KR20030039706A - 자가항체-비만세포 트립테이즈 면역복합체를 이용한즉시형 과민성 질환 진단 방법 및 그 진단키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 즉시형 과민성 질환(immediate hypersensitivity diseases) 을 가진 환자의 혈청에 존재하는 자가항체 (autoantibody)- 비만세포(mast cell) 트립테이즈(tryptase) 복합체(complex)의 존재를 이용하여 즉시 과민성 질환을 진단하는 방법과 그 방법에 사용되는 키트에 관한 발명이다.
또 이 발명은 즉시형 민감성 질환 진단 이외에도 트립테이즈와 관련된 특정한 면역성 질병 진단과 치료제 개발하는데 이용 될 수 있다.

Description

자가항체-비만세포 트립테이즈 면역복합체를 이용한 즉시형 과민성 질환 진단 방법 및 그 진단키트{Process for diagnosing immediate hypersensitivity diseases using autoantibody-mast cell tryptase immune complex as a unique marker and the kit thereof}
본 발명은 자가항체-비만세포 트립테이즈 면역복합체를 이용한 질병 진단하는 방법 및 그 키트에 관한 발명으로, 더욱 상세하게는 즉시형 과민성 질환(immediate hypersensitivity diseases) 을 가진 환자의 혈청에 존재하는 자가항체 (autoantibody)- 비만세포(mast cell) 트립테이즈(tryptase) 복합체(complex)의 존재를 이용하여 즉시 과민성 질환을 진단하는 방법과 그 방법에 사용되는 키트에 관한 발명이다.
과민증은 특정항원과 동종세포친화성(homocytotrophic) 항체사이의 반응 후에 생기는 즉시 과민반응의 임상적 용어이다. 이는 빠르고 종종 극단적으로 예상치 못하게 발생하여 호흡장애나 비가역적인 혈관파열로 사망에 까지 이를 수 도 있다. 과민증은 알레르기 반응의 가장 심각한 형태이고 항상 의학적으로 긴급사태로 여겨지고 있다. 과민증은 3000명의 환자 중 1명 꼴로 나타난 것으로 추산되며 500명 이상 사망의 원인이다. 최근 조사에 따르면 1999년 미국 총 인구 2억 7천 2백만 중 음식으로 인한 과민증 위험에 처해있는 인구가 1099명, 페니실린에 의한 것이 190만명에서 2천 7백 2십만명, 래디오칸트라스트 미디아(radiocontrast media)로 인한 것이 2만2천에서 10만명, 라텍스(고무)로 인한 것이 220명, 곤충의 침에 의한 것이 136만명에서 1360만명에 이르러서 매년 미국에서 329만에서 4090만명의 사람들이 과민증의 위험에 처해있다고 한다.
그러나 즉시 과민증의 원인과 병리학적 특징은 불분명하다. 과민반응은 외계물질과 체내 물질이 반응했을 때 개시된다. 고전적인 과민증의 발생은, 알레르겐이 비만세포와 호염구의 세포막 표면에 붙어있는 IgE 항체과 결합했을 때 일어난다. 비만세포는 혈관과 인접해 있는 점액성의 피부표면 밑에 많이 존재한다. IgE와 알레르겐의 반응은 복잡한 일련의 반응을 활성화시켜 히스타민(histamine), 트립테이즈(tryptases), 프로스타그라딘(prostaglandins), 루코트리엔(leukotrienes) 등과 같은 다량의 염증 매개체를 유리시킨다. 그러나 이들 매개체들이 과민증에서 관찰되는 생리학적 변화만 가지고 설명할 수는 없다. 즉, 아직 알려져 있지 않은 미지의 매개체나 기작에 의해서 과민증이 일어 날 수도 있다.
