CN1402736A - 胶原 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新的胶原产品、该胶原产品的生产方法以及一种新的检测蛋白质溶液中天然胶原含量的方法。该胶原产品是从冷水鱼的皮肤中提取的。所述的胶原产品含高比例的天然胶原,适合于作为酿造业及葡萄酒制备业中的澄清剂使用。
Description
本发明涉及一种胶原产品以及该产品的生产方法。具体地说,本发明是关于一种从冷水鱼的皮肤中提取的胶原产品,它可和其它物质一起适合作为澄清剂应用于酿造业及葡萄酒制备业中。同时,本发明提供一种检测蛋白质样品中天然胶原含量的方法。
发明背景
胶原产品在多种工业中有广泛的应用。其中之一是作为澄清剂应用于净化和沉淀过程,例如净化酒精饮品如啤酒和葡萄酒。在酒类的发酵过程中,多种颗粒性原料如酵母和蛋白质可悬浮于液体中,需要去除。可将胶原作为澄清剂加入该液体中,通过帮助沉淀该悬浮材料达到净化的目的。
胶原类澄清剂一般是从鱼胶中提取的,它构成了从干鱼漂中制备胶原的非常单纯的来源。该类澄清剂的特性可反映其来源于鱼漂,所使用的鱼漂是从温水鱼如polynemidae家族成员中提取的2,3,4。
胶原的另一个来源是皮肤。人们已经做了大量关于从动物和鱼包括冷水鱼的皮肤中提取胶原的研究(美国专利4,295,894,美国专利5,698,228,美国专利5,162,506,美国专利5,420,248,日本专利4037679,日本专利9-278639,日本专利2-291814,波兰专利312122,俄罗斯专利2139937)。已知的提取胶原的过程涉及多种化学、机械或两者组合的提取方法。用这种方法提取的胶原产品其特性有很大的不同。许多哺乳动物胶原提取技术也适用于从鱼类皮肤中提取胶原。本发明申请者已证实从哺乳动物中制备胶原的许多步骤在鱼类皮肤胶原的制备过程中是非必需的。这些步骤包括化学清洗和提取、过滤、真空过滤和倾析(从沉淀中泻去上面的清液层)以及酶萃取等。因此,建立一种简单的、可省略上述许多步骤的提取方法是非常具有吸引力的。
另外,人们普遍认为,从冷水和深水鱼皮肤中提取的胶原作为澄清剂产品时,其质量不均一、而且质量普遍劣于从鱼胶中获得的胶原。并由此得出结论,冷水和深水鱼皮肤胶原不适于作为鱼胶的替代品1。
本发明申请者现已令人吃惊地证实,从鱼的皮肤、特别是从冷水鱼皮肤中提取胶原是可行的,且该胶原适应于作为澄清剂使用。而且,与从鱼胶中提取的胶原澄清剂相比,申请者所提取的胶原产品其特性不同且更具优越性。
因此,本发明提供了胶原产品,它适合与其它物质一起作为澄清剂使用。
因此,本发明的一个目的是提供一种适应于作为澄清剂使用的胶原产品,或至少是为公众提供一种可行性选择。
本发明的另一个目标是提供一种从冷水鱼皮肤中提取胶原的简单的或可选择的方法。
胶原被认为是一种非常难以进行定量的蛋白质,且操作昂贵,这是由于大多数胶原不溶于水的特性。然而,对于多种产品例如卫生保健产品的推广应用来说,可溶性是一种关键的功能性特性5。申请者也证实,天然胶原分子的构型决定其分子功能,明胶变性转化为随意卷曲的构型时,可导致其澄清功能的明显丧失。
已知大量方法可用于检测胶原的浓度。包括测定羟脯氨酸(该蛋白质所特有)的含量6、复杂的凝胶电泳和/或高压液相色谱技术(HPLC)(要求样品具可溶性)测定,凯氏定氮法,和旋光测定法7。这些方法都非常繁琐、费时,而且需要复杂和/或昂贵的仪器。因此,建立一种简单的检测蛋白质样品中天然胶原含量的方法将极具优越性。
申请者意外地发现,冷水鱼皮肤样品中胶原的总含量可用缩二脲法(Gornall等人)9测定,而且其中天然胶原的含量可通过只与天然胶原结合的染料进行定量。将这些检测法结合在一起可提供一种简单、快速的检测样品中天然胶原浓度的方法。
因此,本发明的再一个目的是提供一种检测样品中天然胶原含量的方法,或者至少为公众提供一种有用的选择。
发明概述
在一个实施方案中,本发明提供了一种胶原产品,其中用霍夫曼夫曼(Hofman)法测定时,天然胶原的含量占总蛋白质含量的75%或更多,亚氨基酸含量少于170/1000个氨基酸残基,另外,这符合至少一种以下要求:
(a):在将总固体溶于水中形成大约6mg/ml的溶液中,经过40,000Xg、5C离心30分钟后,上清液中60%以上是可回收,而且
(b):在10C、0.1M醋酸中进行测定时,其特性粘度在13到30dL/g之间。
“天然胶原”是指三肽原胶原,它由三股α-肽链组成,主要以天然可溶性状态存在。
便利的是,当固体溶于水中形成浓度范围在2-10mg/ml的溶液,将其在5C、40000Xg离心30分钟后,60%以上的蛋白质仍留在上清液中。
在一个进一步的实施方案中,本发明所提供胶原产品,它可通过添加一种防腐剂稳定一种糊状物而获得,所述的糊状物是以下预稳定步骤的产物:
(i):将已剔除所有残留的肉、脂肪以及色素的冷水鱼皮肤进行膨胀,所述的膨胀包括将所述的皮肤与某种酸溶液接触适当的时间,并且
(ii):不将上述已膨胀的鱼皮进行干燥,而将其进行匀浆形成一种糊状物
以上所有的步骤均在作为鱼皮来源的冷水鱼的热溶解温度(Tm)以下的温度进行操作。
