ES2645688T3

ES2645688T3 - Prohormona arginina-vasopresina como biomarcador predictivo de la diabetes

Info

Publication number: ES2645688T3
Application number: ES09744978.9T
Authority: ES
Inventors: Joachim Struck; Andreas Bergmann; Olle Melander; Christopher Newton-Cheh; Thomas J. Wang
Original assignee: BRAHMS GmbH; General Hospital Corp
Current assignee: BRAHMS GmbH; General Hospital Corp
Priority date: 2008-10-31
Filing date: 2009-10-29
Publication date: 2017-12-07
Anticipated expiration: 2029-10-29
Also published as: CN102317788A; US20150293127A1; DK3199951T3; EP3199951B1; EP2356463A1; JP2012507020A; CN106153943B; US9116153B2; CN106153943A; JP6055005B2; JP5785086B2; ES2772930T3; JP2015135338A; EP2356463B1; US9952229B2; EP3199951A1; CN103713137A; WO2010049179A1; US20110318766A1

Abstract

Método para predecir el riesgo de que un sujeto desarrolle diabetes mellitus de tipo II o para identificar un sujeto que tenga mayor riesgo de contraer diabetes mellitus de tipo II, el cual comprende las siguientes etapas: a. preparar una muestra tomada de dicho sujeto, b. determinar el nivel de copeptina en dicha muestra, c. utilizar dicho nivel de copeptina para predecir la probabilidad de que el sujeto desarrolle diabetes mellitus de tipo II, o para inferir de él un riesgo de que el sujeto desarrolle diabetes mellitus de tipo II, y compararlo con la mediana del nivel de copeptina en un conjunto de muestras predeterminadas de una población de sujetos aparentemente sanos.

Description

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En algunas formas de ejecución los valores umbral propios de uno o más marcadores de un panel no son fiables para determinar si un perfil de niveles de marcadores obtenidos de un sujeto son indicativos de un diagnóstico/ pronóstico concreto. La presente invención emplea más bien una evaluación del “perfil” de un panel de marcadores como un todo unitario. De hecho un patrón “único” y particular de cambios actúa en un panel de este tipo como un indicador específico de diagnosis o pronóstico. Como se ha referido aquí, este patrón de cambios se puede obtener de una sola muestra o de cambios temporales en uno o más componentes del panel (o de un valor de respuesta del panel). Panel se refiere aquí a una serie de marcadores.

Tal como se describe más adelante, un valor de respuesta del panel se determina preferiblemente representando las curvas CRO de sensibilidad de un panel particular de marcadores frente a 1-(especificidad) del panel para diversos valores umbral. En estos métodos se considera que un perfil de mediciones de marcadores de un sujeto proporciona en conjunto una probabilidad global (expresada como calificación numérica o riesgo porcentual) de un diagnóstico o pronóstico. En estas formas de ejecución un incremento en un determinado subconjunto de marcadores puede ser suficiente para indicar un diagnóstico/pronóstico particular de un paciente, mientras que un incremento en un distinto subconjunto de marcadores puede ser suficiente para indicar el mismo o un diagnóstico/pronóstico diferente en otro paciente. También pueden aplicarse factores de ponderación a uno o más marcadores de un panel; así por ejemplo, cuando un marcador es especialmente de gran utilidad para identificar un diagnóstico/pronóstico particular, se puede ponderar de forma que a un nivel determinado sea suficiente para señalar un resultado positivo. Asimismo un factor de ponderación puede poner de manifiesto que ningún nivel de un marcador particular sea suficiente para señalar un resultado positivo y en cambio solo indique un resultado cuando haya otro marcador que contribuya al análisis.

En algunas formas de ejecución los marcadores y/o los paneles de marcadores se eligen para mostrar al menos un 70% aproximadamente de sensibilidad, con preferencia al menos un 80% aproximadamente de sensibilidad, con mayor preferencia al menos un 85% aproximadamente de sensibilidad, con aun mayor preferencia al menos un 90% aproximadamente de sensibilidad y sobre todo al menos un 95% aproximadamente de sensibilidad, combinada con al menos un 70% aproximadamente de especificidad, preferiblemente con al menos un 80% aproximadamente de especificidad, aún más preferiblemente con al menos un 85% aproximadamente de especificidad, incluso todavía más preferiblemente con al menos un 90% aproximadamente de especificidad y sobre todo con al menos un 95% aproximadamente de especificidad. En este contexto el término “aproximadamente” se refiere a ± 5% de una medición determinada.

En otras formas de ejecución se emplea una tasa de probabilidad positiva, una tasa de probabilidad negativa, un índice de probabilidad o un índice de riesgo como medida de la capacidad de un ensayo para predecir el riesgo o diagnosticar una enfermedad. En el caso de una tasa de probabilidad positiva un valor de 1 indica que un resultado positivo es igualmente posible entre los sujetos de los grupos tanto de “enfermos” como de “control”, un valor mayor que 1 indica que un resultado positivo es más probable en el grupo de enfermos y un valor menor que 1 indica que un resultado positivo es más probable en el grupo de control. En el caso de una tasa de probabilidad negativa un valor de 1 indica que un resultado negativo es igualmente posible entre los sujetos de los grupos tanto de “enfermos” como de “control”, un valor mayor que 1 indica que un resultado negativo es más probable en el grupo de ensayo y un valor menor que 1 indica que un resultado negativo es más probable en el grupo de control. En algunas formas de ejecución preferidas los marcadores y/o los paneles de marcadores se eligen preferiblemente para mostrar una tasa de probabilidad positiva o negativa de al menos 1,5 aproximadamente o más o de 0,67 aproximadamente o menos, con mayor preferencia de al menos 2 aproximadamente o más o de 0,5 aproximadamente o menos, con aún mayor preferencia de al menos 5 aproximadamente o más o de 0,2 aproximadamente o menos, con incluso mayor preferencia de al menos 10 aproximadamente o más o de 0,1 aproximadamente o menos y sobre todo de al menos 20 aproximadamente o más o de 0,05 aproximadamente o menos. En este contexto el término “aproximadamente” se refiere a ± 5% de una medición determinada.

