的用于预测对象发生糖尿病和/或代谢综合征的风险，或用于鉴定具有发生糖尿病和/或代谢综合征的高风险的对象，或用于诊断对象代谢综合征的方法，其中精氨酸加压素激素原或其片段的水平单独地或与其他预后有用的实验室或临床参数组合，通过可以选自下列可选方案的方法，用于预测对象发生糖尿病和/或代谢综合征的风险或用于诊断代谢综合征：
-与表观健康对象群体中全部预定样品中的精氨酸加压素激素原或其片段的水平的中位数进行比较，
-与表观健康对象群体中全部预定样品中的精氨酸加压素激素原或其片段的水平的分位数进行比较，
-根据Cox比例风险分析或使用风险指数计算例如NRI(净重新分类指数)或IDI(综合鉴别指数)进行计算。
在优选实施方案中，在诊断测定方法中、优选通过免疫测定方法测定精氨酸加压素(AVP)激素原或其长度为至少12个氨基酸的片段的水平。特别优选情况下，测定和肽素或其长度为至少12个氨基酸的片段的水平。
本发明还可以包含将个体的标志物(这里为精氨酸加压素激素原或其片段例如和肽素)的水平与预定值进行比较。预定值可以采取各种形式。它可以是单一截止值，例如群体的中位数或平均值或75th、90th、95th或99th百分位数。它可以根据对比组来建立，例如一个规定组中的风险为另一个规定组中风险的两倍。它可以是范围，例如将测试群体等量(或不等量)地分组，例如低风险组、中风险组和高风险组，或分成四等分，最低的四分之一是具有最低风险的个体，最高的四分之一是是具有最高风险的个体。
在所选的特定群体中，预定值可以随着他们的嗜好、种族、遗传等而变化。例如，表观健康的非吸烟者群体(没有可检测的疾病，特别是没有糖尿病)可以与吸烟群体或其成员患有糖尿病的群体具有不同的标志物“正常”范围。因此，所选的预定值可以考虑个体所属类别。本技术领域的普通专业人员可以使用不超出常规的实验来选择适合的范围和类别。
在本发明方法的具体实施方案中，精氨酸加压素激素原或其片段的所述水平的使用包含将精氨酸加压素激素原或其片段的所述水平与阈值水平进行比较，由此当精氨酸加压素激素原或其片段的所述水平高于所述阈值水平时，在对象中预测了糖尿病和/或代谢综合征，或鉴定到对象具有发生糖尿病和/或代谢综合征的高风险。
其他优选的截止值是例如正常群体的90th、95th或99th百分位数。通过使用比75th百分位数更高的百分位数，人们可以减少鉴定到的假阳性对象的数量，但是人们可能错过鉴定到具有中等、尽管仍然增加的风险的对象。因此，人们可以根据被认为更加合适的是以也鉴定到“假阳性”为代价而鉴定大多数有风险对象，还是以错过几个具有中等风险的对象为代价而主要鉴定高风险对象，来调整截止值。
通过使用个体的和肽素值和其他预后性实验室和临床参数来计算个体风险的其他数学可能性是例如NRI(净重新分类指数)或IDI(综合鉴别指数)。指数可以按照Pencina的文献来计算(Pencina MJ等：“评估新标志物的增加预测能力：从ROC曲线下面积到重新分类等”(Evaluating the added predictive ability of a new marker:from area underthe ROC curve to reclassification and beyond)，Stat Med.2008；27:157-172)。
例如，样品中和肽素水平为5.04pmol/L(即表观健康对象参比群体的中位数浓度)或以上，优选高于7.93pmol/L(即表观健康对象参比群体的Q3/Q4边界浓度)，可以指示患者发生糖尿病的升高的风险。本文中的Q1、Q2、Q3和Q4是指表观健康对象参比群体的四分位数。
在其他具体方面，本发明涉及用于诊断对象代谢综合征的方法，所述方法包括下列步骤：
a.提供来自所述对象的样品
b.测定所述样品中精氨酸加压素激素原或其片段的水平，
c.测定与代谢综合征的诊断相关的其他临床和/或实验室参数，
d.将与其他临床和/或实验室参数联合的精氨酸加压素激素原或其片段的水平与代谢综合征的诊断相关联。
本发明的范围内还包括测定样品中和肽素水平的测定方法，用于预测对象发生糖尿病和/或代谢综合征的风险或诊断代谢综合征。
优选情况下，测定方法所具有的总测定不精确性，在低于2.2pmol/L的浓度下为20％CV，在高于该浓度的正常范围浓度下低于20％CV，和/或在低于9pmol/l的浓度下为10％CV，并且在高于该浓度的正常范围浓度下低于10％CV。
在另一个优选实施方案中，在静息时在健康的禁食女性白人群体的血清和血浆中测定到的中位数和肽素浓度下，测定方法具有最高12％的总测定不精确性。
在上述测定方法的优选实施方案中，测定方法包含两种抗和肽素抗体，其中至少一种抗体是单克隆抗体或其片段或重组变体。
本发明还涉及用于测定样品中和肽素水平的测定方法，其中测定方法包含两种抗和肽素抗体，其中至少一种抗体是单克隆抗体或其片段或重组变体。
优选情况下，测定方法包含单克隆和多克隆抗体。
在本发明的测定方法的另一个优选实施方案中，一种单克隆抗体与代表前血管加压素原的132-147位的肽中包含的表位结合。
通过本发明的方法或通过使用本发明的测定方法获得的标志物的水平，可以本技术领域的专业人员熟知的各种方式进行分析。例如，可以将获得的每个测定结果与“正常”值或表明特定疾病或结果的值进行比较。具体的诊断/预后可以取决于每个测定结果与这种值的比较，所述值可以被称为诊断或预后“阈值”。在某些实施方案中，用于一种或多种诊断或预后指示物的测定方法，仅仅通过测定方法中指示物的存在或不存在与病症或疾病相关联。例如，可以设计测定方法，使得只有当高于特定目标阈值浓度时才出现阳性信号，并且低于该浓度时测定方法不提供高于背景的信号。
