CN110272485A - 超声酸预处理辅助酸酶法提取白鲢鱼鱼皮胶原蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品生物利用领域，涉及超声酸预处理辅助酸酶法提取白鲢鱼鱼皮胶原蛋白的方法；步骤如下：在鱼丸厂中回收下脚料，挑出鱼皮，洗净剪碎冻干后，依次浸泡在NaOH和异丙醇溶液中，除杂蛋白、色素和脂肪；然后，浸泡在乳酸中，放于超声池进行超声酸‑乳酸预处理，再加入胃蛋白酶进行酸酶提取，离心后得到胶原蛋白粗提液，加入NaCl进行盐析，盐析后进行离心，得到沉淀溶解在乙酸溶液中，然后依次使用乙酸溶液和蒸馏水进行透析，经真空冷冻干燥后得到胶原蛋白。本发明主要解决了鱼产品加工生产的下脚料的资源浪费问题，并且克服传统胶原蛋白提取方法提取率低的缺点；本发明透析冻干表征为天然Ⅰ型的胶原蛋白，提取率达到75.8％。
Description
技术领域
本发明属于食品生物利用领域，具体涉及一种超声酸预处理辅助酸酶法提取白鲢鱼鱼皮胶原蛋白的方法。
背景技术
目前，胶原蛋白制备的主要原料是陆生哺乳动物，如猪、牛和鸡的皮或骨，但随着疯牛病、口蹄疫等疾病的爆发和一些宗教的限制，使陆生哺乳动物的胶原蛋白受到安全性质疑和使用限制。相对动物加工和食用习惯而言，水产加工的废弃料较多，更具有资源优势，且水产动物的胶原蛋白更容易受酶、温度、pH等环境条件的影响，即水产胶原蛋白的稳定性相对较低，便于营养、消化、吸收。因而水产动物来源胶原蛋白就成为哺乳动物来源胶原蛋白的理想和现实的替代产品，以水产动物的皮骨为原料提取胶原蛋白成为研究热点。
白鲢鱼是我国四大淡水鱼之一，产量巨大，而在加工过程中，每年近产生17.00万吨的鱼皮等副产物；而这些加工废料中含有大量的胶原蛋白，如果对其提取应用既可以减少环境污染，也可以提高白鲢鱼产品加工的经济效益。
胶原蛋白是一种纤维结构蛋白，是生物体细胞外基质的主要成分。它在维持生物结构的完整性，各种组织的功能方面起着重要作用，它占动物总蛋白的25-30％；在所有的胶原蛋白中，I型胶原蛋白最常见于鱼类和一些哺乳动物，I型胶原蛋白是通过链间甘氨酸和酰胺之间的氢键形成的三螺旋结构。
目前，胶原蛋白提取方法主要有中性盐萃取法、酸提取法、碱提取法、酶提取法和重组DNA提取法等；但是现有文献报道的酸提、盐提、酶提鸡爪皮胶原蛋白，存在提取率较低的问题；还有文献采用酸酶复合法提取鲢鱼鱼鳞胶原蛋白，在60h的提取率为17.15％，依然提取时间过长并且提取效率不高；所以急需一种时间短、提取效率高的胶原蛋白提取方法。
发明内容
本发明的目的是发明一种简单易行的高效的从白鲢鱼产业下脚料鱼皮中提取胶原蛋白的方法，解决鱼产品加工生产的下脚料的资源浪费问题，克服传统胶原蛋白提取方法提取率低的缺点；本发明技术方法简单易行，提取效率高，并且关于酸法，酶法和超声预处理结合提取胶原蛋白的研究方法尚未见报道。
为了实现上述目的，本发明提供一种超声酸预处理辅助酸酶法提取白鲢鱼鱼皮胶原蛋白的方法，按照下述步骤进行：
(1)原料的预处理：选取鱼皮作为原料，经洗净、剪碎后进行冻干处理，得到冻干鱼皮；然后将冻干鱼皮浸泡在NaOH溶液中，间隔一定时间更换NaOH溶液，浸泡一段时间后用蒸馏水冲洗至pH为中性，过滤后的鱼皮，再次浸泡于异丙醇溶液中进行脱脂，脱脂后在一定温度条件下进行离心，得到预处理后的鱼皮；