本发明中所指的“冷水鱼”是指具有一种包含亚氨基酸含量低于170/1000个氨基酸残基,和/或Tm低于20℃的蛋白的皮肤的鱼类。该类鱼包括新西兰hoki(也称作blue grenadier)、大西洋鳕鱼、阿拉斯加鳕鱼、箭齿比目鱼、太平洋whiting、南非鳕鱼、南美鳕鱼、南美Hoki、lingcod以及鲑鱼。
作为优选,步骤(i)中所述的鱼皮是未干燥的。
作为优选,所述的鱼皮中所有残留的肉、脂肪、色素都需通过机械清除方法予以剔除,剔除方法如磨或刮方法。剔除所有残留的肉、脂肪以及色素的最佳方法是将其在水中翻转磨擦,或用喷水器去除。脂肪以及色素的最佳方法是将其在水中翻转磨擦,或用喷水器去除。
便利地,将所述的鱼皮与浓度不低于0.5M的所述的酸溶液接触至少30分钟。
优选的酸溶液可选择醋酸、柠檬酸以及酒石酸,尽管也可使用无机酸。
作为优选,所述的鱼皮与所述的酸溶液接触的比例范围是10-200克鱼皮/每升酸溶液。
作为优选,上述方法中,在将其进行稳定之前,糊状鱼皮匀浆物需在低于15℃,最好是低于12℃的温度下放置至少30分钟。
作为优选,所述的防腐剂是粮食生长防腐剂,如亚硫酸盐、抗菌有机酸或其盐类(如山梨酸酯、醋酸以及乳酸)。
所述的稳定糊状物需在12℃或低于12℃的条件下保存,也可干燥保存。
在一个更进一步的实施方案中,本发明提供了一种从鱼皮中提取蛋白质的方法,其中所述的蛋白主要是天然胶原,该方法包括提供了一种由主要来自剔除了肉、脂肪以及色素的冷水鱼的鱼皮构成的初始原料、从所述的鱼皮提取蛋白以及使所述的蛋白质复性。
作为优选,所述的鱼皮是未经干燥的。
在更进一步的实施方案中,本发明提供了一种制备稳定糊状物的方法,它包括在糊状物中添加某种防腐剂,所述的糊状物可由以下的预稳定步骤获得:
(i):将已剔除所有残留的肉、脂肪以及色素的冷水鱼皮肤进行膨胀,所述的膨胀包括将所述的鱼皮与某种酸溶液接触适当的时间:并且
(ii):不使所述已膨胀的鱼皮干燥,将其进行匀浆以形成一种糊状物,
以上所有的步骤均在作为鱼皮来源的冷水鱼的热溶解温度(Tm)以下的温度进行操作。
作为优选,所述的鱼皮是未经干燥的。
同时,鱼皮的膨胀过程优选用有机酸,时间至少30分钟。
在进一步的实施方案中,本发明提供一种制备胶原产品的方法,其中至少75%的总蛋白是天然的胶原形式,所述的制备方法包括以下步骤:
(i):通过一种机械清洗方法剔除鱼的鱼皮中所有残留的肉、脂肪以及色素;
(ii):使所述鱼皮与某种酸溶液接触一段合适的时间使其膨胀;
(iii):将已膨胀的鱼皮匀浆以形成一种糊状物;
(iv):将该糊状物放置一段合适的时间,以使其中的胶原完全膨胀并溶解;并且
(v):加入一种防腐剂以稳定所述的糊状物。
在可选择的方法中,步骤(iii)可在步骤(ii)之前操作。
作为优选,在步骤(iv)中,所述的糊状物需放置至少30分钟。
作为优选,所述的方法还进一步包括以下步骤:
(vi):将稳定的糊状物在低于作为鱼皮来源的鱼的热溶解温度(Tm)以下进行干燥。
在进一步的实施方案中,本发明提供了一种胶原产品,它是由上述定义的方法制备的。
在一个实施方案中,该胶原产品是一种稳定的糊状物状。
在另一个实施方案中,所述的胶原产品是一种干燥的产品。
在进一步的实施方案中,本发明提供一种组合物,它包括以上定义的胶原产品。
在一个实施方案中,所述的组合物是一种食品。
在另一个可替代的实施方案中,所述的组合物是一种药品、营养品或化妆品。
在另外一方面,本发明提供一种澄清酒精饮品以去除其中存在的颗粒状物质的方法,所述的方法包括在所述饮品中加入以上定义的胶原产品。
在另外一方面,本发明提供一种测定一种蛋白质溶液中天然胶原含量的方法,该方法包括:
(a):用缩二脲分析法测定溶液中总蛋白的含量;
(b):通过天狼红染料结合实验测定溶液中天然胶原的含量,以及
(c):通过比较(a)和(b)的结果,得出蛋白质溶液中天然胶原的比值,而且
其中步骤(a)和(b)的操作需在所测试的胶原的热溶解温度以下的温度中进行。
另一方面,本发明提供一种用于测定某样品中天然胶原含量的试剂盒,该试剂盒包括硫酸铜、酒石酸钾钠、和天狼红。
附图说明
本发明已在以上进行了广泛的描述,但本领域熟练技术人员可以理解本发明并不限于此,本发明还包括以下以实施例描述提供的实施方案。另外,可通过以下的附图对本发明有一个更好的理解,其中:
图1显示在10℃测定的冻干的HOKI鱼皮胶原溶于0.1M的醋酸中时,其粘度的降低与浓度的关系示意图。其中,垂直截距表示该hoki鱼皮胶原的特性粘度,数值是20.4dL/克。
图2是表示在0.5M醋酸中,浓度为1mg/ml的hoki鱼皮胶原溶液的粘度对温度的示意图。检测前溶液在指定的温度放置30分钟,粘度用Unbelohde型毛细管粘度计进行测定(model 1,cannon仪器公司,PA,美国)。
图3表示hoki鱼皮胶原在水、0.1M醋酸及0.1M柠檬酸中干性原料溶解后的溶解度(前),以及在50C经40000Xg、30分钟离心后的溶解度(离心后)。
图4显示随可溶性hoki鱼皮胶原浓度的增加,澄清剂对麦芽酒的澄清效率在280纳米吸光度降低。(a)显示三种hoki胶原制备方法分别为冻干的原料溶于0.1M柠檬酸和糊状物溶于0.1M柠檬酸和0.1M醋酸。(b)冻干的hoki鱼皮胶原在最终用冷却的葡萄酒稀释之前,先以10mg/ml的浓度溶于冷却的0.1M柠檬酸。
图5从左到右依次为对照(25mg/L的鱼胶)、hoki鱼皮胶原(10mg/L)和未经处理的啤酒。
