CN109336966A - 金枪鱼皮胶原蛋白的脉冲超声辅助酶提制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了金枪鱼皮胶原蛋白的脉冲超声辅助酶提制备方法，属于天然蛋白提取技术领域。首先金枪鱼皮的脱脂脱杂蛋白处理；然后在乙酸溶液体系中，采用脉冲超声辅助方法加速用胃蛋白酶酶解胶原蛋白的提取过程；最后脉冲超声结束后，经离心、纯化以及干燥制得螺旋结构Ι型金枪鱼皮胶原蛋白。本发明通过脉冲超声辅助酶提加速胶原蛋白的提取过程，最终制备获得螺旋结构Ι型金枪鱼皮胶原蛋白，操作工艺简单易行，可大大提高金枪鱼皮胶原蛋白的提取率，能耗较低。
Description
技术领域
本发明涉及天然蛋白提取技术领域，特指一种以金枪鱼皮为原料、采用脉冲超声辅助酶解提取胶原蛋白的方法。
背景技术
目前随着国内外金枪鱼消费量的逐年上升，金枪鱼加工量越来越大，加工企业产生大量的金枪鱼皮副产物，却未被充分开发利用。就目前的情况来看，金枪鱼皮等水产品加工下脚料大多被直接丢弃，不仅造成严重的资源浪费而且对环境有污染。因此，研究充分利用金枪鱼皮资源的方法，开发高附加值的产品，既能够进一步提高金枪鱼的经济价值，又能够有效减少资源浪费，对金枪鱼产业链的拓展具有重要意义。
水产动物特别是其鱼皮等加工废弃物中含有十分丰富的胶原蛋白。胶原蛋白是生物体内一种重要的蛋白质，能够支撑和保护机体内脏器官，具有极高的药用价值和营养价值。以金枪鱼皮为原料提取得到的胶原蛋白具备陆生动物源胶原所缺少的许多优点，如低过敏性、低抗原性等，而且可以避免畜禽疾病的影响和宗教禁忌，可在食品、医学、材料等方面广泛应用。
对金枪鱼皮的利用是势在必行，而传统的金枪鱼皮胶原蛋白提取工艺-盐提、酸提、酶提法无法做到资源利用的最大化，存在提取所需时间长且提取效率不高的不足。目前有研究报道采用超声波辅助提取技术提高胶原蛋白提取率，具有一定的优势。超声波可以通过空化产生高剪切力和微气泡来提高表面侵蚀，破碎和传质，提取率高、提取速度快，对提取材料的影响较小，有助于改进水产品资源的生物活性成分的提取。但目前超声促进金枪鱼胶原蛋白提取一般都是采用连续超声，然而，据目前研究的文献报道来看，还未有将先进的脉冲超声模式应用于金枪鱼皮胶原蛋白的制备研究上。
发明内容
为解决上述问题，本发明在金枪鱼皮胶原蛋白酶提制备过程中引进脉冲超声技术，可以充分利用脉冲超声辅助提取短时间、高产量、低温升等显著优点，高效提取热敏生物活性的金枪鱼皮胶原蛋白。
本发明所述的金枪鱼皮胶原蛋白的脉冲超声辅助酶提制备方法，按照下述步骤进行：
(1)金枪鱼皮的脱脂脱杂蛋白处理：将经过4℃解冻、清洗、沥干、切碎等一系列处理的金枪鱼皮与乙醚以1:3(mg/mL)的比例浸泡脱脂72h，并更换乙醚溶剂2次，鱼皮的脂肪残留率为0.12％。将脱脂后的鱼皮与0.25M NaOH溶液以1:30(mg/mL)的比例在4℃下脱杂蛋白3h。用蒸馏水充分洗涤至中性，低温干燥，备用。
(2)脉冲超声辅助酶提金枪鱼皮胶原蛋白：将步骤(1)处理后的鱼皮原料以料液比1:200(mg/mL)浸泡于0.5M乙酸溶液中，于冰浴中均质5min，进行脉冲超声处理，其中频率为28kHz，功率为100～400W，占空比为10％～90％，时间为10～50min。超声结束后加入0.06％(W/V)1800U/g的胃蛋白酶(pH＝2)，4℃酶提48h，于4℃下8000rpm离心45min，上清液即为脉冲超声辅助酶提胶原蛋白的粗提液。