En el caso de un índice de probabilidad un valor de 1 indica que un resultado positivo es igualmente posible entre los sujetos de los grupos tanto de “enfermos” como de “control”, un valor mayor que 1 indica que un resultado positivo es más probable en el grupo de enfermos y un valor menor que 1 indica que un resultado positivo es más probable en el grupo de control. En algunas formas de ejecución preferidas los marcadores y/o los paneles de marcadores se seleccionan preferiblemente de manera que muestren un índice de probabilidad de al menos 2 aproximadamente o más o de 0,5 aproximadamente o menos, con mayor preferencia de al menos 3 aproximadamente o más o de 0,33 aproximadamente o menos, con todavía mayor preferencia de al menos 4 aproximadamente o más o de 0,25 aproximadamente o menos, con incluso mayor preferencia de al menos 5 aproximadamente o más o de 0,2 aproximadamente o menos y sobre todo de al menos 10 aproximadamente o más o de 0,1 aproximadamente o menos. En este contexto el término “aproximadamente” se refiere a ± 5% de una medición determinada.

En el caso de un índice de riesgo un valor de 1 indica que el riesgo relativo de un punto final (p.ej. muerte) es igual tanto en el grupo de “enfermos” como en el de “control”, un valor mayor que 1 indica que el riesgo es mayor en el grupo de enfermos y un valor menor que 1 indica que el riesgo es mayor en el grupo de control. En algunas formas de ejecución preferidas los marcadores y/o los paneles de marcadores se seleccionan preferiblemente de manera que muestren un riesgo de al menos 1,1 aproximadamente o más o de 0,91 aproximadamente o menos, con mayor preferencia de al menos 1,25 aproximadamente o más o de 0,8 aproximadamente o menos, con todavía mayor preferencia de al menos 1,5 aproximadamente o más o de 0,67 aproximadamente o menos, con incluso mayor

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preferencia de al menos 2 aproximadamente o más o de 0,5 aproximadamente o menos y sobre todo de al menos 2,5 aproximadamente o más o de 0,4 aproximadamente o menos. En este contexto el término “aproximadamente” se refiere a ± 5% de una medición determinada.

El especialista entenderá que la asociación de un indicador diagnóstico o pronosticador a un riesgo de diagnóstico o pronóstico de un futuro resultado clínico es un análisis estadístico. Por ejemplo, un nivel de marcador superior a X puede indicar que un paciente tiene mayor probabilidad de sufrir un resultado adverso que los pacientes con un nivel inferior o igual a X, determinada por un nivel de significancia estadística. Además un cambio en la concentración del marcador a partir de los niveles de la línea base puede reflejar el pronóstico del paciente y el grado de variación del nivel del marcador se puede relacionar con la gravedad de los resultados adversos. La significancia estadística suele determinarse comparando dos o más poblaciones y calculando un intervalo de confianza y/o un valor p. Véase p.ej. Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York, 1983. Los intervalos de confianza preferidos de la presente invención son 90%, 95%, 97.5%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% y 99.99%, mientras que los valores p preferidos son 0,1, 0,05, 0,025, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001 y 0,0001.

En otras formas adicionales de ejecución se pueden hacer determinaciones múltiples de marcadores diagnósticos o pronosticadores y un cambio temporal en el marcador puede usarse para determinar un diagnóstico o un pronóstico. Por ejemplo, una concentración del marcador en una muestra de un sujeto se puede determinar en un momento inicial y luego en un segundo momento a partir de una segunda muestra del sujeto. En tales formas de ejecución un incremento del marcador entre el momento inicial y el segundo momento puede ser indicativo de un diagnóstico o de un pronóstico particular. Asimismo, una disminución del marcador entre el momento inicial y el segundo momento puede ser indicativa de un diagnóstico o de un pronóstico particular.

Tal como se usa aquí, el término “muestra” se refiere a una muestra de un fluido corporal obtenido para diagnosticar, pronosticar o evaluar un sujeto de interés, tal como un paciente. Las muestras de ensayo preferidas incluyen sangre, suero, plasma, fluido cerebroespinal, orina, saliva, esputo y efusiones pleurales. Igualmente un especialista en la materia entenderá que algunas muestras se analizarían más fácilmente después de un proceso de fraccionamiento

o purificación, como por ejemplo la separación de la sangre entera en sus componentes de suero o plasma.

Así, en una forma de ejecución preferida de la presente invención la muestra se escoge del grupo constituido por muestras de sangre, de suero, de plasma, de fluido cerebroespinal, de saliva y de orina o un extracto de cualquiera de dichas muestras. La muestra es preferiblemente de sangre y con mayor preferencia de suero o de plasma.

Tal como se emplea aquí, el término “correlacionar” respecto al uso de marcadores diagnósticos y pronosticadores se refiere a comparar la presencia o cantidad del o de los marcadores en un paciente con su presencia o cantidad en personas conocidas por sufrir o tener riesgo de padecer una enfermedad determinada, o en personas conocidas por estar libres de una enfermedad determinada. Como se ha expuesto arriba, un nivel de marcador en una muestra de un paciente se puede comparar con un nivel conocido para relacionarlo con un diagnóstico específico. Se dice que el nivel de marcador en la muestra ha sido correlacionado con un diagnóstico; es decir, el especialista puede utilizar el nivel del marcador para determinar si el paciente sufre de un tipo específico de diagnosis y responder en consecuencia. Como alternativa, el nivel del marcador se puede comparar con un nivel de marcador conocido por estar asociado a un buen resultado (p.ej. ausencia de enfermedad, etc.). En formas de ejecución preferidas un perfil de niveles de marcadores se correlaciona con una probabilidad global de un resultado particular.

La presente invención también se refiere a un método para clasificar un paciente en grupos de riesgo, que consta de las etapas anteriormente descritas.

La presente invención también se refiere al uso de cualquiera de los ensayos arriba descritos para predecir el riesgo que tiene un sujeto de desarrollar diabetes mellitus de tipo II.

La presente invención se refiere además al uso de un ensayo inmunológico para un método de la presente invención en el cual se emplea al menos un anticuerpo anti-copeptina o un fragmento o variante recombinante del mismo para determinar el nivel de copeptina o de variantes moleculares de ella en una muestra. El anticuerpo anti-copeptina que se usa como mínimo es preferiblemente un anticuerpo monoclonal.

El ensayo inmunológico es preferiblemente un ensayo de tipo sándwich y en él, además del primer anticuerpo anticopeptina, se emplea un segundo anticuerpo anti-copeptina para determinar el nivel de copeptina o de variantes moleculares de la misma en una muestra. Al menos uno de dichos anticuerpos es preferiblemente un anticuerpo monoclonal.