(2)把步骤(1)得到的预处理好的鱼皮浸泡在乳酸溶液中，得到混合溶液放入超声池，设置超声功率、超声频率和超声时间，在一定温度条件下进行超声酸预处理；
(3)在步骤(2)超声酸预处理后的混合溶液中加入胃蛋白酶进行酸酶提取，酸酶提取后进行离心，得到上清液，即为胶原蛋白粗提液；
(4)在步骤(3)得到的胶原蛋白粗提液中加入NaCl进行盐析，盐析后进行离心，得到沉淀溶解在乙酸溶液A中，然后依次使用乙酸溶液B和蒸馏水进行透析，经真空冷冻干燥后得到胶原蛋白。
优选的，步骤(1)中所述NaOH溶液的浓度为0.1mol/L；所述冻干鱼皮与NaOH溶液的用量比为1g:25mL；所述间隔的一定时间为2h；所述浸泡一段时间为6h。
优选的，步骤(1)中所述异丙醇溶液的积浓度为10％，所述过滤后的鱼皮与异丙醇溶液的用量比为1g:10mL；所述脱脂的时间为9h，脱脂期间每隔3h更换异丙醇溶液。
优选的，步骤(1)中所述在一定温度条件下进行离心的温度为4℃；所述离心的条件为10000g，30min。
优选的，步骤(2)中所述预处理后的鱼皮与乳酸溶液的用量比为1g:10～60mL；所述乳酸溶液的浓度为0.5M。
优选的，步骤(2)中所述超声处理的温度为4℃；所述超声的功率为60W～300W，超声的频率为20kHz～60kHz，超声的时间为5min～45min。
优选的，步骤(3)中所述胃蛋白酶与鱼皮的用量关系为15U～75U：1g。
优选的，步骤(3)中所述酸酶提取的温度为4℃，时间为12～72h。
优选的，步骤(4)所述加入NaCl进行盐析，NaCl在胶原蛋白粗提液中的终浓度为2.4mol/L；所述盐析的时间为12-18h。
优选的，步骤(4)所述乙酸溶液A的浓度为0.5mol/L，所述乙酸溶液B的浓度为0.1mol/L；所述乙酸溶液B透析的时间为24-30h，蒸馏水透析的时间为48-50h；真空冷冻干燥的时间为48-60h。
胶原蛋白提取率计算：
首先测定步骤(2)得到的胶原蛋白粗提液中胶原蛋白的含量，进一步测定鱼皮原料中胶原蛋白的含量，通过两者的比值计算出胶原蛋白提取率；
胶原蛋白提取率的计算公式为：
本发明的有益效果：
(1)本发明在传统胶原蛋白的提取方法上采用在超声池中进行了超声酸的预处理，再进行酸酶联合提取，使胶原蛋白的提取率有非常明显的提升，并且经过测定得到的胶原蛋白依然可以保持Ⅰ型胶原蛋白的天然结构，且操作简单，绿色，易于放大应用于生产。
(2)本发明利用原料选择鱼丸厂废料，避免了这些下脚料作为廉价饲料甚至直接进行垃圾填埋而造成的资源浪费和环境污染。
(3)本发明提取的胶原蛋白是水产动物胶原蛋白，相比于目前更广泛的陆生哺乳动物的胶原蛋白，水产动物的胶原蛋白没有疯牛病、口蹄疫等疾病的安全隐患和一些宗教的限制，且水产动物胶原蛋白稳定性相对较低，便于营养、消化、吸收。
(4)本发明公开的超声酸预处理辅助酸酶法提取白鲢鱼鱼皮胶原蛋白的提取率达到75.8％，远高于传统方法中胶原蛋白的提取率。
附图说明
图1是对鱼皮进行乳酸提取(ASC)、进行乳酸和胃蛋白酶联合提取(APSC)、进行不同频率超声乳酸预处理辅助乳酸胃蛋白酶提取(UAPSC)的胶原蛋白提取率柱状图。
图2是乳酸提取(ASC)、乳酸和胃蛋白酶联合提取(APSC)、超声乳酸预处理辅助乳酸胃蛋白酶提取(UAPSC)的FTIR图谱。