(3)金枪鱼皮胶原蛋白制备：将步骤(2)制得的粗提液加NaCl至0.9M盐析过夜，6000rpm离心20min，所得沉淀溶解在0.5M乙酸中，8000rpm离心45min，所得上清液加NaCl至2.4M盐析过夜，6000rpm离心20min，所得沉淀溶解在0.5M乙酸中，透析3天，真空冷冻干燥获得金枪鱼皮胶原蛋白。
其中步骤(2)中所述的超声功率为：100、200、300、400W，优选为100W。
其中步骤(2)中所述的超声占空比为：10％(1s/9s)、30％(3s/7s)、50％(5s/5s)、
70％(7s/3s)、90％(9s/1s)，优选为70％。
其中步骤(2)中所述的超声时间为：10、20、30、40、50min，优选为40min。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明选取的原料金枪鱼皮为水产品加工下脚料，以其为原料提取胶原蛋白有助于解决金枪鱼副产物鱼皮的浪费问题，有利于金枪鱼产业链的拓展延伸，同时有效提高金枪鱼的经济价值。
(2)本发明在乙酸体系中、在胃蛋白酶和脉冲超声辅助外力的作用下提取胶原蛋白，通过超声波的空化作用和机械振动作用使溶剂分子的运动加快，提升目标产物的提取率；脉冲超声是指提取过程中超声工作时间与间歇时间交替进行，与连续超声相比，减少了反应体系的升温，更加节能，而且超声间隙时间可促进物料分子均化和细胞松弛，加强了介质间的反应。
(3)本发明的金枪鱼皮胶原蛋白的脉冲超声辅助酶提制备方法，操作工艺简单易行，可大大提高金枪鱼皮胶原蛋白的提取率，能耗较低，并保持了胶原蛋白的3股螺旋结构。
附图说明
图1为脉冲超声设备结构图，其中1为超声波探头；2为位置调节器；3为超声波控制器。
图2为本发明实施例14和实施例1制备的金枪鱼皮胶原蛋白SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般都能被本领域普通技术人员理解。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。特此说明，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
图1为本发明使用的脉冲超声设备。该设备配有一台超声波控制器3，可设定超声工作参数(功率、占空比、时间)，控制连接着频率为28kHz的超声探头1，可实现脉冲超声处理。通过位置调节器2固定探头插入样品下的距离为2cm，探头居中。
实施例1：
未经超声处理的酶提金枪鱼皮胶原蛋白制备方法，按照下述步骤进行：
(1)鱼皮在4℃下解冻、清洗、沥干、切碎，脱脂脱杂蛋白，用蒸馏水充分洗涤至中性，低温干燥，备用。
(2)将步骤(1)处理后的鱼皮原料以料液比1:200(mg/mL)浸泡于0.5M乙酸溶液中，于冰浴中均质5min，结束后加入0.06％(W/V)1800U/g的胃蛋白酶(pH＝2)，4℃酶提48h，于4℃下8000rpm离心45min，上清液即为未经超声处理的酶提胶原蛋白的粗提液。
(3)将步骤(2)制得的粗提液加NaCl至0.9M盐析过夜，6000rpm离心20min，所得沉淀溶解在0.5M乙酸中，8000rpm离心45min，所得上清液加NaCl至2.4M盐析过夜，6000rpm离心20min，所得沉淀溶解在0.5M乙酸中，透析3天，真空冷冻干燥获得金枪鱼皮胶原蛋白。