사람 비만세포 트립테이즈(Human mast cell tryptase)
비만세포(mast cell)는 국부 조직내에서 매개체(mediator)를 유리시킴으로써 선천적 후천적 면역에 참여한다. 인체내에서는 비만세포만이 즉시 과민성 반응에 관여한다고 알려지고 있다. 트립테이즈는 중성 단백질분해효소(neutral protease)로 비만세포 분비 과립내 가장 많이 존재하는 단백질이다. 트립테이즈 효소는 과립내에서 활성을 가지고 있으며 테트라머 형태로 존재하며, 헤파린 프로테오글라이칸에 결합되어 있다. 인체 내에는 적어도 두 개의 유전자, 트립테이즈 α와 β을 암호화하는 데 이들은 16번 염색체내에 존재한다. 상대적으로 β-트립테이즈 효소는 상대적으로 α-트립테이즈 보다 많이 존재하며, 이는 효소적으로 활성이 있고 분비과립 내에 존재한다. 효소학적으로 비활성인 α-트립테이즈는 정상적인 사람의 혈액내에서 주로 존재하며 일정 수준으로 존재하지만 시스템메스토사이토시스(systemic mastocytosis) 환자의 혈액에서는 증가된다. 트립테이즈는 활성화된 비만세포로부터 히스타민과 함께 분비되며 헤파린과 이온결합을 하여 중성 pH의 등장액 조건에서 안정화된다. 헤파린 부재시, 테트라머 트립테이즈는 모노머 형태로 해리되어 활성을 잃어버리고 산성 조건에서 각각의 모노머는 다시 테트라머 형태로 되어 활성을 갖게 된다. 헤파린 또한 β-아미노펩티데이즈의 자가촉매 과정 중에 β-트립테이즈 전구체의 변형과정(processing)에 결정적인 역할을 한다. 반면에 α-트립테이즈는 추정되는 절단자리에서 R3Q의 치환 때문에 자가변형과정(autoprocessing)을 거치지 않는다. 재조합 α-트립테이즈는 다른 기질 특이성과 활성을 보이는데 이는 α-트립테이즈가 β-트립테이즈와는 다른 생리학적 기능을 가지고 있다는 것을 의미한다.
트립테이즈 활성의 조절
비만세포에서 일단 유리되면 트립테이즈 활성은 일반적으로 세린 프로테이즈 저해제들(α1-프로테네이즈 저해재, α2-매크로그로불린, 아프로티닌(aprotinin), 일부 식물체 유도 저해제(대두, 리마빈), 치킨 난무코이드 트립신 저해제)에 대해 내성을 가진다. 거머리 유래의 트립신 저해제는 인체 트립테이즈 활성을 저해하는 능력을 보이며 이는 펩타이드 상태의 기질보다 단백질 상태의 기질에서 더욱 효과적이다. 트립테이즈는 앤티트롬빈 III 같은 염기성 단백질에 의해 헤파린으로부터 해리되어 그 작용이 조절되는 것으로 여겨왔다. 그러나 앤티트롬빈 III 와 함께 반응시켰을 때 헤파린으로부터의 해리는 느리고 불완전한 것으로 나타났다. 이는비만세포로부터 유리될 수 있는, 다량의 이들 프로테이즈(트립테이즈)의 활성을 조절하는데 있어서는 만족스럽지 못한 기작이다. 생체 밖에서 트립테이즈는 트롬빈의 기질인 피브리노겐을 분해해서 불활성화 시키며 피브로넥틴과 다른 여러 뉴로펩티데이즈(neuropeptides)를 분해한다. 트립테이즈는 프로스트로메리신 (prostromelysin; metalloproteinase III)과 유로키나제를 그들의 전구체로부터 활성화시킨다. 히스타민에 대한 기관지 근육의 강화된 수축성, 섬유모세포와 기관지 상피세포, 기관지 근육세포의 증식, 섬유모세포에 의한 콜라겐 합성 촉진, 호산구의 보충 등은 모두 트립테이즈의 인체 외 활성이다. 그러나 이들 활성은 합성 기질의 트립테이즈-촉매 분해 반응에 있어서 중성 pH에서 최대 활성을 나타낸다. 최근 본 발명의 발명자들은 피브리노겐분해를 위한 트립테이즈의 최적 pH가 6에서 6.5라는 것을 발견했다.