诊断和/或预后测试的灵敏度和特异性不仅取决于测试的分析“质量”，而且还取决于构成异常结果的定义。在实践中，典型地通过将“正常”(即表观健康的)和“患病”群体(即患有糖尿病、胰岛素抗性和/或代谢综合征的患者)的变量值对其相对频率进行作图，计算出受试者工作特征曲线(ROC曲线)。对于任何特定标志物来说，患有或未患疾病的对象的标志物水平分布可能交叠。在这些条件下，测试不能以100％准确性绝对辨别正常与疾病，并且交叠的区域表示测试不能辨别正常与疾病的地方。选择一个阈值，高于它(或低于它，取决于标志物随着疾病如何变化)时测试被认为是异常的，低于它时测试被认为是正常的。ROC曲线下的面积是感觉到的测量值将允许正确鉴定病症的概率的度量。即使在测试结果不一定给出准确数字的情况下，ROC曲线也能使用。只要人们能够对结果排序，人们即能产生ROC曲线。例如，在“患病”样品上进行的测试的结果可以按照程度排序(例如1＝低，2＝正常，3＝高)。这种排序可以与“正常”群体中的结果相关联，并产生ROC曲线。这些方法在本技术领域中是公知的。参见例如Hanley等，Radiology 143:29-36(1982)。优选情况下，所选的阈值能够提供的ROC曲线面积大于约0.5、更优选大于约0.7、更优选大于约0.8、更优选大于约0.85，并且最优选大于约0.9。在该上下文中，术语“约”是指给定测量值的+/-5％。
ROC曲线的水平轴表示(1-特异性)，其随着假阳性率而增加。曲线的垂直轴表示灵敏度，其随着真阳性率而增加。因此，对于所选的具体截止值来说，可以测定(1-特异性)的值，并可以获得相应的灵敏度。ROC曲线下的面积是测量到的标志物水平将允许正确鉴定疾病或病症的概率的度量。因此，ROC曲线下的面积可用于确定测试的有效性。
在某些实施方案中，不依赖于组中的一个或多个标志物的具体阈值来确定从对象获得的标志物水平分布情况是否指示了特定诊断/预后。相反，本发明可以利用标志物组“分布情况”作为不可分割的整体进行评估。这种标志物组中变化的特定“指纹”组合形式能够有效用作特定的诊断或预后指示物。正如在本文中讨论的，变化的组合形式可以从单一样品或组的一个或多个成员的时间变化(或组的响应值)获得。这里的组是指一组标志物。
正如在本文后面所描述的，组的响应值优选通过对在各种截止值下特定标志物组的灵敏度对组的1-(特异性)进行ROC曲线作图来确定。在这些方法中，来自对象的标志物测量值的分布情况合在一起，被认为提供了诊断或预后的全局概率(表示成数字分值或风险百分率)。在这样的实施方案中，标志物的某些子集的增加可能足以在一个患者中指示特定诊断/预后，而标志物的不同子集的增加可能足以在另一个患者中指示相同或不同的诊断/预后。也可以向组中的一个或多个标志物施加权重因数，例如，当标志物在鉴定特定诊断/预后中效用特别高时，可以将其权重成使得在给定水平下，它单独即足以传递阳性结果的信号。同样，可以施加权重因数，以使特定标志物的任何给定水平都不足以传递阳性结果的信号，而只有当另一个标志物也有助于分析时才传递结果的信号。
在某些实施方案中，标志物和/或标志物组被选择成表现出至少约70％的灵敏度、更优选至少约80％的灵敏度、更优选至少约85％的灵敏度、更优选至少约90％的灵敏度以及最优选至少约95％的灵敏度，与至少约70％的特异性、更优选至少约80％的特异性、更优选至少约85％的特异性、更优选至少约90％的特异性以及最优选至少约95％的特异性的组合。在特别优选实施方案中，灵敏度和特异性两者均为至少约75％、更优选至少约80％、更优选至少约85％、更优选至少约90％以及最优选至少约95％。在这种情况下，术语“约”是指给定测量值的+/-5％。
在其他实施方案中，阳性似然比、阴性似然比、机会比或风险比被用作测试的预测风险或诊断疾病的能力的度量。在阳性似然比的情况下，值为1表示在“患病”和“对照”组二者的对象中阳性结果可能性相等；值大于1表示在患病组中阳性结果可能性更大；值小于1表示在对照组中阳性结果可能性更大。在阴性似然比的情况下，值为1表示在“患病”和“对照”组二者的对象中阴性结果可能性相等；值大于1表示在测试组中阴性结果可能性更大；值小于1表示在对照组中阴性结果可能性更大。在某些优选实施方案中，标志物和/或标志物组优选被选择成表现出至少约1.5或以上或约0.67或以下、更优选至少约2或以上或约0.5或以下、更优选至少约5或以上或约0.2或以下、更优选至少约10或以上或约0.1或以下，以及最优选至少约20或以上或约0.05或以下的阳性或阴性似然比。在这种情况下，术语“约”是指给定测量值的+/-5％。
在机会比的情况下，值为1表示在“患病”和“对照”组二者的对象中阳性结果可能性相等；值大于1表示在患病组中阳性结果可能性更大。值小于1表示在对照组中阳性结果可能性更大。在某些优选实施方案中，标志物和/或标志物组优选被选择成表现出至少约2或以上或约0.5或以下、更优选至少约3或以上或约0.33或以下、更优选至少约4或以上或约0.25或以下、更优选至少约5或以上或约0.2或以下以及最优选至少约10或以上或约0.1或以下的机会比。在这种情况下，术语“约”是指给定测量值的+/-5％。
在风险比的情况下，值为1表示在“患病”和“对照”组二者中终点(例如死亡)的相对风险相等；值大于1表示在患病组中风险更高；值小于1表示在对照组中风险更高。在某些优选实施方案中，标志物和/或标志物组优选被选择成表现出至少约1.1或以上或约0.91或以下、更优选至少约1.25或以上或约0.8或以下、更优选至少约1.5或以上或约0.67或以下、更优选至少约2或以上或约0.5或以下以及最优选至少约2.5或以上或约0.4或以下的风险比。在这种情况下，术语“约”是指给定测量值的+/-5％。
专业技术人员将会理解，将诊断或预后指示物与诊断或与将来临床结果的预后风险相关联，是一种统计学分析。例如，标志物水平大于X可以传递患者与水平低于或等于X的患者相比更可能遭受不利后果的信号，正如通过统计学显著性水平所确定的。此外，标志物浓度从基线水平的改变可以反映患者的预后，并且标志物水平变化的程度可能与不利事件的严重性相关。统计学显著性通常通过比较两个或多个群体并确定置信区间和/或p值来确定。参见例如Dowdy和Wearden，《用于研究的统计学》(Statistics for Research)，JohnWiley&Sons,New York,1983。本发明的优选置信区间是90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％和99.99％，而优选的p值是0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001和0.0001。