También pertenece al ámbito de la presente invención el empleo in vitro de una sonda de captura dirigida contra la vasopresina o fragmentos de ella o sus precursores o fragmentos de ellos para predecir el riesgo de que un sujeto aparentemente sano contraiga diabetes mellitus y/o síndrome metabólico o para diagnosticar el síndrome metabólico en un sujeto. Las sondas de captura están dirigidas preferiblemente contra uno o más epítopos localizados en las posiciones 126-164 de aminoácidos de la pre-pro-AVP.

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La presente invención también se refiere a un anticuerpo monoclonal o a un fragmento o variante recombinante del mismo que se une a un epítopo incluido en un péptido que representa las posiciones 132-147 de la pre-pro-AVP.

Los fragmentos o variantes recombinantes de dicho anticuerpo monoclonal despliegan al menos un 80% de la afinidad de dicho anticuerpo monoclonal por la pre-pro-AVP. Los fragmentos o variantes recombinantes de dicho anticuerpo monoclonal muestran preferiblemente, al menos, un 80% de la afinidad de dicho anticuerpo monoclonal por el epítopo incluido en un péptido que representa las posiciones 132-147 de la pre-pro-AVP, lo cual constituye un requisito previo para la presente invención, pues solo los fragmentos y variantes recombinantes antedichos son tan útiles como el anticuerpo monoclonal para facilitar un ensayo según la presente invención, que tiene una imprecisión total del 20% de CV a una concentración inferior a 2,2 pmol/l y menor del 20% de CV a concentraciones superiores a esta, incluidas en un intervalo normal, y/o del 10% de CV a una concentración inferior a 9 pmol/l y menor del 10% de CV a concentraciones superiores a esta, incluidas en un intervalo normal. Este ensayo es factible si al menos uno de los anticuerpos es un anticuerpo monoclonal o un fragmento o variante recombinante del mismo que despliegue al menos un 80% de la afinidad de dicho anticuerpo monoclonal por el epítopo incluido en un péptido que representa las posiciones 132-147 de la pre-pro-AVP.

La presente invención también se refiere al uso de una sonda de captura dirigida contra la vasopresina o fragmentos de ella para predecir el riesgo de que un sujeto contraiga diabetes mellitus y/o síndrome metabólico o diagnosticar el síndrome metabólico. Las sondas de captura están dirigidas preferiblemente contra uno o más epítopos localizados en las posiciones 126-164 de aminoácidos de la pre-pro-vasopresina (pre-pro-AVP).

En otro aspecto la presente invención se refiere al uso de cualquiera de los ensayos o métodos arriba descritos en una terapia profiláctica contra la diabetes mellitus, la resistencia a la insulina y/o el síndrome metabólico.

La secuencia de aminoácidos de la pre-pro-AVP está representada en SEQ ID NO:1 (figura 1). La secuencia de aminoácidos de la copeptina está representada en SEQ ID NO:2 (figura 2). La copeptina puede estar glicosilada. La pre-pro-AVP es el péptido precursor de la pro-hormona arginina-vasopresina (pro-AVP, SEQ ID NO:3, fig. 3) y de sus fragmentos (incluyendo arginina-vasopresina, neurofisina II y copeptina). Además de pro-AVP la pre-pro-AVP comprende una secuencia señalizadora N-terminal de 19 aminoácidos. A no ser que se indique lo contrario, todas las secuencias aquí descritas hacen referencia a la secuencia de la pre-pro-AVP.

Tal como se menciona aquí, un “ensayo” o “ensayo diagnóstico” puede ser de cualquier tipo empleado en el campo de la diagnosis. Dicho ensayo puede estar basado en la unión del analito que debe detectarse a una o más sondas de captura con cierta afinidad. En lo referente a la interacción entre las moléculas de captura y las moléculas diana o moléculas de interés, la constante de afinidad es preferiblemente mayor de 108 M-1 .

En el contexto de la presente invención las “moléculas de captura” son moléculas que se pueden utilizar para fijar moléculas diana o moléculas de interés, es decir analitos (o sea, en el contexto de la presente invención el péptido o los péptidos cardiovasculares) de una muestra. Por tanto las moléculas de captura deben tener la forma adecuada, tanto espacialmente como en cuanto a las características de su superficie, tales como carga superficial, hidrofobia, hidrofilia, presencia o ausencia de donantes y/o aceptores de Lewis, para fijar específicamente las moléculas diana o moléculas de interés. En este caso, por ejemplo, la unión puede estar mediada por interacciones de tipo iónico, vander-Waals, pi-pi, sigma-pi, hidrófobas o enlaces de hidrógeno, o una combinación de dos o más dichas interacciones entre las moléculas de captura y las moléculas diana o moléculas de interés. En el contexto de la presente invención las moléculas de captura se pueden elegir, por ejemplo, del grupo formado por una molécula de ácido nucleico, una molécula de carbohidrato, una molécula de ARN, una proteína, un anticuerpo, un péptido o una glicoproteína. Las moléculas de captura son preferiblemente anticuerpos, incluyendo fragmentos de los mismos con afinidad suficiente por una diana o molécula de interés y anticuerpos recombinantes o fragmentos de anticuerpo recombinante, así como derivados modificados química y/o bioquímicamente de dichos anticuerpos o fragmentos procedentes de la cadena variante con una longitud de al menos 12 de sus aminoácidos.

Los métodos de detección preferidos incluyen ensayos inmunológicos de varios formatos, tales como, por ejemplo, un radioinmunoensayo (RIE), ensayos inmunológicos quimioluminiscentes y fluorescentes, ensayos inmunológicos ligados a enzimas (ELISA), matrices de perlas basadas en Luminex, ensayos de micromatriz proteica y formatos de ensayo rápido como, por ejemplo, pruebas con tiras inmunocromatográficas.