图6从左到右依次为对照(20mg/L的鱼胶)、未经处理的麦芽汁和hoki鱼皮胶原(20mg/L)。
图7显示与一种市售鱼胶产品(对照)相比,hoki鱼皮胶原的澄清效果。hoki鱼皮胶原加入未澄清的啤酒的浓度是12mg/L,而对照的浓度是22mg/L。
图8显示用hoki鱼皮胶原或用市售鱼胶产品(对照)澄清啤酒时,其透明度和稳定性的比较。放置1个月和2个月后,在900C和250C趋散(scatter)的混浊度(EBC单位)。hoki鱼皮胶原在未澄清的啤酒中的浓度是12mg/L,对照浓度是22mg/L。
图9是应用包括hoki鱼皮胶原在内的4种澄清剂的澄清实验中麦芽酒的口感分析。当应用hoki鱼皮胶原作为澄清剂时(浓度为0.03g/L的hoki鱼皮胶原,分析前在100C保存96小时),酒的水果味增加,涩味降低。
图10是hoki鱼皮胶原溶于0.1M醋酸后,用缩二脲法测定蛋白质含量的标准曲线。
图11a在100C条件下,hoki鱼皮胶原对天狼红染料的沉淀效果(□),如图所示,在540纳米吸光度值降低。
图11b当在检测(◇)前将hoki鱼皮胶原加热至30℃进行10分钟时,其定量沉淀染料的功能的丧失。
图12a是用天狼红F3BA染料结合法测定不同温度(□)下的hoki胶原在溶液中的浓度。每个数值是5次测定的平均值。
图12b是将hoki胶原溶于0.5M醋酸中形成1mg/L的溶液,在不同温度时粘度的变化曲线,每个数值取3次粘度检测的平均值。
发明描述
如上所述,本发明的出发点是一种胶原产品,该胶原产品可应用于饮料、食品、化妆及卫生保健行业中。
申请者的主要发现是:可以以一种方式从冷水鱼的皮肤中提取胶原,且这样提纯获得的胶原产品具有优越的性能。这些优越的性能使该胶原产品特别适应于多种应用,其中包括在澄清饮品如啤酒和葡萄酒中的用途。
其中所获得的鱼皮适合用作本发明提取方法中初始原料的冷水鱼包括新西兰hoki(也称作blue grenadier)、大西洋鳕鱼、阿拉斯加鳕鱼、箭齿比目鱼、太平洋whiting、南非鳕鱼、南美鳕鱼、南美Hoki、lingcod以及鲑鱼。尽管如此,以上所列的种类无排它性,不应被理解为限制性。
本发明的胶原产品的一个主要特性是总蛋白质中,至少75%是天然胶原,存在的天然胶原的比例是用霍夫曼检测法测定的。
所谓霍夫曼检验法是指两种检验法的新结合,用来测定含天然胶原的蛋白质溶液的相对比例。特别地说,溶液中总蛋白是用缩二脲反应测定的,即利用一种铜复合物测定其中肽键的数量,而天然胶原的含量是利用天狼红染料与天然胶原分子定量结合以及引起胶原分子从溶液中沉淀的能力来测定的。
申请者证实,缩二脲反应法对用6mg/ml浓度的冻干鱼皮胶原进行测定时,可获得线性标准曲线。简言之,将0.5ml样品(1-5mg/ml蛋白质)加到2.5ml缩二脲试剂中(0.006M硫酸铜,0.02M酒石酸钾钠溶于强NaOH溶液中),混匀,20分钟后测540纳米处的吸光度。吸光度值用hoki鱼皮胶原的标准曲线(0-5mg/ml蛋白质)进行校正,可获得总蛋白量。
申请者进一步证实,用天狼红的染料结合实验只与天然胶原分子结合,可应用于检测0.05-65μg范围内的胶原。将5-60μg蛋白质溶于100μl 0.5M醋酸所形成的溶液中,加入1.0ml天狼红溶液(50μM天狼红溶于0.5M醋酸),30分钟后,将样品以11,000Xg离心,取上清液测定540纳米的吸光度值。吸光度值用溶于0.5M醋酸中的5-65μg胶原的标准曲线进行校正。
通过将缩二脲法和染料结合法结果进行比较,可得到天然胶原在蛋白溶液中的相对比例。
所有的操作均在低于该胶原的热溶解温度(Tm)的温度下进行。Tm是一个检测可溶性胶原分子转化成为变性的胶原链或明胶的指标,被定义为在30分钟内半数初始特性粘度消失时的温度。
因此,本项目申请者首次提供一种快速、简便而且可靠的检测蛋白质溶液中天然胶原比例的方法,特别是针对从冷水鱼皮肤获得的胶原。因此,霍夫曼检测法形成本发明的又一方面。
霍夫曼检测法也是用于检测蛋白样品中天然胶原含量的试剂盒的基础。因此,本发明也提供一种适合应用于霍夫曼检验法的的试剂盒,该试剂盒包含分析试剂,有硫酸铜、酒石酸钾钠和天狼红。这些试剂可直接使用。试剂盒中的试剂均分别包装,提供的数量足够做至少一次、最好是数次霍夫曼检验。试剂盒也可进一步包含被检测胶原的标准品。
另外,本发明的胶原产品功能符合参考标准,这些包括在水中的溶解性及特性粘度。
关于溶解性,是指将固体溶于水中形成2-10mg/ml的溶液,在5OC、40000Xg离心处理30分钟后,超过60%是可从上清液中复性的蛋白质。简单地说,胶原产品的可溶性分析是在浓度为4-8mg/ml的范围内进行的,普遍应用的是6mg/ml,其中可回收的蛋白质超过70%。
至于特性粘度,是在10℃时将样品溶于0.1M醋酸,并使用Ubbelohde型毛细管粘度计(model #1,cannon instrument Co,pa USA)测定的,范围是13-30dl/g。
本发明也提供一种可通过添加防腐剂而稳定糊状物的胶原产品。该糊状物的稳定是通过在醋酸溶液中使经过除肉、除脂肪、除色素过程处理的冷水鱼皮肤膨胀而得到的。除肉、除脂肪以及除色素的方法是采用本行业中所知的机械清除方式而实现的,包括磨、刮。剔除肉、脂肪及色素优选的方法是用在水中翻转摩擦或使用喷水器。