在其他实施方案中，可以进行多次诊断或预后标志物的测定，并使用标志物的时间变化确定诊断或预后。例如，可以在初始时间测定对象样品中的标志物浓度，并在第二个时间从第二个对象样品再次测定。在这样的实施方案中，从初始时间到第二个时间标志物的增加可以指示特定的诊断或特定的预后。同样地，从初始时间到第二个时间标志物的减少可以指示特定的诊断或特定的预后。
当在本文中使用时，术语“样品”是指出于对目标对象例如患者进行诊断、预后或评估的目的而获得的体液样品。优选的测试样品包括血液、血清、血浆、脑脊液、尿液、唾液、痰液和胸膜腔积液。此外，本技术领域的专业人员将会认识到，某些测试样品在分级或纯化步骤、例如将全血分离成血清或血浆组分后，可以更容易地分析。
因此，在本发明的优选实施方案中，样品选自血液样品、血清样品、血浆样品、脑脊液样品、唾液样品和尿液样品，或上面提到的任何样品的提取物。优选情况下，样品是血液样品，最优选为血清样品或血浆样品。
当在本文中用于指称诊断和预后标记物的用途时，术语“相关联”是指将患者中标记物的存在或量，与其在已知患有给定病症或已知具有给定病症风险的人、或已知没有给定病症的人中的存在或量进行比较。正如上面讨论的，可以将患者样品中的标志物水平与已知与特定预后相关的水平进行比较。样品的标志物水平被说成已经与诊断相关联；也就是说，专业技术人员可以使用标志物水平确定患者是否具有特定类型的诊断，并做出相应应答。可替选地，样品的标志物水平可以与已知与良好结果(例如不存在疾病等)相关的标志物水平进行比较。在优选实施方案中，标志物水平的分布情况与总体概率或特定结果相关联。
本发明还涉及用于将患者分层到风险组中的方法，所述方法包含上面描述的步骤。
本发明还涉及任何上述测定方法的应用，用于预测对象发生II型糖尿病的风险。
本发明还涉及在本发明的方法中使用免疫测定法，其中使用至少一种抗和肽素抗体或其片段或重组变体来测定样品中和肽素或其分子变体的水平。优选情况下，至少一种抗和肽素抗体是单克隆抗体。
优选情况下，免疫测定法是夹心测定法，并且其中除了第一种抗和肽素抗体之外，还使用了第二种抗和肽素抗体来测定样品中和肽素或其分子变体的水平。优选情况下，至少一种所述抗体是单克隆抗体。
在本发明的范围内还包括针对血管加压素或其片段或其前体或所述前体的片段的捕获探针的体外应用，用于预测表观健康对象发生糖尿病和/或代谢综合征的风险，或用于诊断对象代谢综合征。优选情况下，捕获探针针对位于pre-pro-AVP的126-164位氨基酸中的一个或多个表位。
本发明还涉及单克隆抗体或其片段或重组变体，其与表示pre-pro-AVP的第132-147位的肽中包含的表位结合。
所述单克隆抗体的片段或重组变体显示出所述单克隆抗体与pre-pro-AVP的至少80％的亲和性。优选情况下，所述单克隆抗体的片段或重组变体显示出所述单克隆抗体与表示pre-pro-AVP的132-147位置的肽中包含的表位的至少80％的亲和性。这是本发明的优选先决条件，因为仅仅上面提到的片段或重组变体即可与单克隆抗体同样有用地提供本发明的测定方法，所述测定方法所具有的总测定不精确性，在低于2.2pmol/L的浓度下为20％CV，在高于该浓度的正常范围浓度下低于20％CV，和/或在低于9pmol/l的浓度下为10％CV，并且在高于该浓度的正常范围浓度下低于10％CV。如果至少一种抗体是单克隆抗体或其表现出所述单克隆抗体与表示pre-pro-AVP的132-147位的肽中包含的表位的至少80％的亲和性的片段或重组变体，则可以提供这种测定方法。
本发明还涉及针对精氨酸加压素激素原或其片段的捕获探针的应用，用于预测对象发生糖尿病和/或代谢综合征的风险，或用于诊断代谢综合征。优选情况下，捕获探针针对位于前血管加压素原(pre-pro-AVP)的126-164氨基酸位置中的一个或多个表位。
另一种情况下，本发明涉及任何上述测定方法或方法的应用，用于针对糖尿病、胰岛素和/或代谢综合征的预防性疗法中。
pre-pro-AVP的氨基酸序列提供在SEQ ID NO:1中(图1)。和肽素的氨基酸序列提供在SEQ ID NO:2中(图2)。和肽素可以被糖基化。Pre-pro-AVP是精氨酸加压素激素原(pro-AVP，SEQ ID NO:3，图3)及其片段(包括精氨酸加压素，后叶激素运载蛋白II和和肽素)的前体肽。除了pro-AVP之外，pre-pro-AVP还包含N-端19个氨基酸的信号序列。除非另有指明，否则本文中的所有序列指定是指pre-pro-AVP的序列。
当在本文中提到时，“测定方法”或“诊断测定方法”可以是在诊断学领域中应用的任何类型的测定方法。这样的测定方法可以基于待检测被分析物与具有一定亲和性的一种或多种捕获探针的结合。对于捕获分子与目标靶分子之间的相互作用来说，亲和常数优选大于108M-1。
在本发明的文本中，“捕获分子”是可用于结合来自样品的目标靶分子、即被分析物(即在本发明的情况下是心血管肽)的分子。因此，捕获分子必须在空间上和表面特征例如表面电荷、疏水性、亲水性、路易斯供体和/或受体是否存在等方面适当塑造，以特异性结合目标靶分子。因此，结合可以由例如捕获分子与目标靶分子之间的离子、范德华、π-π、δ-π、疏水或氢键相互作用或两种以上上面提到的相互作用的组合来介导。在本发明的情形中，捕获分子可以例如选自核酸分子、糖类分子、RNA分子、蛋白质、抗体、肽或糖蛋白。优选情况下，捕获分子是抗体，包括其与目标靶或分子具有足够亲和性的片段，并包括重组抗体或重组抗体片段，以及所述抗体或其源自于变体链的长度为至少12个氨基酸的片段的化学和/或生物化学修饰的衍生物。
优选的检测方法包括各种格式的免疫测定法，例如放射免疫测定法(RIA)、化学发光和荧光免疫测定法、酶联免疫测定法(ELISA)、基于Luminex的珠子阵列、蛋白质微阵列测定法，以及快速检测格式例如免疫层析条样试验。