图3是乳酸提取(ASC)、乳酸和胃蛋白酶联合提取(APSC)、超声乳酸预处理辅助乳酸胃蛋白酶提取(UAPSC)的CD图谱。
图4是乳酸提取(ASC)、乳酸和胃蛋白酶联合提取(APSC)、超声乳酸预处理辅助乳酸胃蛋白酶提取(UAPSC)的UV图谱。
具体实施方式
以下结合具体实例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1：
(1)原料的预处理：
在鱼丸厂的下脚料中回收下脚料，挑出鱼皮，洗净剪碎(1cm×1cm)，冻干后可以直接使用，也可以在-20℃下保存备用；取冻干鱼皮放于0.1mol/L的NaOH溶液，冻干鱼皮与NaOH溶液的质量体积比为1:25；均质搅拌5min后浸泡6h，浸泡期间每2h更换碱液，除杂蛋白和色素；浸泡后用蒸馏水冲洗至pH为中性，过滤后的鱼皮，再次浸泡于异丙醇溶液中进行脱脂，其中过滤后的鱼皮与异丙醇溶液的质量体积比为1:10，脱脂的时间为9h，脱脂期间每隔3h更换异丙醇溶液；脱脂后在4℃条件下、10000g离心30min，得到预处理后的鱼皮；
(2)把预处理后的鱼皮浸泡在浓度为0.5M的乳酸溶液中，其中预处理后的鱼皮与乳酸溶液的用量比为1g:20mL，得到混合溶液，放入超声池，在4℃条件下、设置超声的功率为180W，超声的频率为60kHz，进行超声15min；
(3)超声结束后，将胃蛋白酶加入步骤(2)超声酸预处理后的混合溶液中，加入量按每克鱼皮加入胃蛋白酶30U；然后在4℃下进行酸酶提取48h，得到上清液，即为胶原蛋白粗提液；
(4)在步骤(3)得到的胶原蛋白粗提液中加入NaCl进行盐析，直至NaCl在胶原蛋白粗提液中的终浓度为2.4mol/L；所述盐析的时间为15h；盐析后以8000g离心20min，得到沉淀溶解在0.5mol/L的乙酸溶液中，然后使用0.1mol/L的乙酸溶液透析24h，再经蒸馏水透析48h、真空冷冻干燥48h后得到胶原蛋白。
实施例2：
(1)原料的预处理：
在鱼丸厂的下脚料中回收下脚料，挑出鱼皮，洗净剪碎(1cm×1cm)，冻干后可以直接使用，也可以在-20℃下保存备用；取冻干鱼皮放于0.1mol/L的NaOH溶液，冻干鱼皮与NaOH溶液的质量体积比为1:25；均质搅拌5min后浸泡6h，浸泡期间每2h更换碱液，除杂蛋白和色素；浸泡后用蒸馏水冲洗至pH为中性，过滤后的鱼皮，再次浸泡于异丙醇溶液中进行脱脂，其中过滤后的鱼皮与异丙醇溶液的质量体积比为1:10，脱脂的时间为9h，脱脂期间每隔3h更换异丙醇溶液；脱脂后在4℃条件下、10000g离心30min，得到预处理后的鱼皮；
(2)把预处理后的鱼皮浸泡在浓度为0.5M的乳酸溶液中，其中预处理后的鱼皮与乳酸溶液的用量比为1g:10mL，得到混合溶液，放入超声池，在4℃条件下、设置超声的功率为60W，超声的频率为20kHz，进行超声5min；
(3)超声结束后，将胃蛋白酶加入步骤(2)超声酸预处理后的混合溶液中，加入量按每克鱼皮加入胃蛋白酶15U；然后在4℃下进行酸酶提取12h，得到上清液，即为胶原蛋白粗提液；
(4)在步骤(3)得到的胶原蛋白粗提液中加入NaCl进行盐析，直至NaCl在胶原蛋白粗提液中的终浓度为2.4mol/L；所述盐析的时间为16h；盐析后以8000g离心20min，得到沉淀溶解在0.5mol/L的乙酸溶液中，然后使用0.1mol/L的乙酸溶液透析28h，再经蒸馏水透析50h、真空冷冻干燥50h后得到胶原蛋白。