(4)金枪鱼皮胶原蛋提取率的测定：
采用羟脯氨酸法测胶原蛋白提取率，主要包括水解、显色、测量吸光度和制作羟脯氨酸标准曲线等操作步骤。
胶原蛋白提取率(％)计算公式：
式中：C1—按照羟脯氨酸标准曲线推得的鱼皮水解液中羟脯氨酸浓度(mg/mL)；V1—鱼皮水解液最终稀释到的体积(mL)；C2—按照羟脯氨酸标准曲线推得的酶提胶原蛋白水解液中羟脯氨酸浓度(mg/mL)；V2—酶提粗提液离心所得上清液体积(mL)；n—酶提粗提液稀释倍数。
胶原蛋白提取率的具体结果见表1。
实施例2：
不同超声功率处理的酶提金枪鱼皮胶原蛋白制备方法，按照下述步骤进行：
(1)鱼皮在4℃下解冻、清洗、沥干、切碎，脱脂脱杂蛋白，用蒸馏水充分洗涤至中性，低温干燥，备用。
(2)将步骤(1)处理后的鱼皮原料以料液比1:200(mg/mL)浸泡于0.5M乙酸溶液中，于冰浴中均质5min，进行脉冲超声处理，超声处理参数为：频率28kHz；占空比50％(5s/5s)；时间40min；功率100W。超声结束后加入0.06％(W/V)1800U/g的胃蛋白酶(pH＝2)，4℃酶提48h，于4℃下8000rpm离心45min，上清液即为超声辅助酶提胶原蛋白的粗提液。
(3)将步骤(2)制得的粗提液加NaCl至0.9M盐析过夜，6000rpm离心20min，所得沉淀溶解在0.5M乙酸中，8000rpm离心45min，所得上清液加NaCl至2.4M盐析过夜，6000rpm离心20min，所得沉淀溶解在0.5M乙酸中，透析3天，真空冷冻干燥获得金枪鱼皮胶原蛋白。
(4)金枪鱼皮胶原蛋提取率的测定：
采用羟脯氨酸法测胶原蛋白提取率，主要包括水解、显色、测量吸光度和制作羟脯氨酸标准曲线等操作步骤。
胶原蛋白提取率(％)计算公式：
式中：C1—按照羟脯氨酸标准曲线推得的鱼皮水解液中羟脯氨酸浓度(mg/mL)；V1—鱼皮水解液最终稀释到的体积(mL)；C2—按照羟脯氨酸标准曲线推得的酶提胶原蛋白水解液中羟脯氨酸浓度(mg/mL)；V2—酶提粗提液离心所得上清液体积(mL)；n—酶提粗提液稀释倍数。
胶原蛋白提取率的具体结果见表1。
实施例3：
超声处理的超声功率为200W，其余步骤同实施例2；胶原蛋白提取率的具体结果见表1。
实施例4：
超声处理的超声功率为300W，其余步骤同实施例2；胶原蛋白提取率的具体结果见表1。
实施例5：
超声处理的超声功率为400W，其余步骤同实施例2；胶原蛋白提取率的具体结果见表1。
表1不同超声功率对胶原蛋白提取率的影响
| 实施例 | 超声功率(W) | 提取率(％) |
| 对比例(即实施例1) | 不加超声 | 44.19 |
| 实施例2 | 100 | 55.91 |
| 实施例3 | 200 | 54.97 |
| 实施例4 | 300 | 56.12 |
| 实施例5 | 400 | 57.01 |
通过表1中对比实施例1与实施例2-5的胶原蛋白提取率可以发现，与对照相比(不加超声)，不同功率的脉冲超声处理使得胶原蛋白提取率提高了10.78％-12.82％，均使胶原蛋白提取率显著提高，但是不同功率的脉冲超声处理之间没有显著性差异。由上述结果得出，从胶原蛋白提取率来看，一定功率的脉冲超声处理会使胶原蛋白提取率更高，较适宜的超声功率为100W。