测定法可以是均相或非均相测定法、竞争和非竞争性夹心测定法。在特别优选的实施方案中，测定法采用夹心测定法形式，其是非竞争性免疫测定法，其中待检测和/或定量分子与第一抗体并与第二抗体结合。第一抗体可以结合到固相例如珠子、孔或其他容器的表面、芯片或条上，并且第二抗体是例如用染料、放射性同位素或反应性或催化活性部分标记的抗体。然后通过适合的方法测量与被分析物结合的标记抗体的量。“夹心测定法”所涉及的通用组合物和步骤是已确立的，并为专业技术人员所公知。(《免疫测定手册》(TheImmunoassay Handbook)，David Wild主编，Elsevier LTD,Oxford；第三版(2005年5月)，ISBN-13:978-0080445267；Hultschig C等，Curr Opin Chem Biol.2006Feb；10(1):4-10.PMID:16376134)，在此引为参考。
在特别优选实施方案中，测定方法包含两种捕获分子，优选为都作为分散相存在于液体反应混合物中的抗体，其中第一种标记组分附着在第一种捕获分子上，其中所述第一种标记组分是基于荧光或化学发光淬灭或扩增的标记系统的一部分，并且所述标记系统的第二种标记组分附着于第二种捕获分子上，使得当两种捕获分子与被分析物结合后产生可测量信号，允许检测在包含样品的溶液中形成的夹心复合物。
在更优选情况下，所述标记系统包含稀土穴状化合物或稀土螯合物与荧光染料或化学发光染料、特别是花青类型的染料的组合。
在本发明的情形中，基于荧光的测定方法包含使用染料，所述染料可以例如选自FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、IRD-700/800、花青染料例如CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7、占吨、6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯荧光素(HEX)、TET、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOE)、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明110、BODIPY染料例如BODIPY TMR、俄勒冈绿、香豆素类例如伞形酮、苯并亚胺类例如Hoechst 33258；菲啶类例如德克萨斯红、雅吉瓦黄、Alexa Fluor、PET、溴化乙锭、吖啶类染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、卟啉染料、聚甲炔染料等。
在本发明的情形中，基于化学发光的测定方法包含根据化学发光材料的物理原理使用染料，所述原理描述在Kirk-Othmer的《化学技术百科全书》(Encyclopedia ofchemical technology)第四版，J.I.Kroschwitz执行主编，M.Howe-Grant编辑，JohnWiley&Sons,1993,vol.15,p.518-562中，在此引为参考，包括在551-562页中的引用文献。优选的化学发光染料是吖啶酯。
将其中测定方法包含单克隆和多克隆抗体的最优选实施方案与包含两种多克隆抗体的测定方法进行比较。为了比较性评估两种测定方法的精确度，通过对具有各种和肽素浓度的22个人类血清样品进行双份测量，确定了测定的总不精确性。这些数据由6位不同操作人员在12次测定操作中产生，在两个不同实验室中使用2个不同批次的试剂。得到的精确性情况显示在图4和5中。对于多克隆/多克隆测定方法来说，在2.2pmol/L下获得20％CV，在9pmol/L下获得10％CV。相反，对于单克隆/多克隆测定方法来说，在0.75pmol/L下获得20％CV，在2.9pmol/L下获得10％CV。
健康禁食女性在静息时的和肽素浓度中位数已被报道是3.2pmol/L(BhandariSS,Loke I,Davies JE,Squire IB,Struck J,Ng LL.“性别和肾功能影响健康个体中和肽素的血浆水平”(Gender and renal function influence plasma levels of copeptinin healthy individuals)，Clin Sci(Lond).2008Jul 22.[印刷版前的电子版])和3.7pmol/L(Morgenthaler NG,Struck J,Alonso C,Bergmann A.“用于测量和肽素、一种源自于血管加压素前体的稳定肽的测定方法”(Assay for the measurement of copeptin,astable peptide derived from the precursor of vasopressin)，Clin Chem.2006Jan；52(1):112-9)。在本文的分析中，在3.2pmol/L下的总测定不精确性被确定为对于多克隆/多克隆测定方法来说是15％，而对于单克隆/多克隆测定方法来说使9.5％。因此，显然单克隆/多克隆测定方法更适合于评估正常群体中的和肽素水平。两种测定方法在下面详细描述：
测定方法1(多克隆/多克隆)
采用化学发光/包被管格式的和肽素的测定按照描述进行(Morgenthaler NG,Struck J,Alonso C,Bergmann A.“用于测量和肽素、一种源自于血管加压素前体的稳定肽的测定方法”(Assay for the measurement of copeptin,a stable peptide derivedfrom the precursor of vasopressin)，Clin Chem.2006Jan；52(1):112-9)。简单来说，将管用针对表示前血管加压素原的132-147位置的肽产生的纯化的绵羊多克隆抗体进行包被(2μg/管)。针对表示前血管加压素原的149-164位置的肽产生的纯化的绵羊多克隆用MACN-吖啶-N-羟基琥珀酰亚胺-酯标记并用作示踪剂。将表示pre-pro-AVP的132-164位置的肽在正常马血清中稀释，用作标准品。免疫测定法通过将50μl样品/标准品与200μl示踪剂在包被管中在室温下温育2小时来进行。将管用1ml LUMItest清洗溶液(B.R.A.H.M.S.AG,Hennigsdorf Germany)清洗4次，并使用LB952T照度计(Berthold,Bad Wildbach Germany)测量结合的化学发光。
测定方法2(单克隆/多克隆)