实施例3：
(1)原料的预处理：
在鱼丸厂的下脚料中回收下脚料，挑出鱼皮，洗净剪碎(1cm×1cm)，冻干后可以直接使用，也可以在-20℃下保存备用；取冻干鱼皮放于0.1mol/L的NaOH溶液，冻干鱼皮与NaOH溶液的质量体积比为1:25；均质搅拌5min后浸泡6h，浸泡期间每2h更换碱液，除杂蛋白和色素；浸泡后用蒸馏水冲洗至pH为中性，过滤后的鱼皮，再次浸泡于异丙醇溶液中进行脱脂，其中过滤后的鱼皮与异丙醇溶液的质量体积比为1:10，脱脂的时间为9h，脱脂期间每隔3h更换异丙醇溶液；脱脂后在4℃条件下、10000g离心30min，得到预处理后的鱼皮；
(2)把预处理后的鱼皮浸泡在浓度为0.5M的乳酸溶液中，其中预处理后的鱼皮与乳酸溶液的用量比为1g:60mL，得到混合溶液，放入超声池，在4℃条件下、设置超声的功率为300W，超声的频率为60kHz，进行超声45min；
(3)超声结束后，将胃蛋白酶加入步骤(2)超声酸预处理后的混合溶液中，加入量按每克鱼皮加入胃蛋白酶75U；然后在4℃下进行酸酶提取72h，得到上清液，即为胶原蛋白粗提液；
(4)在步骤(3)得到的胶原蛋白粗提液中加入NaCl进行盐析，直至NaCl在胶原蛋白粗提液中的终浓度为2.4mol/L；所述盐析的时间为18h；盐析后以8000g离心20min，得到沉淀溶解在0.5mol/L的乙酸溶液中，然后使用0.1mol/L的乙酸溶液透析30h，再经蒸馏水透析50h、真空冷冻干燥60h后得到胶原蛋白。
实施例1中胶原蛋白提取率计算：
A、标准曲线的制作：配制0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、2.5μg/mL、3μg/mL的羟脯胺酸标准液，蒸馏水做为空白，测定558nm波长下不同浓度标准液的吸收值，进而构建羟脯胺酸含量与吸光值标准曲线；
B、步骤(2)得到的胶原蛋白粗提液中胶原蛋白含量的测定：取胶原蛋白粗提液与6mol/L盐酸混合，置于安瓿瓶，其中胶原蛋白粗提液与盐酸的体积比为1:4；然后，在110℃油浴条件下水解24h，得到水解物；待冷却后水解物用滤纸过滤，上清液分别用10mol/L和1mol/L的NaOH调节pH为6.0；得到样液；取1mL样液定容到50mL容量瓶中，得到样液稀释液，然后取样液稀释液4mL于10mL比色管中，加入2mL氯胺T溶液(1.41g氯胺T用100mL缓冲溶液溶解；缓冲溶液配制为：13g一水柠檬酸，7gNaOH，39g无水乙酸钠，125mL正丙醇，用水定容至500ml)，混合后于室温下放置20min；再加入2mL显色剂(用10g对二甲氨基苯甲醛，用35mL质量分数为60％的高氯酸溶液溶解，缓慢加入65mL异丙醇，现用现配)于比色管中，充分混合，将比色管盖上盖迅速放入60℃水浴中，加热20min；取出比色管，用流动水冷却至少3min，同法用水制备空白，以扣除了空白的标准工作液的吸光度为纵坐标，记录558nm吸光度值；代入上述步骤构建的标准曲线，计算出胶原蛋白的含量；
C、鱼皮原料中的胶原蛋白含量测定步骤同步骤B，区别是用鱼皮原料代替胶原蛋白粗提液直接与6mol/L盐酸混合；此时的鱼皮用量与步骤(2)中使用的鱼皮质量相同，测定鱼皮原料中胶原蛋白的含量；