Los ensayos pueden ser homogéneos o heterogéneos, competitivos y no competitivos de tipo sándwich. En una forma de ejecución especialmente preferida el ensayo tiene el formato sándwich, que es un ensayo inmunológico no competitivo, donde la molécula que se debe detectar y/o cuantificar se une a un primer anticuerpo y a un segundo anticuerpo. El primer anticuerpo puede estar unido a una fase sólida, como p.ej. una perla, la superficie de un pocillo u otro recipiente, un chip o una tira, y el segundo anticuerpo va marcado, p.ej. con un colorante, con un radioisótopo

o con una fracción reactiva o catalíticamente activa. Después se mide mediante un método apropiado la cantidad de anticuerpo marcado que está unida al analito. La composición general y los procedimientos usados en los “ensayos sándwich” están bien establecidos y son conocidos del especialista (The Immunoassay Handbook, Ed. David Wild, Elsevier LTD, Oxford; 3ª ed. (mayo de 2005), ISBN-13: 978-0080445267; Hultschig C y otros, Curr Opin Chem Biol. Feb. de 2006; 10(1):4-10. PMID: 16376134, incorporado aquí como referencia).

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En una forma de ejecución especialmente preferida el ensayo comprende dos moléculas de captura, preferiblemente dos anticuerpos que se encuentran en forma de dispersiones dentro de una mezcla reactiva líquida en la cual hay un primer componente marcador, unido a la primera molécula de captura, que forma parte de un sistema de marcaje basado en la extinción o amplificación fluorescente o quimioluminiscente, y un segundo componente marcador de dicho sistema de marcaje que se une a la segunda molécula de captura, de modo que al unirse ambas moléculas de captura al analito se genera una señal medible que permite detectar los complejos sándwich formados en la solución que contiene la muestra.

Con mayor preferencia dicho sistema de marcaje comprende criptatos o quelatos de tierras raras en combinación con un colorante fluorescente o quimioluminiscente, en particular con un colorante de tipo cianina.

En el contexto de la presente invención los ensayos a base de fluorescencia comprenden el uso de colorantes que se pueden elegir, por ejemplo, del grupo formado por FAM (5-o 6-carboxifluoresceína), VIC, NED, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), IRD-700/800, colorantes de cianina, también CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, CY7, xanteno, 6-carboxi-2’,4’,7’,4,7-hexaclorofluoresceína (HEX), TET, 6-carboxi-4’,5’-dicloro-2’,7’-dimetodifluoresceína (JOE), N,N,N’,N’-tetrametil-6-carboxi-rodamina (TAMRA), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 5-carboxi-rodamina-6G (R6G5), 6-carboxi-rodamina-6G (RG6), rodamina, verde de rodamina, rojo de rodamina, rodamina 110, colorantes BODIPY tales como BODIPY TMR, verde Oregón, cumarinas como la umbeliferona, bencimidas como Hoechst 33258; fenantridinas tales como rojo Texas, amarillo Yakima, Alexa Fluor, PET, bromuro de etidio, colorantes de acridinio, colorantes de carbazol, colorantes de fenoxazina, colorantes de porfirina, colorantes de polimetina, etc.

En el contexto de la presente invención los ensayos a base de fluorescencia comprenden el uso de colorantes que están basados en los principios físicos descritos para materiales quimioluminiscentes en la enciclopedia Kirk-Othmer de tecnología química, 4ª ed., director editorial, J. I. Kroschwitz; editor, M. Howe-Grant, John Wiley & Sons, 1993, vol. 15, p. 518-562, que se incorpora aquí como referencia, incluyendo las citaciones de las páginas 551-562. Los colorantes quimioluminiscentes preferidos son los ésteres de acridinio.

La forma de ejecución más preferida, en la cual el ensayo comprende un anticuerpo monoclonal y otro policlonal, se comparó con un ensayo que incluía dos anticuerpos policlonales. Para valorar comparativamente la precisión de ambos ensayos se determinó la imprecisión total del ensayo midiendo por duplicado 22 muestras de suero humano con varias concentraciones de copeptina. Estos datos fueron generados por 6 operadores diferentes en 12 ensayos, con 2 lotes distintos de reactivos, en 2 laboratorios diferentes. Las curvas de precisión resultantes se muestran en las figs. 4 y 5. Para el ensayo poli/poli se obtuvo un CV del 20% a 2,2 pmol/l y un CV del 10% a 9 pmol/l. En cambio para el ensayo mono/poli el CV del 20% se obtuvo a 0,75 pmol/l y el CV del 10% a 2,9 pmol/l.

Se ha referido que la mediana de concentraciones de copeptina en mujeres sanas en ayunas y en reposo es de 3,2 pmol/l (Bhandari SS, Loke I, Davies JE, Squire IB, Struck J, Ng LL. Gender and renal function influence plasma levels of copeptin in healthy individuals.Clin Sci [Sexo e influencia de los niveles plasmáticos de copeptina en la función renal de individuos sanos] (Lond). 2008 Jul 22. [Publicación electrónica anterior a la impresa]) y de 3,7 pmol/l (Morgenthaler NG, Struck J, Alonso C, Bergmann A. Assay for the measurement of copeptin, a stable peptide derived from the precursor of vasopressin [Ensayo para la medición de la copeptina, un péptido estable derivado del precursor de la vasopresina]. Clin Chem. 2006 Jan; 52(1):112-9.). En el presente análisis se halló que la imprecisión total del ensayo a 3,2 pmol/l era del 15% para el ensayo poli/poli y del 9,5% para el ensayo mono/poli. Por lo tanto el ensayo mono/poli es claramente mucho más adecuado para evaluar los niveles de copeptina en la población normal. A continuación se describen detalladamente ambos ensayos:

Ensayo 1 (poli/poli)

La determinación de copeptina en formato de quimioluminiscencia con tubo recubierto se llevó a cabo tal como se ha descrito (Morgenthaler NG, Struck J, Alonso C, Bergmann A. Assay for the measurement of copeptin, a stable peptide derived from the precursor of vasopressin [Ensayo para la medición de la copeptina, un péptido estable derivado del precursor de la vasopresina]. Clin Chem. 2006 Jan; 52(1):112-9.). Breve: los tubos se recubrieron con un anticuerpo policlonal de oveja purificado (2 µg/tubo) producido contra un péptido que representa las posiciones 132-147 de la pre-pro-vasopresina. Un anticuerpo policlonal de oveja purificado, producido contra un péptido que representa las posiciones 149-164 de la pre-pro-vasopresina, se marcó con MACN-acridinio-N-hidroxisuccinimidaéster y se empleó como trazador. Las diluciones de un péptido que representa las posiciones 132-164 de la pre-provasopresina en suero normal de caballo sirvieron de patrones. El ensayo inmunológico se efectuó incubando durante 2 horas a la temperatura ambiente 50 µl de muestras/patrones y 200 µl de trazador en tubos recubiertos. Los tubos se lavaron 4 veces con 1 ml de solución de lavado LUMItest (B.R.A.H.M.S. AG, Hennigsdorf, Alemania) y se midió la quimioluminiscencia fijada con un luminómetro (Berthold, Bad Wildbach, Alemania).