产生了单克隆抗体(294/1A7)，其具有位于前血管加压素原132-147相应位置中的和肽素中的表位。抗体使用标准程序按照描述产生(Harlow E,Lane D，《抗体实验指南》(Antibodies-A Laboratory Manua)，Cold Spring Harbor Laboratory,148页ff，ISBN0-87969-314-2)。简单来说，将表示前血管加压素原的132-164位置的化学合成并在N-端延伸了附加的半胱氨酸残基的肽，使用Sulfo-MBS交联剂与BSA偶联。使用该偶联物对Balb/c小鼠进行免疫接种并加强。将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞系融合，并通过其分泌识别覆盖前血管加压素原的132-147位置的肽的抗体的能力，筛选产生抗和肽素抗体的杂交瘤细胞。将阳性筛选到的杂交瘤细胞重新克隆，产生了几个杂交瘤细胞系，它们中的一个产生单克隆抗体294/1A7，其被进一步使用。
使用单克隆抗体代替在上面描述的多克隆/多克隆测定方法中使用在固相上的多克隆抗体。所有其他测定方法组分和测定方法的执行与上面描述的多克隆/多克隆测定方法相比没有改变。
使用本发明的方法和测定法，能够确定对象发生糖尿病和/或代谢综合征的风险。在其他情况下，优选与其他临床和/或实验室参数组合，可以在对象中进行代谢综合征的诊断。从本发明的方法和测定法的结果，可以为对象选择适合的治疗或预防策略。具有发生代谢综合征和/或糖尿病的高风险的对象，被建议改变其生活方式，例如适度减少其每日卡路里摄入量、改变膳食组成和/或增加体力活动。
由本发明人所发现的对象样品中精氨酸加压素激素原或其片段的水平与其发生糖尿病和/或代谢综合征的风险之间的关联性，表明了血管加压素系统在葡萄糖体内平衡和糖尿病发展中的作用。血管加压素(及其激素原及其片段)的水平升高与糖尿病和代谢综合征相关。血管加压素的效应具体来说可能通过V1b受体(V1bR)介导。因此，本发明还涉及通过抑制V1bR受体来治疗或预防代谢综合征和/或糖尿病。本发明涉及V1bR拮抗剂在代谢综合征和/或糖尿病的治疗和/或预防中的应用。特别优选的V1bR拮抗剂可以选自抗体和小分子。可能的V1bR接抗体可以在专业技术人员已知的结合测定法中，通过例如使用放射性受体测定法鉴定其IC50值来鉴定。
附图说明
图1：pre-pro-AVP的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。
图2：CT-pro-AVP(和肽素)的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
图3：pro-AVP的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。
图4：多克隆/多克隆抗体和肽素测定方法的精确性情况。将测定间变差系数(CV[％])对和肽素浓度[pmol/L]进行作图。分别标出了使用10％和20％CV测定的和肽素浓度。
图5：单克隆/多克隆抗体和肽素测定方法的精确性情况。将测定间CV[％]对和肽素浓度[pmol/L]进行作图。分别标出了使用10％和20％CV测定的和肽素浓度。
图6：高血浆和肽素与糖尿病独立相关。将糖尿病的OR对和肽素水平的四分位数进行作图。对下列因素进行了调整：年龄、性别、TG、HDL、SBP、DBP、AHT、BMI、腰围、W/H、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、CRP、以前的CVD。
图7：高血浆和肽素是将来糖尿病的独立预测因子(已知患有糖尿病或基线时FBG>6.0mM的对象被排除)。效果不依赖于基线葡萄糖。将易发生糖尿病的OR对和肽素水平的四分位数进行作图。对下列因素进行了调整：年龄、性别、TG、HDL、SBP、DBP、AHT、BMI、腰围、W/H、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、CRP、以前的CVD、吸烟、糖尿病遗传、fP-胰岛素和fB-葡萄糖。
图8：高血浆和肽素是将来糖尿病的独立预测因子(已知患有糖尿病或基线时FBG>5.4mM的对象被排除)。效果不依赖于基线葡萄糖，并且在排除IFG后保持增强。将发生糖尿病的OR对和肽素水平的四分位数进行作图。对下列因素进行了调整：年龄、性别、TG、HDL、SBP、DBP、AHT、BMI、腰围、W/H、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、CRP、以前的CVD、吸烟、糖尿病遗传、fP-胰岛素和fB-葡萄糖。
图9：使用a)年龄、性别、BMI和DM遗传的组合以及b)向该组合中添加和肽素来预测将来糖尿病的ROC图。
图10：使用a)年龄、性别、SBP、BMI、腰围、葡萄糖、TG、HDL和DM遗传的组合以及b)向该组合中添加和肽素来预测将来糖尿病的ROC图。
图11：在非糖尿病对象(n＝4377)中禁食血糖水平(mmol/L)与使用95％置信区间下的平均值表示的增加的血浆和肽素的四分位数相关。P(线性趋势)<0.001。
图12：在非糖尿病对象(n＝4377)中禁食胰岛素葡萄糖水平(mU/L)与使用95％置信区间下的平均值表示的增加的血浆和肽素的四分位数相关。P(线性趋势)<0.001。
实施例
实施例1：临床研究
饮食与癌症研究(TheDiet and Cancer study)(MDC)是基于群体的前瞻性组群，由1991-1996年间接受调查的28,449人构成。从该组群中，随机选择6103人进行颈动脉疾病的流行病学研究，其被称为MDC心血管组群(MDC-CC)。在MDC-CC的5405个对象中获得禁食血浆样品。在这些对象中，4742个个体中的协变量完整数据可用，包括糖尿病的已知风险因子、潜在的混淆物以及血浆中的和肽素(P-和肽素)(表1)。