最后进行胶原蛋白提取率的计算：
通过计算得出，提取胶原蛋白占原料所含胶原蛋白的75.8％。
图1是对鱼皮进行乳酸提取(ASC)、进行乳酸和胃蛋白酶联合提取(APSC)、进行超声乳酸预处理辅助乳酸胃蛋白酶提取(UAPSC)的胶原蛋白提取率柱状图；其中UAPSC(20kHz)、UAPSC(40kHz)和UAPSC(60kHz)分别是在20kHz、40kHz和60kHz条件下超声乳酸预处理辅助乳酸胃蛋白酶提取胶原蛋白的提取率；通过三种方法提取胶原蛋白的的提取率，可以看出当进行60kHz，180W，15min的超声-乳酸预处理后，胶原蛋白的提取率可达到75.8％，显著高于乳酸提取和乳酸-胃蛋白酶提取，因此确定60kHz超声酸预处理辅助酸酶提取为胶原蛋白提取的最佳条件。
图2是乳酸提取(ASC)、乳酸和胃蛋白酶联合提取(APSC)、超声乳酸预处理辅助乳酸胃蛋白酶提取(UAPSC)的FTIR图谱；Amide A峰主要是由于N-H键伸缩引起，Amide B峰与CH2不对称延伸振动和-CH2烷基链对光的吸收有关，Amide I峰主要与肽链构型有关，并且此谱带与胶原蛋白的三螺旋结构变化非常敏感，Amide I和Amide II峰的振动频率和胶原蛋白的分子有序度呈正相关，Amide III峰表示C-H键的伸长，说明三种原料都有氢键的存在；可以看出三种方法提取的胶原蛋白都表现出天然Ⅰ型胶原蛋白的特征谱带，证明三种方法提取的胶原蛋白都保留天然Ⅰ型胶原蛋白的结构。
图3是乳酸提取(ASC)、乳酸和胃蛋白酶联合提取(APSC)、超声乳酸预处理辅助乳酸胃蛋白酶提取(UAPSC)的CD图谱；可以看出三种方法提取的胶原蛋白正吸收峰出现在221nm处，负吸收峰出现在198nm处，正负吸收峰的转折点出现在214nm处，这是胶原蛋白在190-260nm范围内的显示的典型光谱，没有出现正吸收峰的消失和负吸收峰的红移，这证明三种方法提取的胶原蛋白都保留天然Ⅰ型胶原蛋白的结构，超声酸预处理和酸酶联合提取并没有破坏胶原蛋白的结构。
图4是乳酸提取(ASC)、乳酸和胃蛋白酶联合提取(APSC)、超声乳酸预处理辅助乳酸胃蛋白酶提取(UAPSC)的UV图谱，都在230nm附近具有最大吸收峰，这是胶原蛋白结构的特征UV谱型；并且三者在280nm附近都具有较小的吸收峰，这表示ASC、APSC和UAPSC都含有少量的芳香族氨基酸，表明三种胶原蛋白的纯度都较高，胶原蛋白都保留天然Ⅰ型胶原蛋白的结构。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
Claims (10)
1.超声酸预处理辅助酸酶法提取白鲢鱼鱼皮胶原蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)原料的预处理：选取鱼皮作为原料，经洗净、剪碎后进行冻干处理，得到冻干鱼皮；然后将冻干鱼皮浸泡在NaOH溶液中，间隔一定时间更换NaOH溶液，浸泡一段时间后用蒸馏水冲洗至pH为中性，过滤后的鱼皮，再次浸泡于异丙醇溶液中进行脱脂，脱脂后在一定温度条件下进行离心，得到预处理后的鱼皮；
(2)把步骤(1)得到的预处理好的鱼皮浸泡在乳酸溶液中，得到混合溶液放入超声池，设置超声功率、超声频率和超声时间，在一定温度条件下进行超声酸预处理；