酸溶液可采用无机酸,如盐酸或硫酸,但最好是采用有机酸,如醋酸、柠檬酸和酒石酸,但并不仅限于此。一般使用0.05-0.8M的酸溶液,优选浓度为0.1-0.5M。
鱼皮与酸溶液接触的比例是每升酸溶液10-200克鱼皮。该比例取决于所需胶原产品的类型。高浓度的糊状物(5-50毫克胶原/毫升)适合于运输及贮存,而低浓度的(8毫克胶原/毫升和更低)可能更方便于实际应用。
膨胀时间至少应有30分钟,可延长至1到2天,当糊状物在稳定前需要贮存时,膨胀时间甚至可延长至几周。
在一种优选的方法中,糊状鱼皮匀浆物应在低于15℃,最好是低于12℃的条件下放置至少30分钟,或放置几小时、几天或几周的时间。
匀浆过程采用本行业标准技术。所有的操作应在作为胶原来源的冷水鱼属鱼皮的热溶解温度以下的温度进行。这样可避免该胶原产品的变性及功能的丧失。
所添加的防腐剂可使用任何一种适用于食品的防腐剂。这些包括:亚硫酸盐、抗菌有机酸及其盐类,但并不仅限于这些。优选的防腐剂是亚硫酸盐、山梨酸酯、醋酸和乳酸。
鱼皮可以是新鲜的、冷冻的或干燥的。在当前优选的实施方案中鱼皮是未经干燥的鱼皮。
稳定的糊状物与稳定前的糊状物的保存条件是一样的或者是干燥的。干燥过程可采用本行业的已知技术进行。优选的冻干操作是将加热温度控制在该胶原的热溶解温度以下进行。
在另一相关方面,本发明也提供一种根据以上方法,通过在预稳定的糊状物中添加某种防腐剂制备稳定糊状物的方法。
本发明也提供一种从鱼的皮肤中提取蛋白质的过程,这种蛋白质主要为天然胶原。如上所论,初始原材料主要由冷水鱼的皮肤组成。如上所述,这种鱼皮经过了剔除肉类、脂肪以及色素的过程。蛋白质提取是经过将鱼皮在稀酸溶液中膨胀一定的时间而实现。
可使用任何一种以上所指的酸,但优选的是有机酸。提取的过程一般需要至少30分钟,但通常是几小时,甚至是几天时间。溶解于酸中的蛋白质然后可回收成为糊状物。
再次声明,该过程所使用的鱼皮可以是新鲜的、冷冻的或干燥的。在当前的一个实施方案中,优选的是未经干燥的鱼皮。
本发明所提供的胶原产品可从冷水鱼的鱼皮中获得,主要有以下(优选)的操作步骤:
1.原材料
鱼皮可从新鲜或冷冻的鱼经过刮皮手术得到,也可将冻存的鱼皮解冻后使用。
2.清洗
鱼皮需在自来水中经过磨或刮进行机械清洗。残留的肉、脂肪和色素可通过翻转磨擦或用喷水器剔除。这个过程需重复进行,直至鱼皮足够干净为止。这些鱼皮可直接使用,也可冻存或干燥以备后用。
3.膨胀
清洁的鱼皮需在稀有机酸(醋酸、柠檬酸、酒石酸或其它)中浸泡30分钟或更长时间,清洁鱼皮与酸的比例是10-200克/升。
4.粉碎(communition)
膨胀的鱼皮需在一个竖直切割机/混匀器或同类机器中进行匀浆以制备成细的糊状物。
5.提取
细的糊状物需放置一定的时间以使胶原纤维完全膨胀和溶解。
6.贮存
糊状物用可以接受的防腐剂进行稳定,并在12℃以下贮存。可使用的防腐剂是亚硫酸盐、抗菌的有机酸或其盐类(如山梨酸酯、醋酸和柠檬酸)以及其它食品工业的常用防腐剂。
胶原产品可以以稳定的糊状物形式保存,或可以是液体的一部分。也可以以干物形式提供胶原产品,其中,优选的方法包括以下步骤:
7.冻干
溶解后的胶原可在作为鱼皮来源的鱼种的热溶解温度以下进行干燥,以干物产品出售。
在步骤(1)中,优选的机械清洗法是水磨。鱼皮的酸膨胀也可在给定的时间内使用以上所述的任何酸溶液。在步骤(3)中,糊状物一般需放置至少30分钟,经常使用的是几小时到几天。
步骤3和4的顺序也可颠倒。也就是说,粉碎可在膨胀前进行。
很多本行业已知的粉碎技术和设备可作为竖直切割机/混合器的替代品使用。
以上所述的提取步骤5的操作至少需30分钟,优选几小时或几天,这样可使胶原纤维得到充分的膨胀和溶解。
可以选择的冻干步骤也可使用本行业的标准技术,最好使加热温度保持在胶原的热溶解温度以下。
本发明还涉及通过本发明方法产生的胶原产品。该胶原产品可用于制备,也可掺入组合物中,如水状胶体,或应用于医药品、营养品或化妆品。在本行业中已对胶原的这些应用进行了很好的记录。
本发明的另一个方面是提供了一种净化酒精饮品如啤酒或葡萄酒以去除其中的颗粒物质的方法,。就像使用其它已知鱼胶类胶原产品一样,将胶原与饮品混合并放置,可去除酵母细胞和/或饮品中其它的悬浮成分。可使用本发明所提供的胶原产品或糊状物。作为优选,该产品应以糊状物溶于酸,或以冻干的胶原溶于酸。所加胶原的量是0.005至0.5克/升,优选浓度是0.001至0.4克/升,最优选是0.02至0.1克/升。对于啤酒来说,胶原最常用的浓度是0.02至0.1克/升。而对于葡萄酒来说,胶原最常用的浓度是0.01至0.04克/升。
本发明的胶原产品对啤酒和葡萄酒的净化能力都很强。相对于目前应用鱼胶作为澄清剂来说,用本发明的胶原所净化的啤酒其混浊度极低。本发明的胶原产品的作用速度是已知鱼胶胶原产品的至少两倍,并且能清除啤酒及麦芽汁中更多的悬浮物。使用本产品净化的红葡萄酒的颜色更好,而且红、白葡萄酒的香味更柔和,涩度更低,水果香味更浓,保持了香味结构的鞣酸,同时也很好保持了挥发性香味的成分,并降低酒糟的产生。因此,HOKI鱼皮胶原是一种很有用的澄清剂。
本发明可参照以下非限定性实施例得到阐明。
实施例1
从HOKI鱼皮中提取胶原产品