Ensayo 2 (mono/poli)

Se desarrolló un anticuerpo monoclonal (294/1A7) que tiene un epítopo en copeptina localizado en las respectivas posiciones 132-147 de la pre-pro-vasopresina. El anticuerpo se desarrolló usando procedimientos estándar descritos (Harlow E, Lane D “Antibodies -A Laboratory Manual” 1988 by Cold Spring Harbor Laboratory, páginas 148 y sigtes.,

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ISBN 0-87969-314-2). Breve: un péptido sintetizado químicamente que representa las posiciones 132-164 de la prepro-vasopresina, extendido con un resto adicional de cisteína en el extremo N-terminal, se acopló a ASB utilizando sulfo-MBS como reticulante. Con este conjugado se inmunopotenciaron ratones Balb/c. Se fusionaron células del bazo de los ratones inmunizados con una línea celular de mieloma SP2/0 y se seleccionaron células de hibridoma productoras de anti-copeptina por su capacidad de secretar anticuerpos que reconocen un péptido que cubre las posiciones 132-147 de la pre-pro-vasopresina. Se reclonaron las células de hibridoma seleccionadas positivamente y como resultado se obtuvieron varias líneas celulares de hibridoma, entre ellas una línea productora del anticuerpo monoclonal 294/1A7 que se usó después.

El anticuerpo monoclonal se usó para reemplazar el anticuerpo policlonal empleado sobre la fase sólida del ensayo poli/poli arriba descrito. Todos los demás componentes y la realización del ensayo no variaron respecto al ensayo poli/poli arriba descrito.

Los métodos y ensayos de la presente invención permiten determinar el riesgo de un sujeto de contraer diabetes mellitus y/o síndrome metabólico. En otros casos se puede realizar un diagnóstico del síndrome metabólico de un sujeto, sobre todo en combinación con otros parámetros clínicos y/o de laboratorio. Los resultados de los métodos y ensayos de la presente invención permiten elegir un tratamiento adecuado o una estrategia de prevención para un sujeto. Los sujetos con mayor riesgo de contraer síndrome metabólico y/o diabetes mellitus son advertidos para que cambien su estilo de vida, p.ej. moderando su ingesta calórica diaria, modificando la composición de la dieta y/o aumentando la actividad física.

La correlación encontrada por los presentes inventores entre el nivel de pro-hormona arginina-vasopresina o de fragmentos de ella en las muestras de los sujetos y su riesgo de contraer diabetes mellitus y/o síndrome metabólico sugiere la intervención del sistema de vasopresina en la homeostasis de la glucosa y en el desarrollo de la diabetes.

El incremento de los niveles de vasopresina (y de su pro-hormona y fragmentos de la misma) están asociados con la diabetes mellitus y el síndrome metabólico. El efecto de la vasopresina puede ser mediado especialmente a través del receptor V1b (V1bR). Por consiguiente la presente invención también se refiere al tratamiento o prevención del síndrome metabólico y/o de la diabetes mellitus mediante la inhibición del receptor V1bR. La presente invención se refiere al uso de antagonistas de V1bR en el tratamiento y/o prevención del síndrome metabólico y/o de la diabetes mellitus. Los antagonistas de V1bR especialmente preferidos se pueden elegir del grupo constituido por anticuerpos y pequeñas moléculas. Los posibles antagonistas de V1bR se pueden identificar en ensayos de fijación conocidos del especialista, determinando sus valores IC50, p.ej. mediante un ensayo radio-receptor.

Descripción de las figuras

Figura 1: secuencia de aminoácidos de la pre-pro-AVP (SEQ ID NO: 1). Figura 2: secuencia de aminoácidos de la CT-pro-AVP (copeptina) (SEQ ID NO:2). Figura 3: secuencia de aminoácidos de la pro-AVP (SEQ ID NO:3). Figura 4: curva de precisión del ensayo de copeptina con anticuerpo policlonal/policlonal. Representación gráfica del coeficiente de variación inter-ensayo (CV [%]) frente a las concentraciones de copeptina [pmol/l]. Se marcan las concentraciones de copeptina determinadas con un CV del 10% y 20% respectivamente. Figura 5: curva de precisión del ensayo de copeptina con anticuerpo monoclonal/policlonal. Representación gráfica del CV [%] interensayo frente a las concentraciones de copeptina [pmol/l]. Se marcan las concentraciones de copeptina determinadas con un CV del 10% y 20% respectivamente. Figura 6: el incremento de copeptina en el plasma está relacionado independientemente con la diabetes. Se representan los IP de diabetes correspondientes a los cuartiles de los niveles de copeptina. Ajustados por: edad, sexo, TG, HDL, PSS, PSD, TAH, IMC, cintura, C/C, cistatina C, PCR, ECV previa. Figura 7: el incremento de copeptina en el plasma es un predictor independiente de futura diabetes (excluidos los diabéticos conocidos o los sujetos con GSA > 6,0 mM en la línea base). El efecto es independiente de la glucosa basal. Se representan los IP de diabetes incidente correspondientes a los cuartiles de los niveles de copeptina. Ajustados por: edad, sexo, TG, HDL, PSS, PSD, TAH, IMC, cintura, C/C, cistatina C, PCR, ECV previa, fumador, herencia de diabetes, insulina plasmática en ayunas y glucosa sanguínea en ayunas. Figura 8: el incremento de copeptina en el plasma es un predictor independiente de futura diabetes (excluidos los diabéticos conocidos o los sujetos con GSA ± 5,4 mM en la línea base). El efecto es independiente de la glucosa y permanente (se intensifica después de la exclusión de la GAA). Se representan los IP de diabetes incidente correspondientes a los cuartiles de los niveles de copeptina. Ajustados por: edad, sexo, TG, HDL, PSS, PSD, TAH, IMC, cintura, C/C, cistatina C, PCR, ECV previa, fumador, herencia de diabetes, insulina plasmática en ayunas y glucosa sanguínea en ayunas. Figura 9: curvas CRO de predicción de la diabetes futura utilizando a) una combinación de edad, sexo, IMC y herencia de DM, y b) añadiendo copeptina a esta combinación. Figura 10: curvas CRO de predicción de la diabetes futura utilizando a) una combinación de edad, sexo, PSS, IMC, cintura, glucosa, TG, HDL y herencia de DM, y b) añadiendo copeptina a esta combinación. Figura 11: correlación del nivel de glucosa sanguínea en ayunas (mmol/l) con los cuartiles de copeptina creciente en plasma, expresado como media con intervalos de confianza del 95% en sujetos no diabéticos (n = 4377). P (tendencia lineal) < 0,001