이는 β-프로트립테이즈(protryptase)가 β-프로 프라임 트립테이즈 (pro'tryptase)로 바뀔 때도 같은 조건이다. 저분자의 키니노겐(kininogen)으로부터 브레디키닌(bradykinin)을 생성하기 위한 트립테이즈의 최적 pH는 5.5라고 보고되었다.
또한 트립테이즈에 있는 구조적인 에피톱을 인지하는 마우스 항체 (B12 mAb)는 중성 pH에서 합성 펩타이즈 기질과 피브리노겐에 대하여 트립테이즈 활성을 저해하는 것으로 보이지만 헤파린이나 덱스트란 셀페이트의 존재시에는 산성 pH에서 트립테이즈의 피비리노겐분해 활성을 나타낸다. 이는 트립테이즈 활성은 조절체(modulator)에 의해 변형될 수 있고 체내에는 마우스 항체(B12 mAb)와 같은조절체가 존재할지도 모른다는 사실을 시사한다. 이는, 어떤 조직에서는 트립테이즈 활성이 산성 pH에서 최적이지만 혈액과 같은 중성 pH 조건에서는 활성이 없어질수도 있다는 것을 말해준다. pH가 산성인 위치는 염증 부위, 부상 부위, 고형 암세포(solid tumor), 호흡기의 점막을 포함한다. 또한 헤파린이 없어도 비활성 모노머 트립테이즈는 산성 pH 조건하에서 활성형 테트라머 트립테이즈 형태로 변한다.
그래서, 마우스 항체(B12 mAb)와 같은 조절체와 pH 조건은 효소의 기능, 안정성 및 활성의 조절에 중요한 요소가 될 수 있다.
사람 트립테이즈 효소에 대한 면역분석에 대한 선행기술
단일 클론 항체를 이용하는 ELISA와 상업적으로 이용하는 radioimmunoassay (RIA)을 포함한 수많은 종류의 면역분석법이 사용되어 오고 있다.
그러나, 각각의 이러한 기술들은 그 분야의 관련 연구자들에 의해 사용되거나 이들의 폭넓은 사용에 대한 규제등 문제점을 가지고 있다.
Pharmacia(Uppsala. Sweden)는 RIACT하에 사람 트립테이즈 효소분석을 위한 RIA를 시판하고 있다. 이러한 RIA는 요오드-부착한 쥐 단일클론 항체를 사용한다. 간단하게, RIA는 단백질(항체, 항원, 펩타이드 호르몬, 효소 등등)의 양의 존재를 측정하기 위한 면역학적 반응을 기본으로 하는 분석 기술이다. RIA 분석 방법의 공통된 특징은 방사선 표식된 항체와 항원 결합반응 정도에 따라 항원의 양을 결정한다. RIA는 직접적인 결합에 의한 항원-항체 침전에 의한 방사선량의 직접적인 측정에 바탕을 둔다.
간접적인 방법으로는, 알려진 표준과 경쟁적으로 방사선으로 표식하지 않은 단백질의 결합능력을 측정하는 것에 바탕을 두는 것이다. 그 샘플의 단백질 농도는 측정되어지는 단백질의 알려진 양을 포함한 표식된 표준의 시리즈에 의해 결정되거나 저해정도 비교에 의해 결정되어진다.
Pharmacia의 문헌은 RIACT radioimmunoassay 시스템의 민감도 한계가 0.5U/L(U/L는 ug/L, ng/mL과 같은 표현)이다.