新鲜的HOKI用一种Trio取皮器(Trio,型号FDS-2N取皮器,瑞典)取皮。然后将鱼皮与冰水以1.5公斤鱼皮/1000毫升水的比例加到一种竖直切割机/混合器(Stephan Machinery,NZ)中。该混合物在将速度设定为1的条件下粉碎1分钟,然后通过过滤将鱼皮与废水分离。再将所得的鱼皮与1000-2000毫升冰水一起再次加到竖直切割机/混合器中,该滚动磨擦的过程共重复10次。然后将干净的鱼皮组织(110克)加入到3000毫升冷却的0.1摩尔醋酸中膨胀90分钟。再将该混合物在竖直切割机/混合器(速度设定为1)粉碎2分钟,即可制成一种很细的粘性糊状物,胶原浓度大约是8毫克/毫升。在所有的操作过程中,原料需保持在12℃以下。
所得的糊状物在使用之前可在冷藏条件下(4℃)保存长达12个月,也可当作澄清剂等直接使用。当用作澄清剂时,糊状物在使用前需进行稀释,使其终浓度在1和80ppm之间,终浓度取决于对终产品特性的要求。
可选择的一种方法是将糊状物冻干以生产一种干燥的、耐储存的原料,其湿度含量低于12%。在这种情况下,将糊状物很薄地铺在干燥器盘上,冷冻到零下20℃以下,冻干48小时。通过采用循环自来水(18-20℃)加热干燥器盘来保持干燥过程中的低温。一般来讲,持续干燥期间产品温度保持在0℃以下,这个过程可在干燥开始后约12小时完成。干燥完成后,可将产品通过刮磨从干燥器上移走。然后将干燥的产品用铝箔袋热封进行包装,以备长期保存。每10克湿的干净鱼皮中可生产1.5克干燥的蛋白,该蛋白用霍夫曼法检测,天然胶原含量大于75%。
图1表示通过冻干所获得的HOKI鱼皮胶原的特性粘度。从粘度的降低与浓度的关系可知,该原料在0.1摩尔醋酸中的特性粘度为20.4dL/克(图1)。
图2是对热溶解温度(Tm)的检测结果,HOKI鱼皮胶原的热溶解温度是17.2℃。热溶解温度是一个检测可溶性胶原分子转化成为变性的胶原链或明胶的指标,被定义为在30分钟内半数初始特性粘度消失时的温度。
图3是溶解度的测定结果,表明HOKI鱼皮胶原在水和稀有机酸溶液中具很高的溶解度。例如,离心去除胶质状颗粒后,在浓度大于2-10毫克/毫升范围时,70%以上的蛋白质仍溶解于水中。当使用醋酸或柠檬酸为溶剂时,可得到同样的结果。
简言之,从HOKI鱼皮中提取的冻干蛋白(如上所述)与100毫升溶液混合并搅拌60分钟(8℃),然后将其用一ULTRATUREX混合器(IKA-Laboratechnik,型号T25,德国)进行匀浆,设置为13500rpm、10秒匀浆两次(BURSTS),然后将溶液再震荡48小时(8℃),接着用缩二脲法测定总蛋白含量。并将溶液经40000Xg离心30分钟(5℃)后,用缩二脲法测定上清液中蛋白质含量,以得到溶液中存留的蛋白质的量。
实施例2
应用HOKI鱼皮胶原作为澄清剂制备葡萄酒
将HOKI鱼皮胶原溶解于0.1摩尔冷醋酸或柠檬酸中,不断搅拌直到糊状物或冻干原料溶解,制备成浓度为5毫克/毫升的贮存液。分装的贮存液倒入含50毫升预冷的夏敦埃酒中,并加入到50毫升测量筒中,使终浓度在0(对照)和60ppm之间。同时加入足够的水以保持固定的稀释度。测量筒用封口膜覆盖,并轻轻翻转以使澄清剂与葡萄酒混匀,然后在8℃保存24小时。净化过的葡萄酒接着用WHATMAN 1号滤纸过滤,用去离子水1∶10进行稀释,然后用分光光度计(Univam,型号UV4-100)测定280纳米处的吸光度值,以水作空白对照。
图4(a)和(b)显示随浓度的增加,两种形式的HOKI胶原(糊状物溶解于醋酸和柠檬酸;冻干的胶原溶于醋酸)去除酚醛塑料以及白葡萄酒中与混浊度、苦味、或涩味相关的蛋白质的效率。
实施例3
在酿造业中使用HOKI鱼皮胶原作为澄清剂
引言
使用本发明的胶原产品完成实验室范围的试验及一个50升小罐的初始试验,以探讨其在澄清啤酒和葡萄酒中的应用潜力。该胶原产品为固体和糊状形式。这些试验表明了本产品良好的澄清性能。对50升小罐的试验进行了重复,以判断该产品对啤酒的其它参数,如口感、头晕反应(head rentation)和混浊度稳定性的影响。
概要
试验用产品以12毫克/升的浓度加到未纯化的啤酒中,将其性能与同样比例的对照(Biocon公司(Quest International,NZ)及ABVickers公司(UK)的市售产品)进行比较,发现本发明的胶原产品是一种有效的澄清剂。
结果
HOKI鱼皮胶原用于酿造业中的研究结果
通过实验室及工业试验,发现HOKI鱼皮胶原是一种对啤酒和麦芽酒非常有效的澄清剂。HOKI鱼皮胶原比一些从鱼胶中获得的市售产品效率更高。而且,HCKI鱼皮胶原显示极好的防寒性能、贮存时混浊度稳定性,且对啤酒所致的口感及头晕均无影响。
澄清能力
图5和6显示与市售鱼胶产品(对照)比较,HOKI鱼皮胶原具极强的澄清能力。在这些小范围的试验中,HOKI鱼皮胶原在24小时内可使啤酒和麦芽酒澄清,而对照则需大约两倍的时间。对于啤酒来说,所需HOKI鱼皮胶原的剂量比对照的一半还少。
图7显示大范围的试验结果。其中用HOKI鱼皮胶原处理的啤酒,澄清速度比市售的鱼胶产品快得多,而且能去除更多的悬浮酵母。
净化力及稳定性
图8显示一个贮存试验的结果。其中,用HOKI鱼皮胶原处理的啤酒与对照相比,贮存过程中更澄清、更稳定。贮存2个月后,HOKI鱼皮胶原处理的啤酒其混浊度(90)比对照处理的啤酒低大约70%。
实施例4
应用HOKI鱼皮胶原作为白葡萄酒和红葡萄酒的澄清剂