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y el riesgo de aparición nueva de diabetes en sujetos sin glucosa alterada en ayunas (glucosa plasmática en ayunas igual a 6,1 mmol/l, que corresponde a una GSA < 5,5 mmol/l) (n = 3702). Los datos obtenidos de los análisis de regresión logística se expresaron como índice de probabilidad (IP) e intervalos de confianza (IC) del 95%. Se consideró estadísticamente significativo un valor P bilateral < 0,05. Para valorar la sensibilidad y la especificidad de la P-copeptina en la predicción de aparición nueva de diabetes, además de las series de predictores clásicos de diabetes, comparamos el área bajo las curvas características receptor-operador (CRO) empleando un modelo tanto personal (edad, sexo, IMC y herencia de diabetes), como clínico (modelo personal + presión sanguínea sistólica, triglicéridos, HDL, circunferencia de la cintura y GSA), con y sin P-copeptina en cada uno de los modelos.

RESULTADOS

De los pacientes con diabetes en el examen inicial (n = 365) solo el 29% refirió un historial de diabetes diagnosticada por el médico o de tratamiento, mientras que la mayoría (71%) fueron clasificados como diabéticos por presentar una GSA ≥ 6,1 mmol/l en el examen inicial. El nivel de P-copeptina fue mayor entre los pacientes diabéticos que entre los pacientes no diabéticos (tabla 1). En el segmento no diabético de la población, la GSA aumentó con la copeptina (figura 11). Hubo un incremento gradual del IP de diabetes con los cuartiles crecientes de copeptina, tanto en el modelo bruto como después de ajustar todas las características de la línea base, que difirió significativamente en las comparaciones univariantes entre los pacientes de diabetes y los controles (tabla 1), exceptuando la concentración plasmática de insulina (modelo 1, ajuste) (tabla 2) (fig. 6). Entre los sujetos no diabéticos la concentración plasmática de insulina subió gradualmente con los cuartiles de P-copeptina (figura 12) y el IP de resistencia a la insulina (cuartil superior de insulina plasmática en ayunas del segmento no diabético de la población) aumentó con la P-copeptina, tanto en el análisis bruto como después del ajuste extendido del modelo 1, incluyendo las covariables del modelo 1 y la GSA (tabla 2). Entre los sujetos sin diabetes en la línea base, las concentraciones de copeptina en los límites de los cuartiles fueron las siguientes: Q1/Q2: 3,13 pmol/l, Q2/Q3: 5,05 pmol/l, Q3/Q4: 7,94 pmol/l.

Entre los sujetos sin diabetes en la línea base (n = 4377), 174 desarrollaron diabetes nueva y entre los sujetos libres de glucosa alterada en ayunas en la línea base (n = 3702), 79 desarrollaron diabetes nueva durante el seguimiento (tabla 3). La P-copeptina en la línea base fue significativamente superior en los sujetos que desarrollaron diabetes nueva, en comparación con los que no la desarrollaron, tanto entre los sujetos sin diabetes en la línea base como entre los sujetos sin glucosa alterada en ayunas en la línea base (tabla 3). La probabilidad de desarrollar diabetes nueva aumentó con los cuartiles de P-copeptina en el análisis bruto y también después del ajuste de las covariables del modelo 1 más insulina en ayunas, GSA, fumador, herencia de diabetes y LDL, tanto en los sujetos sin diabetes (fig. 7) como en los sujetos sin glucosa alterada en ayunas en la línea base (fig. 8) (tabla 4). En los sujetos sin diabetes en la línea base, el área bajo la curva característica receptor-operador (CRO) para predecir diabetes futura aumentó de 69,4 hasta 71,0% (P = 0,08) y de 83,2 hasta 84,1% (P = 0,007) al añadir copeptina al modelo personal y al modelo clínico de predicción de diabetes, respectivamente. En los sujetos sin glucosa alterada en ayunas en la línea base, el área bajo la curva CRO para predecir diabetes futura aumentó de 66,3 hasta 71,3% (P = 0,03) (fig. 9) y de 78,3 hasta 80,5% (P = 0,04) (fig. 10) al añadir copeptina al modelo personal y al modelo clínico de predicción de diabetes, respectivamente.

DISCUSIÓN

Aquí, en una cohorte basada en una amplia población, demostramos que la P-copeptina es notablemente alta en los pacientes de diabetes y que aumenta linealmente con la GSA en los sujetos no diabéticos, es decir en sujetos con niveles de GSA que en definitiva no afectan a la osmolalidad. En los sujetos no diabéticos hubo una fuerte relación transversal entre P-copeptina y resistencia a la insulina (estimada mediante la insulina plasmática en ayunas) y esta relación era independiente de un gran número de factores distorsionantes, incluida la GSA. Además la P-copeptina en la línea base fue un gran factor de riesgo de desarrollo de diabetes nueva durante el seguimiento. Lo importante es que esta relación era independiente de una amplia variedad de factores de riesgo bien conocidos de diabetes en la línea base, incluyendo GSA e insulina en ayunas, estando estas dos últimas muy relacionadas transversalmente con la P-copeptina. Al restringir la cohorte a los sujetos sin glucosa alterada en ayunas, la relación entre P-copeptina y aparición de diabetes nueva se consolidó a pesar del hecho de que casi la mitad de los nuevos casos de aparición de diabetes nueva ocurrieron entre sujetos que habían tenido glucosa alterada en ayunas en la línea base. Tal como era de esperar, la GSA fue el mayor factor de riesgo de aparición de diabetes nueva. Cada 1 mmol/l de aumento de la GSA en la línea base incrementó el riesgo de diabetes futura, con un IP de 11,4 (95% IC: 7,4-17,5) en el modelo totalmente ajustado (tabla 4). Teniéndolo cuenta es sorprendente que la relación entre los cuartiles superior e inferior de copeptina se asociara a un IP de 3,6 de aparición de diabetes nueva en sujetos sin glucosa alterada en ayunas, después del ajuste total de covariables en la línea base, incluida la GSA (tabla 4). Lo importante es que en sujetos sin glucosa alterada en ayunas hubo una mejoría significativa de un 2,2-4,0% del área bajo la curva CRO cuando se añadió P-copeptina a modelos de factores clásicos de riesgo de diabetes, lo cual indica que la P-copeptina mejora la sensibilidad y especificidad de la predicción del riesgo individual de diabetes. En la muestra más amplia, que incluía los sujetos con glucosa alterada en ayunas, la P-copeptina no mejoró el área bajo la curva CRO tan marcadamente.