实施例6：
不同超声占空比处理的酶提金枪鱼皮胶原蛋白制备方法，按照下述步骤进行：
(1)鱼皮在4℃下解冻、清洗、沥干、切碎，脱脂脱杂蛋白，用蒸馏水充分洗涤至中性，低温干燥，备用。
(2)将步骤(1)处理后的鱼皮原料以料液比1:200(mg/mL)浸泡于0.5M乙酸溶液中，于冰浴中均质5min，进行脉冲超声处理，超声处理参数为：频率28kHz；功率100W；时间40min；占空比10％。超声结束后加入0.06％(W/V)1800U/g的胃蛋白酶(pH＝2)，4℃酶提48h，于4℃下8000rpm离心45min，上清液即为超声辅助酶提胶原蛋白的粗提液。
(3)将步骤(2)制得的粗提液加NaCl至0.9M盐析过夜，6000rpm离心20min，所得沉淀溶解在0.5M乙酸中，8000rpm离心45min，所得上清液加NaCl至2.4M盐析过夜，6000rpm离心20min，所得沉淀溶解在0.5M乙酸中，透析3天，真空冷冻干燥获得金枪鱼皮胶原蛋白。
(4)金枪鱼皮胶原蛋提取率的测定：
采用羟脯氨酸法测胶原蛋白提取率，主要包括水解、显色、测量吸光度和制作羟脯氨酸标准曲线等操作步骤。
胶原蛋白提取率(％)计算公式：
式中：C1—按照羟脯氨酸标准曲线推得的鱼皮水解液中羟脯氨酸浓度(mg/mL)；V1—鱼皮水解液最终稀释到的体积(mL)；C2—按照羟脯氨酸标准曲线推得的酶提胶原蛋白水解液中羟脯氨酸浓度(mg/mL)；V2—酶提粗提液离心所得上清液体积(mL)；n—酶提粗提液稀释倍数。
胶原蛋白提取率的具体结果见表2。
实施例7：
超声处理的超声占空比为30％，其余步骤同实施例6；胶原蛋白提取率的具体结果见表2。
实施例8：
超声处理的超声占空比为50％，其余步骤同实施例6；胶原蛋白提取率的具体结果见表2。
实施例9：
超声处理的超声占空比为70％，其余步骤同实施例6；胶原蛋白提取率的具体结果见表2。
实施例10：
超声处理的超声占空比为90％，其余步骤同实施例6；胶原蛋白提取率的具体结果见表2。
表2不同超声占空比对胶原蛋白提取率的影响
| 实施例 | 超声占空比(％) | 提取率(％) |
| 对比例(即实施例1) | 不加超声 | 44.19 |
| 实施例6 | 10 | 52.50 |
| 实施例7 | 30 | 53.15 |
| 实施例8 | 50 | 59.54 |
| 实施例9 | 70 | 61.64 |
| 实施例10 | 90 | 65.75 |
通过表2中对比实施例1与实施例6-10的胶原蛋白提取率可以发现，与对照相比(不加超声)，不同占空比的脉冲超声处理使得胶原蛋白提取率提高了8.31％-21.56％，特别是占空比50％、70％和90％的脉冲超声处理分别使胶原蛋白提取率提高了15.35％、17.45％和21.56％。经过统计分析得出，较优的超声占空比为70％。
实施例11：
不同超声时间处理的酶提金枪鱼皮胶原蛋白制备方法，按照下述步骤进行：
(1)鱼皮在4℃下解冻、清洗、沥干、切碎，脱脂脱杂蛋白，用蒸馏水充分洗涤至中性，低温干燥，备用。
(2)将步骤(1)处理后的鱼皮原料以料液比1:200(mg/mL)浸泡于0.5M乙酸溶液中，于冰浴中均质5min，进行脉冲超声处理，超声处理参数为：频率28kHz；功率100W；占空比70％(7s/3s)；时间10min。超声结束后加入0.06％(W/V)1800U/g的胃蛋白酶(pH＝2)，4℃酶提48h，于4℃下8000rpm离心45min，上清液即为超声辅助酶提胶原蛋白的粗提液。