基线检查时的糖尿病被定义为自己报告的医生诊断、或使用抗糖尿病药物或禁食血糖(FBG)≥6.1mmol/L。所有血浆和血液分析在过夜禁食的样品中进行。FBG通过己糖激酶-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶方法在全血中测量。LDL胆固醇按照Friedewald的公式计算。在储存于-80℃的禁食血浆样品中，我们使用上面描述的测定方法2(单克隆/多克隆)测量和肽素。C-反应蛋白(CRP)通过高灵敏度测定法测量(Tina-quant CRP,Roche Diagnostics,Basel,Switzerland)。半胱氨酸蛋白酶抑制剂C使用粒子增强的免疫浊度测定法(N LatexCystatin C,Dade Behring,IL)测量。
在仰卧位休息10分钟后使用水银柱血压计测量血压。吸烟由自己提供的调查问卷引出，其中当前吸烟被定义为在过去一年中的任何吸烟。以前的心血管疾病被定义为在基线检查之前存在心肌梗塞或中风。糖尿病遗传由调查问卷引出，并被定义为在至少一个一级亲属中具有已知糖尿病。
在基线检查后直到2007年6月的新发糖尿病通过三个登记中心查定：(1)位于大学医院临床化学科的HbAlc登记中心(MHR)，其分析并分类从1990年及以后在大地区的学术和非学术护理中获得的所有HbA1c样品。在MHR中，如果个体使用瑞典Mono-S标准化系统时具有至少两次≥6.0％的HbA1c记录，相当于根据美国国家糖化血红蛋白标准化项目(US National Glycohemoglobin Standardization Program)(NGSP)的7.0％，或至少三次≥5.5％的HbA1c记录(相当于根据NGSP的6.5％)，则他们被定义为患有糖尿病。(2)瑞典国家糖尿病登记中心(The Swedish National Diabetes Register)(NDR)，其始于1996年，并在2007年覆盖瑞典所有糖尿病患者的约50％；(3)Scania地区的地方登记中心，是该地区的主要城市(糖尿病2000登记中心)(Lindholm E,Eur JEpidemiol 2001:17:983-989)，其始于2000年，并在2001年覆盖Scania地区所有糖尿病患者的约25％。
在基线检查前没有出现在三个登记中心的任一个中，在MDC-CC中基线检查时按照我们的判据没有糖尿病(即没有自己报告的医生诊断的糖尿病史，没有抗糖尿病治疗，基线检查时FBG<6.0mmol/L)，并且在MDC-CC中基线检查后直到2007年6月的任何时间作为糖尿病患者登记在NDR或糖尿病2000登记中心中，或满足我们在MHR中基于HbA1c的糖尿病判据的对象，被分类为新发糖尿病人。研究方案得到Lund大学伦理委员会的批准。所有参加者提供了书面知情同意书。
统计学
对于所有计算使用了SPSS统计学软件(14.0版)。连续变量中的整组式差异，如果正态分布使用student's t-检验进行检验并报告为平均值±SD，而如果不是正态分布则使用Mann-Whitney检验进行检验，并报告为中位数和四分位数间范围。二歧变量中的差异使用卡方检验进行检验。在非糖尿病对象中禁食葡萄糖和胰岛素的线性趋势高于P-和肽素四分位数的P-值，使用转换为自然对数的禁食胰岛素浓度进行线性回归进行评估。我们使用了原始和多变量调整过的逻辑回归来测试在整个组群中(n＝4742)，P-和肽素四分位数的增加(Q1和肽素-Q4和肽素、Q1和肽素是参比类别)是否与基线时的糖尿病相关。在基线时没有糖尿病的对象中(n＝4377)，原始和多变量逻辑回归被用于测试P-和肽素四分位数的增加(Q1和肽素-Q4和肽素、Q1和肽素是参比类别)是否与被定义为属于禁食胰岛素的最高四分位数的胰岛素、以及与新发糖尿病相关。最后，在禁食葡萄糖没有受损的对象中(禁食血浆葡萄糖6.1mmol/L，对应于FBG<5.5mmol/L)(n＝3702)，检验了P-和肽素四分位数的增加与新发糖尿病风险之间的关联。来自逻辑回归分析的数据被表示成机会比(OR)和95％置信区间(CI)。双边P-值<0.05被认为是统计学显著的。
为了评估P-和肽素在预测新发糖尿病中的灵敏度和特异性高于经典的糖尿病预测因子组，我们使用个人模型(年龄、性别、BMI和糖尿病遗传)和临床模型(个人模型+收缩压、甘油三酯、HDL、腰围和FBG)，在两种模型的每个中加入和不加入P-和肽素，对受试者工作特征(ROC)曲线下的面积进行了比较。
结果
在基线检查时患有糖尿病的患者(n＝365)中，只有29％报告了医生诊断的糖尿病或治疗史，而大多数(71％)根据基线检查时FBG≥6.1mmol/L被分类为患有糖尿病。在患有糖尿病的患者中，与非糖尿病对象相比P-和肽素较高(表1)。在群体的非糖尿病人部分中，FBG随着和肽素而增加(图11)。在原始模型和对除了禁食血浆胰岛素浓度之外在糖尿病患者与对照之间的单变量比较中显著不同的所有基线特征(表1)进行调整后的模型(模型1调整)两者中，随着和肽素四分位数的增加，糖尿病的OR逐渐增加(表2)(图6)。在非糖尿病对象中，胰岛素的血浆浓度随着P-和肽素的四分位数逐渐增加(图12)，并且在原始分析和包括模型1的协变量和FBG的扩展的模型1调整后两者中，胰岛素抗性的OR(在群体的非糖尿病人部分种禁食血浆胰岛素的最高四分位数)随着P-和肽素增加(表2)。在基线时没有糖尿病的对象中，四分位数边界处的和肽素浓度如下：Q1/Q2：3.13pmol/L，Q2/Q3：5.05pmol/L，Q3/Q4：7.94pmol/L。
在跟踪中，在基线时没有糖尿病的对象中(n＝4377)，174位对象发展出新发糖尿病，在基线时没有受损的禁食葡萄糖的对象(n＝3702)中，79位对象发展出新发糖尿病(表3)。在发展出新发糖尿病的对象中，与不属于基线时无糖尿病对象和基线时无受损禁食葡萄糖对象两者的对象相比，基线时的P-和肽素明显更高(表3)。在基线时无糖尿病对象(图7)和无受损禁食葡萄糖对象(图8)两者中，在原始分析中以及对模型1进行协变量和禁食胰岛素、FBG、吸烟、糖尿病遗传和LDL进行调整后，发生新发糖尿病的概率随着P-和肽素四分位数而增加(表4)。在基线时无糖尿病对象中，当将和肽素添加到糖尿病预测的个人模型和临床模型中时，用于预测将来糖尿病的受试者工作特征(ROC)曲线下面积分别从69.4增加至71.0％(P＝0.08)和从83.2增加至84.1％(P＝0.007)。在基线时无受损禁食葡萄糖的对象中，当将和肽素添加到用于糖尿病预测的个人模型和临床模型时，用于预测将来糖尿病的ROC曲线下面积分别从66.3增加至71.3％(P＝0.03)(图9)和从78.3增加至80.5％(P＝0.04)(图10)。