La menor mejoría del área bajo la curva CRO en los análisis que incluyen sujetos con altos niveles de GSA (es decir, sujetos con glucosa alterada en ayunas) puede ser debida a que la GSA sea un predictor más potente de diabetes a niveles cercanos al límite diagnóstico de 6,1 mmol/l, mientras que los marcadores no diagnósticos de diabetes, como

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la P-copeptina, pueden señalar antes y mejor la susceptibilidad a la diabetes en el estado prediabético. Cabe señalar que, como herramientas de detección de diabetes futura, los nuevos marcadores de riesgo son más importantes en sujetos con GSA normal, porque de todos modos los sujetos con glucosa alterada en ayunas suelen recibir atención médica para predecir la diabetes, pues, como es bien sabido, una GSA elevada tiene un gran valor predictivo de la diabetes. Por lo tanto nuestros hallazgos indican que la adición de P-copeptina a las herramientas ya consolidadas de detección de la diabetes puede ser valiosa clínicamente para predecirla. No disponemos de datos de subtipos de diabetes de nueva aparición; no obstante, como la edad media en el segmento no diabético de nuestra población es de 57 años y hay una fuerte relación transversal entre la P-copeptina y la resistencia a la insulina, asumimos que el incremento de la P-copeptina indica riesgo de contraer diabetes de tipo 2, más que diabetes de tipo 1.

Aparte de sus implicaciones para la detección de la diabetes, nuestros hallazgos sugieren la intervención del sistema de AVP en la patofisiología de la diabetes y sus posibilidades para el desarrollo de nuevos regímenes de tratamiento antidiabético. Los estudios con animales han demostrado que los ratones carentes del V1aR (V1aR -/-) presentan niveles altos de AVP, intolerancia a la glucosa y resistencia a la insulina, mientras que los ratones carentes del V1bR (V1bR -/-) adquieren el fenotipo contrario de baja GSA y mejor sensibilidad a la insulina. Basándonos en estos datos de los animales y en nuestros hallazgos de que la P-copeptina alta está relacionada con GSA elevada, resistencia a la insulina y mayor riesgo de futura diabetes, se puede especular con que la AVP elevada, como consecuencia de la resistencia a la AVP al nivel del V1aR o en otro lugar, favorece la resistencia a la insulina y la diabetes mediante la estimulación del V1bR. De hecho, el bloqueo farmacológico del V2R, un potente estímulo de la mayor secreción de AVP como reacción negativa en el eje hipotalámico-neuropituitario, fue relacionado con un aumento quíntuple de los episodios hiperglicémicos durante 30 días de tratamiento con tolvaptán en pacientes con hiponatremia. Por tanto un aumento de AVP, cualquiera que sea el mecanismo subyacente, puede contribuir a la alteración de la homeostasis de la glucosa, probablemente mediante la estimulación del V1bR. Estas observaciones justifican los estudios sobre manipulaciones farmacológicas del sistema de AVP en relación con el metabolismo de la glucosa en el hombre.

El número de casos de aparición de diabetes nueva en la MDC-CC puede parecer menor de lo esperado. Hay tres razones importantes que son las más plausibles para explicarlo. (1) La tasa de participación en el estudio MDC fue solo del 40% y por lo tanto la población del MDC es más sana e incluye de forma desproporcionada muchas mujeres respecto a la población original (Manjer 2001). Como resultado la relación entre P-copeptina y aparición de diabetes nueva que describimos está probablemente subestimada. (2) La incidencia de diabetes que observamos en los tres registros está basada en la condición previa de gente que busca activamente asistencia médica y no en la detección de los niveles glucosa en la población, lo cual arroja una menor incidencia que la observada en los estudios basados en la detección de la diabetes mediante la medición de la GSA. Asimismo, al contrario que nuestra definición de la diabetes de nueva aparición, la definición de la diabetes en el examen inicial de la MDC-CC incluía la medición de la GSA. De hecho el 71% que se había definido como diabético no informaron de un historial de diabetes o tratamiento antidiabético, sino que fueron diagnosticados basándose solamente en la GSA. La exclusión de este gran número de pacientes diabéticos que ignoraban tener diabetes antes del examen inicial ha disminuido notablemente la incidencia de diabetes de nueva aparición durante el seguimiento. (3) A pesar de los temas discutidos anteriormente es posible que nuestro estudio haya omitido varios casos de nueva aparición, que de hecho ya se habían diagnosticado como diabetes en el sistema de asistencia sanitaria. El MHR registró todos los valores de HbA1c en el área metropolitana de Malmö desde 1990 en adelante; pero omitimos los casos diagnosticados de diabetes en el área metropolitana de Malmö si en ellos no se había medido la HbA1c o si solo se había medido una vez o si solo era marginalmente alta en repetidas ocasiones. Los casos de diabetes de nueva aparición no detectados en el MHR por encontrarse fuera del área metropolitana de Malmö tras el examen inicial de la MDC-CC habrían tenido una oportunidad razonable de ser detectados por el NDR, de ámbito nacional, y/o por el registro regional Diabetes 2000, en particular por el NDR, pues se estimó que este registro cubría el 50% de todos los pacientes diabéticos de Suecia en 2007. La cobertura de los registros NDR y Diabetes 2000 aún no es completa. Por estos motivos hemos clasificado como no diabéticos un número desconocido de sujetos que de hecho desarrollaron diabetes durante el seguimiento. Por otro lado, como los criterios de HbA1c para la diabetes de nueva aparición en el MHR y su validez comprobada en los registros NDR y Diabetes 2000 son estrictos, confiamos en el valor del punto final en aquellos sujetos que clasificamos como casos de diabetes de nueva aparición. La validez del diagnóstico de diabetes de nueva aparición basado en los registros también está respaldada por el hecho de que la mayoría de los factores bien conocidos de riesgo de diabetes fueron notablemente altos en la línea base de la MDC-CC de estos sujetos, en comparación con los que no desarrollaron diabetes según los tres registros (tabla 3). Cabe destacar que estas diferencias fueron igualmente marcadas cuando la población del estudio se restringió a sujetos con la glucosa alterada en ayunas en la línea base, excluyendo por tanto la posibilidad de que nuestros hallazgos sobre los factores establecidos de riesgo de diabetes y la P-copeptina en relación con la diabetes de nueva aparición solo fueran debidos a los sujetos que tenían niveles casi diabéticos de GSA en el examen inicial de la MDC-CC.