현재 트립테이즈 효소 면역분석에 의해 전신성 과민증(systemic anaphylaxis)과 곤충에게 쏘인 자극에 의해 유도된 과민증 등과 같이 임상학적으로 심각한 상태에 관련된 과민증 환자는 혈청 내 이 효소의 양이 상승된 것으로 알려져 있다. 이는 혈청내 β-트립테이즈의 증가는 전신성 과민증의 진단을 뒷받침해 준다. 비록 혈청 내 증가된 트립테이즈가 전신성 과민증의 진단을 뒷받침해줄지라도 IgE-관련된 과민증으로 추정되는 모든 환자들에게는 높은 β-트립테이즈 효소 양이 나타나지 않는다. 이와 같은 증거로는, Sudden Infant Death Syndrome(SIDS)의 50명의 희생자 중 40%가 사후 혈청에서 높은 양의 β-트립테이즈 효소가 검출된 반면에 사망 나이에 대한 대조군인 15명에서는 사후 간격(postmortem interval)이나 소생효과(resuscitative effort)에도 그렇지 않다는 사실이었다. 우유에 대한 항원 특이적 IgE와 다른 일반적인 알러젠(allergen)들은 SIDS 혈청에서 발견되지 않았다. 이러한 자료들은 SIDS 경우 실질적으로 비만세포가 관여한다는 것을 암시하나, 비만세포가 어떻게 활성화 되어지는지에 대한 메커니즘은 밝혀진 바 없다. 유아의 전신성 비만세포증에서 무호흡증발병(apnea spell)은 혈청 내 β-트립테이즈 양이 증가된다. 이는 유아의 전신성 과민증이 성인의 전신성 과민증과 다르게 나타남을 제시한다. 또한 성인에서 예기치 못한 갑작스러운 죽음을 당한 68명의 사후 혈청에서 β-트립테이즈 농도는 10ng/ml 이하로 나타났으며, 이는 전체의 13 % 에 불과하였다. 이러한 것은 과민증으로 인한 사망으로 설명할 수 없는 부문이다. 이것은 포착자(capture)로써 하나의 항체와 검출자(detector)로써 그에 대한 것을 사용하는 현재의 분석방법으로서는 과민증 환자의 혈청내 모든 트립테이즈 효소를 검출할 수는 없다는 것을 의미한다. 가능한 이유로는 B12 항체(capture) 와 G4 항체(detector)를 이용한 Pharmacia UniCap 트립테이즈 효소분석에는 알려져 있지 않은 내생적인(endogenous) 분자들에 의해서 결합 에피톱이 억제되기 때문이다.
최근에 미국에서 본 발명과 유사한 내용의 특허 (미국 특허 번호 ; 5,861,264, 1999)가 출원었으나 뚜렷한 차이점을 가지고 있다.
첫째, 본 발명은 환자의 혈청 내 자가 항체-비만세포 트립테이즈 효소 복합체에 대한 특이적인 포착자, 트립테이즈 항체를 플레이트에 솔리드 서포트하여 그 복합체만 표착하는 분석방법으로 보다 민감하고 정확하게 즉시형 민감성 질병을 진단한 반면 미국 특허는 염증성 질환의 진단을 목적으로 트립테이즈 효소를 플레이트에 솔리드 서포트하여 분석하는 방법으로, 정확한 자가 항체-비만 세포 트립테이즈 복합체를 분석할 수 없다. 이것은 혈청내에는 수 많은 단백질들이 존재하므로 플레이트에 트립테이즈 효소만 솔리드 서포트하기는 매우 어렵기 때문이다. 따라서 이 분석방법은 그 정확도에 많은 문제점이 제기된다.
둘째, 본 발명에 대한 효과로는 정확한 진단에 의한 즉시형 민감성 질환과 아직 알려져 있지 않은 염증성 질환을 진단 및 치료에도 응용될 수 있는 반면 그들의 특허는 비 특이성 진단 분석 방법 일 뿐만 아니라 즉시형 민감성 질환에는 언급하지 않았다. 즉 이것은 서로 다른 자가항체에 대한 특이성 없는 자가 면역 질병 진단 방법이다.
따라서 염증성 질환의 진단을 목적으로 트립테이즈 효소를 플레이트에 솔리드 서포트하여 분석하는 방법 (미국 특허 번호 ; 5,861,264, 1999년)의 질병진단 키트는 트립테이즈 효소와 가장 밀접한 관계가 있는 즉시형 민감성 질병 진단에는 언급되지 않았고 또한 그 진단 방법은 트립테이즈 면역 복합체에 대한 항체의 특이성이 없으므로, 본 발명과 목적과 방법에서 뚜렷한 차이점을 가지고 있다.