(3)在步骤(2)超声酸预处理后的混合溶液中加入胃蛋白酶进行酸酶提取，酸酶提取后进行离心，得到上清液，即为胶原蛋白粗提液；
(4)在步骤(3)得到的胶原蛋白粗提液中加入NaCl进行盐析，盐析后进行离心，得到沉淀溶解在乙酸溶液A中，然后依次使用乙酸溶液B和蒸馏水进行透析，经真空冷冻干燥后得到胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的超声酸预处理辅助酸酶法提取白鲢鱼鱼皮胶原蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中所述NaOH溶液的浓度为0.1mol/L；所述冻干鱼皮与NaOH溶液的用量比为1g:25mL；所述间隔的一定时间为2h；所述浸泡一段时间为6h。
3.根据权利要求1所述的超声酸预处理辅助酸酶法提取白鲢鱼鱼皮胶原蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中所述异丙醇溶液的积浓度为10％，所述过滤后的鱼皮与异丙醇溶液的用量比为1g:10mL；所述脱脂的时间为9h，脱脂期间每隔3h更换异丙醇溶液。
4.根据权利要求1所述的超声酸预处理辅助酸酶法提取白鲢鱼鱼皮胶原蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中所述在一定温度条件下进行离心的温度为4℃；所述离心的条件为10000g，30min。
5.根据权利要求1所述的超声酸预处理辅助酸酶法提取白鲢鱼鱼皮胶原蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)中所述预处理后的鱼皮与乳酸溶液的用量比为1g:10～60mL；所述乳酸溶液的浓度为0.5M。
6.根据权利要求1所述的超声酸预处理辅助酸酶法提取白鲢鱼鱼皮胶原蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)中所述超声处理的温度为4℃；所述超声的功率为60W～300W，超声的频率为20kHz～60kHz，超声的时间为5～45min。
7.根据权利要求1所述的超声酸预处理辅助酸酶法提取白鲢鱼鱼皮胶原蛋白的方法，其特征在于，步骤(3)中所述胃蛋白酶与鱼皮的用量关系为15U～75U：1g。
8.根据权利要求1所述的超声酸预处理辅助酸酶法提取白鲢鱼鱼皮胶原蛋白的方法，其特征在于，步骤(3)中所述酸酶提取的温度为4℃，时间为12～72h。
9.根据权利要求1所述的超声酸预处理辅助酸酶法提取白鲢鱼鱼皮胶原蛋白的方法，其特征在于，步骤(4)中所述加入NaCl进行盐析，NaCl在胶原蛋白粗提液中的终浓度为2.4mol/L；所述盐析的时间为12-18h。
10.根据权利要求1所述的超声酸预处理辅助酸酶法提取白鲢鱼鱼皮胶原蛋白的方法，其特征在于，步骤(4)中所述乙酸溶液A的浓度为0.5mol/L，所述乙酸溶液B的浓度为0.1mol/L；所述乙酸溶液B透析的时间为24-30h，蒸馏水透析的时间为48-50h；真空冷冻干燥的时间为48-60h。
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