讨论
这里，我们在基于大型群体的组群中证实，在糖尿病患者中P-和肽素显著升高，并且在非糖尿病对象中、即在具有肯定不影响重量克分子渗透压浓度的FBG水平的对象中，P-和肽素随着FBG线性增加。在非糖尿病对象中，在P-和肽素与胰岛素抗性(通过禁食血浆胰岛素所估算的)之间存在强的分类排列关系，并且这些关系不依赖于大量混淆性因子，包括FBG。此外，在跟踪过程中，基线时的P-和肽素是发生新发糖尿病的强的风险因子。重要的是，这种关系不依赖于基线时广范围的公知糖尿病风险因子，包括FBG和禁食胰岛素，后两者与P-和肽素具有强的分类排列关系。当组群限于无受损禁食葡萄糖的对象时，P-和肽素与新发糖尿病之间的关系被加强，尽管事实上几乎一半的新发糖尿病病例发生在基线时具有受损禁食葡萄糖的对象中。正如所预计的，FBG是新发糖尿病的最强风险因子。在完全调整过的模型中，基线时FBG每1mmol/L的增加使将来糖尿病的风险增加，其OR为11.4(95％CI7.4-17.5)(表4)。牢记这一点，令人印象深刻的是在无受损禁食葡萄糖的对象中，在完全调整基线协变量包括FBG后，和肽素的最高比最低四分位数与新发糖尿病的3.6的OR相关(表4)。重要的是，在无受损禁食葡萄糖的对象中，当向经典的糖尿病风险因子模型添加P-和肽素时，存在ROC曲线下面积的2.2-4.0％的显著增加，表明P-和肽素改进了糖尿病的个体风险预测的灵敏度和特异性。在包含具有受损禁食葡萄糖的对象的较大样品中，P-和肽素对ROC曲线下面积的增加不太显著。在包含具有较高FBG水平的对象(即具有受损的禁食葡萄糖的对象)的分析中ROC曲线下面积的较少增加，可能是由于FBG在FBG水平接近6.1mmol/L的诊断限度时是更有力的糖尿病预测因子，而对糖尿病没有诊断性的标志物例如P-和肽素，可能在更早的糖尿病前状态中更好地传递糖尿病易感性的信号。重要的是，在具有正常FBG的对象中，新的风险标志物作为将来糖尿病风险的筛选工具更加重要，因为由于高FBG的公知的强糖尿病预测价值，具有受损禁食葡萄糖的对象无论如何通常受到旨在预测糖尿病的医疗关注。因此，我们的发现表明，向已建立的用于预测糖尿病的筛选工具添加P-和肽素，可能具有临床价值。我们没有关于新发糖尿病的亚型的数据，但是，由于在我们的群体中非糖尿病人部分的平均年龄为57岁以及P-和肽素与胰岛素抗性之间的强的分类排列关系，我们推测P-和肽素的升高指示2型糖尿病而不是1型糖尿病的风险。
除了与糖尿病预测有关联之外，我们的发现表明了AVP系统在糖尿病的病理生理学中的作用，并可能用于开发新的抗糖尿病治疗方案。动物研究已经显示，缺少V1aR(V1aR-/-)的小鼠显示出升高的AVP水平、葡萄糖不耐受性和胰岛素抗性，而缺少V1bR(V1bR-/-)的小鼠获得相反表型，具有较低的FBG和升高的胰岛素敏感性。基于这些动物数据和我们自己发现的高P-和肽素与升高的FBG、胰岛素抗性和将来糖尿病的升高的风险之间的关联性，可以推断，作为V1aR水平上AVP抗性或其他情况的结果而升高的AVP，通过刺激V1bR而造成胰岛素抗性和糖尿病。事实上，V2R的药理学阻断这种通过对下丘脑-神经垂体轴的负反馈增加AVP分泌的有力刺激，与患有低钠血症的患者中在用托伐普坦进行的30天治疗期间高血糖事件增加5倍有关。因此，AVP的升高，无论其下潜伏的机制如何，都可能通过刺激V1bR造成葡萄糖体内平衡受损。这些发现为在人类中研究AVP系统的药理学操作与葡萄糖代谢的关系提供了正当理由。
在MDC-CC中新发糖尿病病例的数量可能似乎低于预期。有三个重要原因最可能解释这种现象。(1)在MDC研究中的参与率只有40％，结果，MDC群体与背景群体相比较为健康并包括不成比例的更多女性(Manjer 2001)。结果，我们描述的P-和肽素与新发糖尿病之间的关系可能被低估了。(2)我们在三个登记中心观察到的糖尿病发病率是基于人们主动寻求健康护理这一先决条件而不是基于葡萄糖水平的群体筛选，导致与通过测量FBG进行的常规糖尿病筛查研究中所观察到的相比发病率较低。此外，与我们对新发糖尿病的定义相反，MDC-CC在基线检查时的糖尿病定义包括测量FBG。事实上，在被定义患有糖尿病的对象中，71％没有报告糖尿病或抗糖尿病治疗史，而是仅仅根据FBG进行诊断。排除这些在基线检查前没有意识到他们患有糖尿病的大量糖尿病患者，进一步显著降低了跟踪期间新发糖尿病的发病率。(3)尽管存在上面讨论的问题，但我们的研究可能漏掉了许多事实上在卫生护理系统中被诊断具有糖尿病的新发病例。MHR记录从1990年及以后在大地区的所有HbA1c值，但是，我们错过了在大地区被诊断为糖尿病但是没有测量HbA1c或如果HbA1c仅仅测量了一次或如果在重复的情形中它只或多或少升高的病例。作为在MDC-CC基线检查后搬出大地区的结果而不能在MHR中检测到的新发糖尿病，将有相当大的机会被全国范围的NDR和/或地区性糖尿病2000登记中心检测到，特别是被NDR检测到，因为该登记中心据估计覆盖了2007年瑞典所有糖尿病患者的50％。然而，NDR和糖尿病2000登记中心的覆盖率仍是不完全的。出于这些原因，我们将未知数量的事实上在跟踪期间发生糖尿病的对象分类为非糖尿病人。另一方面，由于在MHR用于新发糖尿病的严格的HbA1c判据以及NDR和糖尿病2000登记中心的已被证明的有效性，我们对被我们分类为新发糖尿病病例的对象的终点的有效性充满信心。基于登记中心的新发糖尿病诊断的有效性得到下述事实的进一步支持，即在这些对象中，与根据三个登记中心没有发生糖尿病的对象相比，在MDC-CC基线时大多数公知的糖尿病风险因子显著升高(表3)。重要的是，当研究群体被限于在基线时无受损禁食葡萄糖的对象时，这些差异同样确定，这排除了我们关于已确定的糖尿病风险因子和P-和肽素与新发糖尿病的关联性的发现，仅仅由在MDC-CC基线检查时几乎具有糖尿病FBG的对象所造成这种可能性。
总而言之，P-和肽素独立于大范围的已确定的糖尿病风险因子包括禁食葡萄糖和胰岛素水平，来预测糖尿病。我们的发现表明了AVP系统在糖尿病发生中的作用，并可能与风险评估和新的抗糖尿病药物疗法有关联。