현재 비만 세포의 베타-트립테이즈와 관련한 질병진단은 전신성 민감증과 마스토사이시스증 진단에 이용되고 있다. 그러나 때로는 임상학적으로 전신성 민감증 및 마스토사이시스증과 유사한 증상을 보인 환자의 경우에도 혈청 내 트립테이즈의 농도수준은 정상적인 사람과 유사하게 나타났다. 이에 많은 연구자들에 의해 문제점이 제기되고 있는 실정이다. 즉 비만세포 베타-트립테이즈는 어떤 특정한 질병에 대한 표식자 보다는 특정 질병에 대한 특정 내생인자간 결합과 관련되어 이 효소가 검출되지 않은 것으로 추측하고 있다. 위와같은 원인에 대한 문제의 실마리는 본 발명에서 구명하였다.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 과민증 질병의 정확한 진단을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 진단방법에 사용하는 키트를 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 자가항체-비만세포 트립테이즈 면역 복합체의 검출을 위한 이중 항체-샌드위치 효소-연결 면역흡착(immunosorbent) 분석을 도시적으로 나타낸 그림.
도 2 는 도 1에서 보여준 샌드위치 ELISA 분석방법을 이용하여 즉시형 민감성 환자의 혈청 샘풀에 정제된 비만세포 트립테이즈 효소를 첨가하여 경쟁적 반응 관계를 나타낸 그림.
도 3는 1에서 보여준 샌드위치 ELISA 분석 방법이 류마토이드 인자 ( Rheumatoid factor, RF)의 영향을 나타낸 그림.
도 4A는 도 1의 샌드위치 ELISA 분석을 최적화 한 후 전신성 민감성에 대한 표식자인 베타-트립테이즈와 자가항체-비만세포 트립테이즈 면역복합체 농도를 비교 분석한 그림. 도 4B는베타-트립테이즈 농도와 자가항체-비만세포 트립테이즈 면역복합체 농도간 피어슨 상관관계 계수 분석을 나타낸 그림.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 포착자 항체로 솔리드 서포트를 코팅하는 단계, 상기 솔리드 서포트를 블러킹하는 단계, 상기의 솔리드 서포트에 환자의 혈청을 첨가하는 단계, 상기 솔리드 서포트에 검출자 항체를 첨가하는 단계를 포함하는 자가항체-비만세포 트립테이즈 면역복합체 검출방법을 제공한다.
또 본 발명은 사람 비만세포 트립테이즈에 대한 포착자 단일항체 및 검출자로서 알카라인 포스페테이즈가 부착된 사람 IgG Fc 절편에 대한 단일항체를 포함하는 본 발명의 검출방법에 사용되는 키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 과민증은 자가면역 질병일 수 있고, 이러한 과민증 환자의 혈청에 사람 자가항체-비만세포 트립테이즈 면역 복합체의 존재를 본 발명의 발명자들이 밝혀내어, 결과적으로, 매우 위험한 방사선 동위원소를 사용하지 않으면서, 환자 혈청에서 자가항체-비만세포트립테이즈 면역복합체를 검출할 수 있는 새로운 방법을 제공한다.
이러한 자가항체-비만세포 트립테이즈는 과민증 질병의 면역치료를 위한 효과적인 잠재적인 표식자가 될 수 있다.
따라서, 본 발명은 방사선 동위원소를 사용하지 않고 매우 민감하고 정확하게 사람 항체-비만세포 트립테이즈 복합체를 면역분석하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 환자 혈청에서 사람 자가항체-비만세포 트립테이즈 면역복합체 검출을 위해서 이중 항체-샌드위치 효소-연결 면역흡착 분석에 관련된 것들이다. 본 발명의 ELISA는 포착자 항체들과 검출 항체들로 이루어져 있다. 포착 항체들은 단일 클론항체이고 트립테이즈 특이 항체이어서 사람 혈청에서 트립테이즈 효소만 포착할 수 있으며, 검출항체는 단일클론 항체이면서 사람 IgG 특이 항체이므로 복합체에서 IgG 만을 검출할 수 있다.
이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
실시예1: 사람 비만세포 트립테이즈-자가항체 복합체 ELISA를 위한 키트
1)코팅버퍼: 0.01M Tris 0.12g, 0.15M NaCl 0.88g, 0.05% NaN3 0.1g을 물 100ml에 녹여 pH 8.5로 만들었다.