(3)将步骤(2)制得的粗提液加NaCl至0.9M盐析过夜，6000rpm离心20min，所得沉淀溶解在0.5M乙酸中，8000rpm离心45min，所得上清液加NaCl至2.4M盐析过夜，6000rpm离心20min，所得沉淀溶解在0.5M乙酸中，透析3天，真空冷冻干燥获得金枪鱼皮胶原蛋白。
(4)金枪鱼皮胶原蛋提取率的测定：
采用羟脯氨酸法测胶原蛋白提取率，主要包括水解、显色、测量吸光度和制作羟脯氨酸标准曲线等操作步骤。
胶原蛋白提取率(％)计算公式：
式中：C1—按照羟脯氨酸标准曲线推得的鱼皮水解液中羟脯氨酸浓度(mg/mL)；V1—鱼皮水解液最终稀释到的体积(mL)；C2—按照羟脯氨酸标准曲线推得的酶提胶原蛋白水解液中羟脯氨酸浓度(mg/mL)；V2—酶提粗提液离心所得上清液体积(mL)；n—酶提粗提液稀释倍数。
胶原蛋白提取率的具体结果见表3。
实施例12：
超声处理的超声时间为20min，其余步骤同实施例11；胶原蛋白提取率的具体结果见表3。
实施例13：
超声处理的超声时间为30min，其余步骤同实施例11；胶原蛋白提取率的具体结果见表3。
实施例14：
超声处理的超声时间为40min，其余步骤同实施例11；胶原蛋白提取率的具体结果见表3。
实施例15：
超声处理的超声时间为50min，其余步骤同实施例11；胶原蛋白提取率的具体结果见表3。
表3不同超声时间对胶原蛋白提取率的影响
| 实施例 | 超声时间(min) | 提取率(％) |
| 对比例(即实施例1) | 不加超声 | 44.19 |
| 实施例11 | 10 | 54.75 |
| 实施例12 | 20 | 58.93 |
| 实施例13 | 30 | 60.22 |
| 实施例14 | 40 | 64.39 |
| 实施例15 | 50 | 65.98 |
通过表3中对比实施例1与实施例11-15的胶原蛋白提取率可以发现，与对照相比(不加超声)，不同时间的脉冲超声处理使得胶原蛋白提取率提高了10.56％-21.79％，随着超声时间的延长，胶原蛋白提取率逐渐升高。经过统计分析得出，较优的超声时间为40min。
根据上述实验结果得出，脉冲超声辅助酶提制备金枪鱼皮胶原蛋白(实施例14)与不加超声的对照(实施例1)相比，胶原蛋白提取率显著提高了20.20％，由此得出，脉冲超声辅助酶提法更有利于提高金枪鱼皮胶原蛋白产量。
将实施例14和对比实施例1制备的胶原蛋白，分别进行了凝胶电泳(SDS-PAGE)实验：
采用5％的分离胶和3％的浓缩胶。将真空冷冻干燥获得的胶原蛋白于0.1M Tris-HCl(1.0％(mg/mL)SDS和3M尿素)中溶解，调节pH至6.8，浓度为0.1％(mg/mL)。然后在溶液中加入样品缓冲液(0.5M Tris-HCl，5％(mg/mL)SDS，30％(V/V)甘油，10％(V/V)β-巯基乙醇，0.04％(W/V)溴酚蓝，pH 6.8)，以体积比1:1混合，100℃下水浴3min，样品溶液处理完成后，用移液枪吸取10μL样品溶液注入垂直电泳槽中，在电压为60V情况下跑电泳直至溴酚蓝的条带到达分离胶的位置，然后用90V电压跑电泳至样品条带分离结束。电泳结束后电泳胶用0.05％(mg/mL)考马斯亮蓝R-250(甲醇:乙酸:水＝5:1:4)染色1h，用5％(V/V)甲醇和7.5％(V/V)乙酸溶液在摇床上脱色12h。