在白葡萄酒工业中,鱼胶与降低棕色度直接相关。它的这种效果并不导致鞣酸浓度的降低,也不影响葡萄酒的颜色。净化的结果是一种漂亮、清澈、柔和的葡萄酒。鱼胶的最适添加比例范围是0.02-0.1克/升(20-100ppm),产生大约为2%的致密酒糟。
这里,我们显示了用HOKI鱼皮胶原作为红葡萄酒和白葡萄酒的澄清剂的实验结果。HOKI鱼皮胶原显示了与市售胶原一致的效果。尽管如此,由于其更完善的功能特性,HOKI鱼皮胶原具有更多的优越性,包括如PINOT NOIR等浅色红葡萄酒颜色丢失更少,红、白葡萄酒口感的柔和以及对作为香味成分的鞣酸的保留。
从冷水鱼鱼皮所获得的胶原对低温制备的葡萄酒的澄清具更大的优越性,保留了与酒的芳香度有关的不稳定的芳香成分,如sauvignonblanc、reisling以及gwertztraminer。
实验
PINOT NOIR葡萄酒来源于一种桶装样品。将0.2克冻干的HOKI鱼皮胶原溶于33毫升去离子水中,制成0.6% w/v的贮存液,将其搅拌2分钟,放置15分钟使之膨胀,然后再搅拌以得到无可见物的清澈的溶液。所有的操作均重复一次。将该贮存液缓慢加入100毫升葡萄酒中,注入到100毫升容量桶中,容量桶用CO2喷过,可得到以下的终浓度;0,0.01,0.02,0.03,0.04和0.1克/升。使用浓度0.1克/升是为了显示过度使用该试剂澄清的结果。然后用封口膜封好容量桶,轻轻倒转5次混匀,在15℃条件下静置48小时。
然后将样品轻轻倒入两个50毫升离心管中以去除酒糟,再在-10℃以4500rpm离心10分钟。接着将样品用0.45μm滤膜(MilliporeCorp.,USA)真空过滤,并各取10毫升样品以备分光光度法检测。
分光光度法分析
分光光度法分析所采用的葡萄酒颜色参数为(A420nm;测棕色,A520nm;测红色,颜色密度;A420nm+A520nm,彩色;A420nm/A520nm,总酚醛塑料;A280nm-4。)所有的测量用Unicam UV4-100分光光度计进行,用Vision v3.10软件(Unicam,UK)进行操作。
结果
HOKI鱼皮胶原作用后产生一层亮的“绒毛状”酒糟层,很易被打乱,但15℃放置30小时后再次变得致密。这层酒糟层较市售的鱼胶在同样条件下更致密(参考图9)。酒糟层的实际厚度与所加入的试剂的量有关,当加入0.04克/升HOKI鱼皮胶原时,可产生7%的酒糟。观察放置后的葡萄酒可发现,澄清过的葡萄酒纯净度(“亮度”)增加。
用HOKI鱼皮胶原做澄清剂对葡萄酒颜色参数及总酚醛塑料量的影响
表1显示当原料在最合适/实用的范围内使用时,HOKI鱼皮胶原并不明显改变葡萄酒的色泽参数及酚醛塑料含量。也就是说,这是指用作净化的浓度范围是在0.01到0.04之间。当加入0.1克/升的浓度时,420nm和520nm处的吸光度值大大降低,表明HOKI鱼皮胶原在高浓度使用时可改变酚醛塑料的组成和葡萄酒的色泽。这种特性可能在葡萄酒制造者试图降低酒的“棕色度”时有利,尽管可能会同时降低某些红色。同样,可利用高浓度HOKI鱼皮胶原去除酚醛塑料所导致的苦味和涩味。尽管如此,检测中添加任何浓度的HOKI鱼皮胶原都没有明显改变酒的色泽及总酚含量。HOKI鱼皮胶原是一种非常有用的澄清剂,特别是应用于PINOT NOIR酒。
表1.hoki鱼皮胶原处理对pinot noir葡萄酒的作用
蛋白浓度(g/L) | A420nm | A520nm | 颜色密度 | 色泽 | 总酚醛塑料 |
0 | 1.94 | 2.28 | 4.22 | 0.854 | 4.29 |
0.01 | 1.92 | 2.24 | 4.17 | O.857 | 3.65 |
0.02 | 1.91 | 2.22 | 4.13 | 0.863 | 3.98 |
0.03 | 1.92 | 2.24 | 4.17 | 0.857 | 4.63 |
0.04 | 1.92 | 2.23 | 4.15 | 0.859 | 3.91 |
0.1 | 1.80 | 2.09 | 3.89 | 0.858 | 3.67 |
实施例5
霍夫曼检测法在HOKI鱼皮胶原中的应用
介绍
胶原的可溶性是其多种应用中非常重要的一个功能指标。从冷水鱼鱼皮中获得的胶原不仅更可靠,而且具备一些很有趣的功能特性,如在稀酸溶液中的高溶解度以及与胶质状颗粒的高反应能力。
已发现胶原的澄清能力与溶液中的胶原分子数量及大小有关(Leach and Barrett 1967)4。天然胶原分子的构型决定了分子的功能,这是由于明胶在向随机卷曲构型转化时,可导致其澄清功能的大量丧失。因此,如能建立一种简单的不仅能检测溶液中可溶性胶原的含量、而且能对更具功能的天然胶原进行定量的方法,将极具优越性。
更进一步,已发现胶原的可溶性是其应用于多种卫生保健产品时的一个非常重要的功能指标。例如,胶原海绵可用作骨及软骨重塑时的基质,也可用作药物缓释的基质或用作创伤敷料(Chvapil 1979)5。
多数胶原的不溶性特征使其是非常难以定量的蛋白质。用来测定胶原浓度的方法非常昂贵且费时,这些方法包括:测定羟脯氨酸含量、凯氏定氮法、凝胶电泳、色谱法和旋光测定法。因此,有必要建立一种简单、快速的测定总胶原和天然胶原浓度的方法。
实验