2) 세척 버퍼: 0.01M HEPES 2.3g, 0.5M NaCl 29.2g, 25mM EDTA 9.21g, 0.1% BSA 1.0g, 0.05% NaN3 0.5g, 0.05% Tween 20 0.5ml를 물 1000ml에 녹여 pH를 7.4로 만들었다.
3) 블러킹버퍼: 0.01M HEPES 2.38g, 0.5M NaCl 29.2g, 25mM EDTA 9.21g, 3% BSA 30g, 0.05% NaN3 0.5g을 물 1000ml에 녹여 pH를 7.4로 만들었다.
4) 결합버퍼: 0.01M HEPES 2.38g, 0.15M NaCl 29.2g, 25mM EDTA 9.21g, 0.1% BSA 1.0g, 0.05% NaN3 0.5g을 물 1000ml에 녹여 pH를 7.4로 만들었다.
5) DEA 버퍼: 디에탄올아민 48.5ml, 염화마그네슘 0.05g, 0.1% NaN3 0.1g을물 500ml에 녹여 pH를 9.8로 만들었다.
6) 사람 비만세포 트립테이즈에 대한 포착자 단일항체; 검출자로서 알카라인 포스페테이즈가 부착된 사람 IgG Fc 절편에 대한 단일항체
본 발명에는 사람 허파 비만세포 트립테이즈를 사용하였다.
실시예 2: 사람 비만세포 트립테이즈-자가항체 복합체 검출방법
1) 상온에서 코팅버퍼 100ul에 포착자 항체 농도(2.5ug/ml)를 첨가하여 96웰 RPO-BIND 플레이트(Nalgen Nunc. Co., USA)에 1시간 반 동안 코팅하였다.
2) 상온에서 블러킹버퍼 200ul로 1시간 동안 블러킹하였다.
3) 증류수로 세척한 후, 트립테이즈 분석을 위해, 100ul의 결합버퍼와 1:1,000 으로 희석된 정상 또는 환자의 혈청을 첨가하였다.
4) 상온에서 1시간(또는 4℃에서 오버나잇)하였다.
5) 세척버퍼로 플레이트를 5회 세척하고, 증류수로 1회 세척한 후 물기를 제거하였다.
6) 100ul의 1:10,000 희석한 알카라인 포스페테이즈 부착된 항체를 첨가한 후 상온에서 1시간 배양하였다.
7) 세척버퍼로 플레이트를 5회 세척하고, 증류수로 1회 세척한 후 물기를 제거하였다.
8) 웰 당 100ul의 p-나이트로페닐 포스페이트 용액(15ml의 DEA 버퍼 당 1알)으로 전개하였다.
9) 37℃에서 배양한 후, 30분과 1시간 간격으로 ELISA 리더에서 흡광도(O.D)를 측정하였다.
그 결과를 도면을 중심으로 설명하면 다음과 같다.
도 1는 즉시형 민감성 환자의 혈청 내 자가항체-비만세포 트립테이즈 면역복합체 검출방법을 도식한 그림이다. 트립테이즈 효소의 단일 항체 표착자를 96 웰 플레이트에 솔리드 서포트한 후 혈청 내 자가항체-비만세포 트립테이즈 면역복합체에 대한 검출은 알카라인 포스페테이즈가 부착된 사람 IgG Fc 절편에 대한 단일항체를 이용하여 검출한다. 즉 이 발명은 샌드위치 엘라이저 (ELISA) 분석 방법을 의미한다.
도 2 는 도 1에서 보여준 샌드위치 ELISA 분석방법을 이용하여 즉시형 민감성 환자의 혈청 샘풀에 정제된 비만 트립테이즈 효소를 첨가하여 경쟁적 반응 관계를 나타낸 그림이다. 즉 정제된 트립테이즈 농도를 증가하면 자가 항체 트립테이즈 면역 복합체의 검출 흡광도가 감소한다. 이는 자가 항체 트립테이즈 면역 복합체와의 결합은 혈청 내 비만 세포 트립테이즈와 경쟁적으로 결합한다.