通过图2中对比实施例1与实施例14的胶原蛋白凝胶电泳结果可以发现，脉冲超声处理得到的胶原蛋白与传统酶法提取得到的胶原蛋白都有α链(α1链和α2链)、β链和γ链3条特征泳带，且对应链处所在位置相同，可以判断脉冲超声辅助酶提得到的胶原蛋白和传统酶法得到的胶原蛋白的主要类型皆为Ι型，胶原蛋白分子量在120kDa以上。此外两种方法获得的胶原蛋白的3股螺旋结构保持完整的状态，说明脉冲超声处理不会引起胶原分子的降解。
Claims (7)
1.金枪鱼皮胶原蛋白的脉冲超声辅助酶提制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：
(1)金枪鱼皮的脱脂脱杂蛋白处理：将经过4℃解冻、清洗、沥干、切碎等一系列处理的金枪鱼皮与乙醚以1:3(mg/mL)的比例浸泡脱脂72h，并更换乙醚溶剂2次，鱼皮的脂肪残留率为0.12％；将脱脂后的鱼皮与0.25M NaOH溶液以1:30(mg/mL)的比例在4℃下脱杂蛋白3h；用蒸馏水充分洗涤至中性，低温干燥，备用；
(2)脉冲超声辅助酶提金枪鱼皮胶原蛋白：将步骤(1)处理后的鱼皮原料以料液比1:200(mg/mL)浸泡于0.5M乙酸溶液中，于冰浴中均质5min，进行脉冲超声处理，其中频率为28kHz，功率为100～400W，占空比为10％～90％，时间为10～50min；超声结束后加入0.06％(W/V)1800U/g的胃蛋白酶(pH＝2)，4℃酶提48h，于4℃下8000rpm离心45min，上清液即为脉冲超声辅助酶提胶原蛋白的粗提液；
(3)金枪鱼皮胶原蛋白制备：将步骤(2)制得的粗提液加NaCl至0.9M盐析过夜，6000rpm离心20min，所得沉淀溶解在0.5M乙酸中，8000rpm离心45min，所得上清液加NaCl至2.4M盐析过夜，6000rpm离心20min，所得沉淀溶解在0.5M乙酸中，透析3天，真空冷冻干燥获得金枪鱼皮胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的金枪鱼皮胶原蛋白的脉冲超声辅助酶提制备方法，
其特征在于其中步骤(2)中所述的超声功率为：100、200、300、400W。
3.根据权利要求1所述的金枪鱼皮胶原蛋白的脉冲超声辅助酶提制备方法，
其特征在于其中步骤(2)中所述的超声占空比为：10％(1s/9s)、30％(3s/7s)、50％(5s/5s)、70％(7s/3s)、90％(9s/1s)。
4.根据权利要求1所述的金枪鱼皮胶原蛋白的脉冲超声辅助酶提制备方法，
其特征在于其中步骤(2)中所述的超声时间为：10、20、30、40、50min。
5.根据权利要求2所述的金枪鱼皮胶原蛋白的脉冲超声辅助酶提制备方法，
其特征在于其中步骤(2)中所述的超声功率为：100W。
6.根据权利要求3所述的金枪鱼皮胶原蛋白的脉冲超声辅助酶提制备方法，
其特征在于其中步骤(2)中所述的超声占空比为：70％(7s/3s)。
7.根据权利要求4所述的金枪鱼皮胶原蛋白的脉冲超声辅助酶提制备方法，
其特征在于其中步骤(2)中所述的超声时间为：40min。
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