胶原的制备:将HOKI鱼皮刮干净,剔除所有粘连的组织和鳞片,并在蒸馏水中进行清洗。然后将鱼皮以1∶42(克/毫升)的比例在0.1M的醋酸中膨胀,用一种食物处理器(Magimix,Australia)进行匀浆,并在8℃放置18小时。将提取物进一步在5℃以10000Xg离心60分钟。在上清液中滴加4.4M的氯化钠溶液,进行稀释,以使氯化钠的浓度成为1.0M。在5℃以8000Xg离心60分钟,将沉淀溶于0.1M的醋酸进行足够的透析(dialysed),然后冻干保存。
总蛋白检测:用缩二脲法测定总蛋白的浓度(Gornall等,1949)9,以HOKI鱼皮胶原作标准。简言之,将1.5克硫酸铜与6.0克酒石酸钾钠溶于500毫升水中,然后加入300毫升10%的氢氧化钠,加水制成1升缩二脲试剂。在2.5毫升缩二脲试剂中加入0.5毫升蛋白样品,将混合物震荡混匀,于室温放置20分钟,然后测定540纳米处的吸光度。
天然胶原的检测:应用天狼红F3BA染料在酸溶液中可定量沉淀胶原的特性来测定溶液中天然胶原的含量(Marotta和Martino 1985)8。天然胶原的测定是将100微升蛋白质溶液(5-65微克蛋白质溶于0.5M醋酸)加入到1.0毫升天狼红F3BA染料中(50M溶于0.5M醋酸)。30分钟后将样品在11600Xg离心8分钟以去除沉淀的胶原,并在540纳米测定上清液的吸光度。
胶原的热变性研究:将HOKI鱼皮胶原溶于0.5M醋酸形成浓度为0.7毫克/毫升的溶液,该样品在10-23℃放置30分钟。加热后,迅速将样品用冰水冷却,样品中天然胶原的浓度采用以上所述的蛋白与天狼红F3BA染料结合的能力进行测定。
欲比较染料结合实验与另一种标准的测量法,我们测定了HOKI鱼皮胶原(1毫克/毫升)在10-25℃加热30分钟的粘度变化。粘度是用一种UBBELOHDE型毛细管粘度仪测量的(型号#1,Cannon InstrumentCo,PA,USA)。
结果
缩二脲法测定总蛋白
我们采用缩二脲法测定了溶液浓度高于0-6mg/ml的hoki鱼皮胶原溶液中总胶原(或总蛋白)的浓度。图10显示hoki鱼皮胶原浓度与缩二脲法所测定的蛋白质含量呈线性关系,所测浓度可高达6mg/ml。缩二脲法不受预处理温度的影响,在该温度时溶液中所有的hoki胶原均变性。
染料结合法检测天然胶原。
图11a显示当胶原溶液在低于胶原热溶解温度(Tm)以下贮存和分析时,天狼红染料可被hoki鱼皮胶原沉淀。图11B显示当hoki胶原在300C加热10分钟时,可丧失与染料的结合能力。
图12显示将样品在指定温度加热30分钟后,用染料结合法(a)和粘度法(b)检测所得到天然胶原浓度的变化。染料结合法反映了当胶原分子变性时从杆状构型转变为球状构型,其粘度的变化。在初始胶原部分向明胶转化的过程中,染料结合实验对初始分子构型变化的敏感度较粘度法稍差。这体现在用染料结合法检测时,转化过程突然发生在18和190C,而粘度法显示此过程逐渐发生于16到200C之间。染料法和粘度法得出的转化温度分别接近于18.50C和17.30C。
检测天然胶原在总蛋白中所占比例的方法
天狼红F3BA染料只与天然胶原分子结合,而不结合变性的胶原分子。因此,结合缩二脲法与染料结合法可对溶液中总胶原(或总蛋白)的含量及天然状态的胶原数量给出特异信息。反过来讲,也可以用来检测溶液中变性胶原的百分比。这对利用胶原的功能性特性的多种工业来讲,是一个极具价值的信息。
我们称这种合并的检测法为“霍夫曼检测法”
在澄清工业中,快速、简便的霍夫曼法有可能建立成一种标准的工业检测法,这是由于对现在市售胶原产品中胶原含量的测定非常困难,而且鱼胶胶原产品的制造商提供的此类信息缺乏一致性。
工业实用性
因此,根据本发明提供了胶原产品,其中它拥有多种优越的功能性能,这些性能表现在其来源(从冷水鱼皮肤获得)及其提取的过程中。
所获得的胶原产品可应用于多种工业中,它们包括食品业、卫生保健业和化妆品工业。
本发明的胶原产品的一个特殊应用是净化酒精饮品,特别是啤酒和葡萄酒。申请者已发现其胶原产品可作为澄清剂使用。更进一步,本产品获得了即使不优越于传统的明胶类澄清剂,也具备同等的效果。
本发明也提供了一种可适用于从冷水鱼皮肤中提取胶原的方法。该方法省略了许多非必需步骤,而这些步骤以往被认为是从哺乳动物和/或鱼类皮肤中提取胶原所必需或重要的操作步骤。因此,这种提取方法简便且易于实施。
霍夫曼检测法及其相关试剂盒也使监测提取过程、产生更有效的纯化方法、对贮存过程中的样品进行监测以及根据需要的说明书生产胶原产品成为可能。
本领域的熟练技术人员将会理解,上述提供的说明仅仅是为了阐述,并且在不背离权利要求保护的范围内可以做某些改变与修正,特别是在制备方法上。
参考文献
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9.Gornall等人,(1949).用缩二脲反应检测血清蛋白。生物化学杂志(J Biol Chem)177:751-766
Claims (37)
1、一种胶原产品,用霍夫曼检测法测定时,其中天然胶原占总蛋白含量的75%或更高,其亚氨酸含量低于170/1000个氨基酸残基,它们进一步附合以下至少一项要求:
(a)将总固体溶于水中形成大约6mg/ml的溶液,经过40000Xg、5℃离心30分钟后,上清液中60%以上的蛋白是可回收的;并且