도 3는 1에서 보여준 샌드위치 ELISA 분석 방법이 류마토이드 인자 ( Rheumatoid factor, RF)의 영향을 나타낸 그림이다. 류마이토이드 인자가 결합자 타입의 분석 방법에 영향을 미치는지를 조사하였다. 본 발명자들은 George Moxley 박사 (미국 버어지아 의과대학 염증학 연구실)로부터 RF 인자( 0 에서 33 단위/ 밀리리터)가 함유된 7 개의 샘플 혈청을 조사하였다. 그 결과 대조구를 제외한 모든 샘플에서는 RF의 존재 여부에 영향을 받지 않았다.
도 4A는 도 1의 샌드위치 ELISA 분석을 최적화 한 후 전신성 민감성에 대한 표식자인 베타-트립테이즈와 자가항체-비만세포 트립테이즈 면역복합체 농도를 비교 분석한 그림이다. 모든 환자의 샘플은 고농도 베타-트립테이즈의 환자로 미국 버어지니아 의과대학 알러지 면역 연구실에서 트립테이즈의 농도 분석을 하였다. 고농도 베타-트립테이즈를 가진 30 명 환자 중 21 샘플은 고농도(1:1,000)의 자가항체-비만세포 트립테이즈 면역복합체가 검출되었다. 또한 고농도의 베타-트립테이즈를 가진 사후 혈청 샘플 중 6 샘플은 역시 고농도 자가항체-비만세포 트립테이즈 면역복합체가 검출되었다. 도5B는 피어슨 상관관계 계수 분석을 나타낸 그림이며 베타-트립테이즈 농도와 자가항체-비만세포 트립테이즈 면역복합체 농도간 유의성이 인정된 바 민감성 질환은 베타-트립테이즈 고농도만으로 진단하는데 문제점이 제기된다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 즉시형 민감성 질환 증상을 가진 환자의 혈청 내 자가 항체-비만세포 트립테이즈 복합체 존재한다는 사실을 발견하였으며 이 면역 복합체를 이용하여 즉시형 민감증 질환을 정확하게 진단하는 키트를 개발하게 되었다. 또 이 발명은 즉시형 민감성 질환 진단 이외에도 트립테이즈와 관련된 특정한 면역성 질병 진단과 치료제 개발하는데 이용 될 수 있다.

Claims (8)

  1. a) 포착자 항체로 솔리드 서포트를 코팅하는 단계;.
    b) 상기 솔리드 서포트를 블러킹하는 단계;
    c) 상기의 솔리드 서포트에 결합버퍼와 환자의 혈청을 첨가하는 단계;
    d) 상기 솔리드 서포트에 검출자 항체를 첨가하는 단계; 및
    e) 상기 항체복합체를 검출하는 단계를 포함하는 자가항체-비만세포트립테이즈 면역복합체 검출방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기의 방법은 세척단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 자가항체-비만세포트립테이즈 면역복합체 검출방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기의 방법은 과민증을 검출하는 방법인 것을 특징으로 하는 자가항체-비만세포트립테이즈 면역복합체 검출방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기의 방법은 이중 항체-샌드위치 효소-연결 면역흡착법인 것을 특징으로 하는 자가항체-비만세포트립테이즈 면역복합체 검출방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기의 포착자 단일항체는 사람 비만세포 트립테이즈에 대한 포착자 단일항체인 것을 특징으로 하는 자가항체-비만세포트립테이즈 면역복합체 검출방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기의 검출자는 알카라인 포스페테이즈가 부착된 사람 IgG Fc 절편에 대한 단일항체인 것을 특징으로 하는 자가항체-비만세포트립테이즈 면역복합체 검출방법.
  7. 사람 비만세포 트립테이즈에 대한 포착자 단일항체 및 검출자로서 알카라인 포스페테이즈가 부착된 사람 IgG Fc 절편에 대한 단일항체를 포함하는 제 1항의 검출방법에 사용되는 키트.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기의 키트는 버퍼를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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