En conclusión, la P-copeptina predice la diabetes independientemente de un amplio rango de factores establecidos de riesgo de diabetes, incluyendo los niveles de glucosa e insulina en ayunas. Nuestros hallazgos sugieren que el sistema de la AVP interviene en el desarrollo de la diabetes y que puede tener implicaciones en la valoración del riesgo y en la nueva farmacoterapia antidiabética.

Tabla 1. Características de los sujetos con y sin diabetes en la línea base

Sujetos no diabéticos (n = 4377) Pacientes diabéticos (n = 365) Valor P Edad (años) 75,4 ± 5,9 59,5 ± 5,5 < 0,001 GSA (mmol/l) 4,9 ± 0,45 8,1 ± 3,0 < 0,001 Triglicéridos (mmol/l)* 1,12 (0,85 – 1,53) 1,64 (1,13 – 2,33) < 0,001 PS sistólica (mm Hg) 140 ± 19 150 ± 20 < 0,001 PS diastólica (mm Hg) 87 ± 9,4 90 ± 9,5 < 0,001 IMC (kg/m2) 25,5 ± 3,7 28,7 ± 4,5 < 0,001 Cintura (cm) 82,6 ± 12 94,4 ± 13 < 0,001 Relación cintura-cadera 0,84 ± 0,09 0,91 ± 0,09 < 0,001 HDL (mmol/l) 1,40 ± 0,37 1,23 ± 0,35 < 0,001 LDL (mmol/l) 4,2 ± 0,98 4,2 ± 1,0 0,22 Cistatina C (mg/l) 0,773 ± 0,143 0,809 ± 0,193 0,001 Copeptina (pmol/l)* 5,04 (3,12 – 7,94) 6,90 (4,32 – 10,7) < 0,001 Insulina (mU/l)* 6,0 (4,0 – 9,0) 12 (7,0 – 18) < 0,001

(Continuación)

Tabla 1. Características de los sujetos con y sin diabetes en la línea base

Sujetos no diabéticos (n = 4377) Pacientes diabéticos (n = 365) Valor P

PCR (mg/l) 1,3 (0,6 – 2,6) 2,3 (1,3 – 4,5) < 0,001

Hombres (%) 39,2 56,2 < 0,001

TAH (%) 14,7 37,3 < 0,001

Actualmente fumador (%) 26,5 24,4 0,41

Herencia de diabetes (%) 3,0 3,0 0,87

ECV previa (%) 2,0 3,8 0,02

Las variables continuas están indicadas como media ± DE, si no se especifica otra cosa; *mediana (rango

intercuartil)

TAH, tratamiento anti-hipertensivo; IMC, índice de masa corporal; GSA, glucosa sanguínea en ayunas;

ECV previa, enfermedad cardiovascular existente antes del examen inicial.

Tabla 2: Diabetes prevalente y resistencia a la insulina respecto a los cuartiles de P-copeptina en la línea base

Variable dependiente: IP (95% IC) copeptina Q2 frente a copeptina Q1 IP (95% IC) copeptina Q3 frente a copeptina Q1 IP (95% IC) copeptina Q4 frente a copeptina Q1 P de tendencia lineal

Diabetes* Hiperinsulinemia †: bruto ajustado bruto ajustado 1,44 (1,00 – 2,07) 1,19 (0,81 – 1,75)‡ 1,30 (1,06 – 1,60) 1,19 (0,94 – 1,51)§ 1,92 (1,36 – 2,71) 1,39 (0,96 – 2,01)‡ 1,53 (1,25 – 1,87) 1,26 (0,99 – 1,60)§ 2,83 (2,04 – 3,93) 1,45 (1,00 – 2,11)‡ 2,34 (1,93 – 2,85) 1,61 (1,26 – 2,06)§ < 0,001 0,04 < 0,001 < 0,001

* Análisis de la prevalencia de diabetes (n = 365) en toda la cohorte (n = 4742)

† Análisis de la hiperinsulinemia (cuartil más alto de la concentración de insulina plasmática en ayunas entre sujetos no diabéticos) en los sujetos no diabéticos (n = 4377)

‡ Ajustado por edad, sexo, HDL, triglicéridos, presión sanguínea, tratamiento antihipertensivo, índice de masa corporal, cintura, relación cintura/cadera, cistatina C, PCR y enfermedad cardiovascular previa (modelo 1) § Ajustado por el modelo 1 y GSA.

Tabla 3. Características en la línea base de los sujetos que contrajeron o no diabetes durante el seguimiento Sujetos sin diabetes en la línea base (n = 4377)

No alterados (n = 4203) Diabetes incidente (n = 174) P Edad (años) 57,3 ± 5,9 57,9 ± 5,7 0,26 Hombres (%) 38,9 45,4 0,09 Glucosa (mmol/l) 4,9 ± 0,44 5,4 ± 0,44 < 0,001 Triglicéridos (mmol/l) 1,11 (0,84 – 1,51) 1,46 (1,05 – 1,96) < 0,001 PS sistólica (mm Hg) 140 ± 19 146 ± 19 < 0,001 PS diastólica (mm Hg) 86 ± 9,3 90 ± 10 < 0,001 TAH (%) 14,2 27,6 < 0,001 IMC (kg/m2) 25,4 ± 3,6 28,2 ± 4,7 < 0,001 Cintura (cm) 82,2 ± 12 91,5 ± 14 < 0,001 Relación cintura-cadera 0,84 ± 0,09 0,89 ± 0,10 < 0,001 HDL (mmol/l) 1,41 ± 0,37 1,25 ± 0,33 < 0,001 LDL (mmol/l) 4,2 ± 0,98 4,3 ± 1,0 0,06 Cistatina C (mg/l) 0,77 ± 0,14 0,82 ± 0,21 < 0,001

Claims

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