(b)在10℃并溶于0.1M的醋酸中检测时,其特性粘度在13-30dl/g之间。
2、根据权利要求1所述的胶原产品,其中(a)中总固体溶于水后形成的浓度在2-10mg/ml的溶液中,在40000Xg、5℃离心30分钟后,上清液中60%以上是可回收的蛋白质。
3、根据权利要求1或2所述的胶原产品,其中离心后,上清液中70%以上是可回收的蛋白质。
4、一种通过添加防腐剂稳定糊状物后得到的胶原产品,所述的糊状物是以下预稳定步骤的产物:
(i):使已剔除所有残留的肉、脂肪以及色素的冷水鱼皮膨胀,所述的膨胀包括将所述的鱼皮与某种酸溶液接触适当的时间,并且
(ii):不将上述已膨胀的鱼皮进行干燥,而将其均质以形成一种糊状物以上所有的步骤均在作为鱼皮来源的冷水鱼属的热溶解温度(Tm)以下的温度进行操作。
5、根据权利要求4所述的胶原产品,其中步骤(i)中的鱼皮是未经干燥的。
6、根据权利要求4或5所述的胶原产品,其中所述的残留的肉、脂肪和色素是通过机械清洗过程剔除的。
7、根据权利要求6所述的胶原产品,其中机械剔除过程是在水中翻转磨擦,或用水喷射。
8、根据权利要求4-7中的任一项所述的胶原产品,其中步骤(i)中,将鱼皮与所述的低于0.5M的酸溶液接触至少30分钟。
9、根据权利要求4-8中的任一项所述的胶原产品,其中步骤(i)中所用的酸选自醋酸、柠檬酸和酒石酸。
10、根据权利要求4-9中的任一项所述的胶原产品,其中在步骤(i)中将所述的鱼皮与所述的酸接触的比例是每升酸溶液中溶解10-200g鱼皮。
11、根据权利要求4-10中任意一项所述的胶原产品,其中以糊状存在的均质后的鱼皮,在将其稳定之前,需在低于12C的环境中静置至少30分钟。
12、根据权利要求4-11中任意一项所述的胶原产品,其中所述的防腐剂是一种食物防腐剂。
13、根据权利要求12所述的胶原产品,其中该食物防腐剂选自亚硫酸盐、抗菌有机酸或其盐。
14、根据权利要求13所述的胶原产品,其中所述的有机酸选自亚硫酸盐、山梨酸酯、醋酸和乳酸。
15、根据权利要求4-15中任意一项所述的胶原产品,其中所述的稳定的糊状物是干燥的。
16、根据权利要求4-14中任意一项所述的胶原产品,其中所述的糊状物应在15℃或更低的温度中保存。
17、根据权利要求16所述的胶原产品,其中所述的糊状物应在12℃或更低的温度中保存。
18、一种制备稳定糊状物的方法,它包括以下步骤:
(i):使已剔除所有残留的肉、脂肪以及色素的冷水鱼皮膨胀,所述的膨胀过程包括将所述的鱼皮与一种有机酸溶液接触适当的时间,并且
(ii):不将上述已膨胀的鱼皮进行干燥,而将其均质以形成一种糊状物。
19、根据权利要求18所述的方法,其中步骤(i)的鱼皮是未经干燥的。
20、根据权利要求19所述的方法,其中步骤(i)的鱼皮是干燥的。
21、一种制备胶原产品的方法,其中总蛋白中至少75%是以天然胶原的形式存在的,所述过程包括以下步骤:
(i):通过一种机械清洗方法剔除鱼皮中所有残留的肉、脂肪以及色素;
(ii):将所述的鱼皮与一种有机酸溶液接触一段合适的时间使其膨胀;
(iii):将已膨胀的鱼皮均质以形成一种糊状物;
(iv):将该糊状物放置一段合适的时间,以使其中的胶原完全膨胀并溶解;
22、根据权利要求21所述的一种方法,其中在步骤(iv)中所述的糊状物需放置至少30分钟。
23、根据权利要求21或22所述的方法,其中所述的方法还进一步包括以下步骤:
(vi):加入一种防腐剂以稳定所述的糊状物。
24、一种根据权利要求18-23中任何一项要所述的方法生产的胶原产品。
25、一种根据权利要求24所述的胶原产品,其中所述的产品是以一种稳定的糊状物形式存在。
26、根据权利要求24所述的胶原产品,其中所述的产品是一种干燥的产品。
27、一种组合物,它包括如权利要求1-18中任何一项所述的胶原产品。
28、根据权利要求27所述的组合物,其中所述的组合物是食品添加剂。
29、根据权利要求28所述的组合物,其中所述的组合物是一种医药品、营养品或化妆品。
30、一种净化酒精饮品以去除其中颗粒状物质的方法,该方法包括在所述的液体中添加按权利要求1-18中任何一项所述的胶原产品的步骤。
31、一种从鱼皮中提取蛋白质的方法,所述的蛋白质主要是天然胶原,该方法包括提供一种主要由已被剔除所有肉、脂肪以及色素的冷水鱼皮组成的初始原料,从所述鱼皮中提取蛋白质,并将所述的蛋白质回收。
32、一种测定蛋白质溶液中天然胶原含量的方法,该方法包括:
(a)用缩二脲分析法检测溶液中总蛋白含量;
(b)用天狼红染料结合实验法测定溶液中天然胶原含量;
(c)通过比较a和b的结果,可得出天然胶原在蛋白质溶液中的比例;而且
其中,步骤(a)和(b)是在所测胶原的热溶解温度以下的温度进行操作的。
33、一种根据权利要求32所述的方法,其中所检测的胶原是一种冷水鱼皮胶原。
34、一种根据权利要求33所述的方法,其中步骤(a)和(b)是在20C以下操作的。
35、一种检测样品中天然胶原含量的试剂盒,该试剂盒包括硫酸铜、酒石酸钾钠和天狼红。
36、根据权利要求35所述的试剂盒,其中所述的酒石酸和天狼红溶液可直接使用。
37、一种根据权利要求35或36所述的试剂盒,该试剂盒还进一步包括所测胶原的标准品。
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