除非另有指明，否则连续变量提供为平均值±SD
*中位数(四分位数间范围)
AHT，抗高血压治疗；BMI，体重指数；FBG，禁食血糖；以前的CVD，在基线检查之前出现的心血管疾病。
*在整个组群(n＝4742)中糖尿病普遍性(n＝365)的分析
在非糖尿病对象(n＝4377)中高胰岛素血症的分析(非糖尿病对象中禁食血浆胰岛素浓度的最高四分位数)
对年龄、性别、HDL、甘油三酯、血压、抗高血压治疗、体重指数、腰围、腰臀比、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、CRP和普遍的心血管疾病进行调整(模型1)
§对模型1和FBG进行调整
除非另有指明，否则连续变量提供为平均值±SD
*中位数(四分位数间范围)
AHT，抗高血压治疗；BMI，体重指数；FBG，禁食血糖；以前的CVD，在基线检查之前出现的心血管疾病。
*在基线时没有糖尿病的对象(n＝4377)中在跟踪期间发生糖尿病的对象(n＝174)
在基线时没有受损禁食葡萄糖的对象(n＝3702)中在跟踪期间发生糖尿病的对象(n＝79)
对年龄、性别、HDL、甘油三酯、血压、抗高血压治疗、体重指数、腰围、腰臀比、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、CRP和普遍的心血管疾病、吸烟、糖尿病史、LDL、FBG和禁食胰岛素进行调整。

Claims (21)

1.和肽素在制备通过包括下列步骤的方法用于预测对象在将来发生II型糖尿病的风险，或用于鉴定具有在将来发生II型糖尿病的高风险的对象的试剂中的应用，其中所述对象是非糖尿病人并且是表观健康的：
a.提供来自所述对象的样品，
b.测定所述样品中和肽素的水平，
c.使用和肽素的所述水平预测对象在将来发生II型糖尿病的可能性，或用于从其推断出所述对象在将来发生II型糖尿病的风险。
2.权利要求1的应用，其中所述对象是禁食血糖低于6.1mmol/L但高于5.4mmol/L的非糖尿病人。
3.权利要求1的应用，其中所述对象是禁食血糖低于5.4mmol/L的对象。
4.权利要求1-3任一项的应用，其中对象在将来发生II型糖尿病的风险的预测，通过附加地测定并使用至少一种实验室参数或其他标志物的水平来改进，所述其他标志物选自：禁食血液或血浆葡萄糖，甘油三酯，HDL胆固醇或其亚级分，LDL胆固醇或其亚级分，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，胰岛素，CRP，A型和B型利尿钠肽以及ANP、proANP、NT-proANP、MR-proANP、BNP、proBNP、NT-proBNP，GDF15，ST2，降钙素原，肾上腺髓质素原及ADM、PAMP、MR-proADM、CT-proADM，内皮素原-1及CT-proET-1、NT-proET-1、大内皮素-1和内皮素-1。
5.权利要求1-3任一项的应用，其中附加地测定选自下列的至少一种临床参数：年龄、性别、收缩压、舒张压、抗高血压治疗、体重指数、腰围、腰臀比、当前吸烟、糖尿病遗传性和以前的心血管疾病。
6.权利要求1-3任一项的应用，其中和肽素的水平单独地或与其他预后有用的实验室或临床参数组合，通过选自下列可选方案的方法，用于预测对象在将来发生II型糖尿病的风险：
-与表观健康对象群体中全部预定样品中的和肽素的水平的中位数进行比较，
-与表观健康对象群体中全部预定样品中的和肽素的水平的分位数进行比较，
-根据Cox比例风险分析或使用风险指数计算进行计算。
7.权利要求6的应用，其中所述风险指数计算是净重新分类指数计算或综合鉴别指数计算。
8.权利要求1-3任一项的应用，其中样品选自血液样品、血清样品、血浆样品、脑脊液样品、唾液样品和尿液样品，或任何上面提到的样品的提取物。
9.权利要求1-3任一项的应用，其中通过诊断测定方法测定和肽素的水平。
10.权利要求1-3任一项的应用，其中通过免疫测定法测定和肽素的水平。
11.和肽素在制备用于预测对象在将来发生II型糖尿病的风险的试剂中的应用，其中和肽素的测定方法所具有的总测定不精确性，在低于2.2pmol/L的浓度下为20％CV，并且在高于2.2pmol/L的正常范围浓度下低于20％CV。
12.和肽素在制备用于预测对象在将来发生II型糖尿病的风险的试剂中的应用，其中和肽素的测定方法所具有的总测定不精确性，在低于9pmol/l的浓度下为10％CV，并且在高于9pmol/l的正常范围浓度下低于10％CV。
13.和肽素在制备用于预测对象在将来发生II型糖尿病的风险的试剂中的应用，其中和肽素的测定方法在健康禁食女性白人群体静息时的血清或血浆中测定到的中位数和肽素浓度下，具有最大12％的总测定不精确性。
14.权利要求11-13任一项的应用，其中测定方法包含两种抗和肽素抗体，其中至少一种抗体是单克隆抗体或其片段或重组变体。
15.权利要求14的应用，其中测定方法包含两种抗和肽素抗体，其中至少一种抗体是单克隆抗体或其片段或重组变体，其与表示前血管加压素原的第132-147位的肽中包含的表位结合。
16.和肽素在制备用于预测对象在将来发生II型糖尿病的风险的试剂中的应用，其中和肽素的测定方法包含两种抗和肽素抗体，其中至少一种抗体是单克隆抗体或其片段或重组变体。
17.权利要求16的应用，其中测定方法包含两种抗和肽素抗体，其中至少一种抗体是单克隆抗体或其片段或重组变体，其与表示前血管加压素原的第132-147位的肽中包含的表位结合。
18.权利要求15-17任一项的应用，其中测定方法包含单克隆抗和肽素抗体或其片段或重组变体以及多克隆抗和肽素抗体或其片段变体。
19.免疫测定法用于权利要求1到10任一项的应用的应用，其中使用至少一种抗和肽素抗体或其片段或重组变体来测定样品中和肽素的水平。
20.权利要求19的免疫测定法的应用，其中免疫测定法是夹心测定法，并且其中使用第二种抗体来测定样品中和肽素的水平。
21.针对和肽素的捕获探针在制备用于预测表观健康对象在将来发生II型糖尿病的风险的试剂中的应用。
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