CN103776778A - 鱼胶原蛋白提取过程中的定量检测方法及其应用 - Google Patents

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朱志伟
梁健华
曾庆孝
李汴生
张颖洁
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Abstract

本发明属于水产品加工技术领域，公开了一种鱼胶原蛋白提取过程中的快速定量检测方法及其应用。该方法利用乙酸溶液配制胶原蛋白溶液，用天狼猩红染色后，离心，测定上清液的吸光度，对比标准曲线，定量胶原蛋白含量。本发明利用天狼猩红与胶原蛋白的特异性结合，离心后在特定波长540nm条件下通过测定上清液的吸光度，确定胶原含量。本发明通过测定离心后的上清液，不仅节约溶剂，避免溶液及其他试剂对胶原蛋白与天狼猩红形成的特异性物质的影响，且样品回收率在95.7～104.7%之间，满足分析研究的需要；平行样品的变异系数为0.35%，具有很好的稳定性；应用于操作过程中对胶原蛋白的定量，可实现现时现测。

Description

鱼胶原蛋白提取过程中的定量检测方法及其应用
技术领域
本发明属于水产品加工技术领域，特别涉及一种鱼胶原蛋白提取过程中的快速定量检测方法及其应用。
背景技术
鱼鳞（皮）中含有丰富的胶原蛋白，从鱼鳞（皮）中提取胶原蛋白可以充分利用鱼鳞皮废弃物，变废为宝。因此测定提取过程中胶原含量的变化对研究鱼鳞（皮）的功能性及产品性能具有重要的意义。
胶原或胶原蛋白的定量分析有多种方法，对于已知是胶原或胶原蛋白的样品，凯氏定氮法是最可靠的，其次可用双缩脲法、紫外分光光度法、Folin-酚法和考马斯亮蓝G-250染色等。但对于未知是胶原或胶原蛋白的样品，以上方法则不太适合。胶原蛋白含量常规的测定方法是氯胺T氧化法，此法特异、准确，但繁琐、耗时。
发明内容
为了克服上述现有技术的定量胶原蛋白存在检测时间长、繁琐等缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种提取过程中鱼胶原蛋白含量的快速定量检测方法。该方法操作简单、快速，结果灵敏、准确。
本发明的另一目的在于提供上述提取过程中鱼胶原蛋白含量的快速定量检测方法在胶原提取过程中快速定量的应用。特别适用于鱼鳞或鱼皮中胶原蛋白提取过程中的定量测定。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种鱼胶原蛋白提取过程中的快速定量检测方法，利用乙酸溶液配制胶原蛋白待测溶液，天狼猩红染色后，离心，测定上清液的吸光度，对比标准曲线，定量胶原蛋白含量。
上述方法具体包括以下步骤：
（1）以乙酸溶液为溶剂配置胶原标准溶液，得到待测溶液，用天狼猩红染色，离心后收集上清液，沉淀用乙酸溶液复溶，离心再次得到上清液；合并两次上清液，测定在540nm处的吸光度，绘制标准曲线；
（2）样品的测定：取鱼胶原蛋白样品，以乙酸溶液为溶剂配置成饱和溶液，得到待测溶液，用天狼猩红染色，离心后，测定上层清液在540nm处的吸光度，对照标准曲线，定量胶原蛋白含量。
所述乙酸溶液的浓度为0.3～0.8mol/L（0.3～0.8M）。
优选地，所述乙酸溶液的浓度为0.5mol/L。
所述天狼猩红的溶液浓度为65～75mg/L。优选地，所述天狼猩红溶液浓度为69mg/L。
所述用天狼猩红染色具体操作为把天狼猩红溶液加入待测溶液中，混匀，室温静置10～40min染色。
优选地，所用天狼猩红的量为每0.1ml待测溶液添加1mL天狼猩红溶液。
所述的离心指在10000～15000r/min离心30min。
优选地，步骤（1）所述配置胶原标准溶液采用大鼠皮肤I型胶原为胶原标准样品。
上述提取过程中鱼胶原蛋白含量的快速定量检测方法在胶原提取过程中快速定量的应用。特别适用于鱼鳞或鱼皮中胶原蛋白提取过程中的定量测定。
本发明利用天狼猩红与胶原特异性结合，离心后获得红色复合物，在特定波长540nm条件下通过测定上清液的吸光度，确定胶原含量。由于鱼皮鱼鳞中胶原蛋白提取过程工艺的复杂性，及提取液组成的复杂性（提取溶剂、杂蛋白和脂类等）的影响，“天狼猩红与胶原特异性结合”原理在胶原蛋白鱼鳞（鱼皮）提取过程中含量的定量检测中的应用需要通过实验来研究。本发明通过测定离心后的上清液，不仅有利于节约溶剂，且能避免传统方法中复溶沉淀的氢氧化钠溶液对胶原蛋白与天狼猩红形成的特异性物质的影响；再者，本发明优选的天狼猩红染料的溶度为69mg/L，能够提高胶原蛋白定量的准确性；此外，本发明主要应用于操作过程中对胶原蛋白的定量，能实现现时现测的目的。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
本发明的定量测定方法的样品回收率在95.7～104.7%之间，平均回收率为99.8%，足以满足分析研究的需要；平行样品的变异系数为0.35%，测定在给定条件下具有很好的稳定性；因为天狼猩红法只对胶原蛋白产生特异性结合，而对氨基酸没有此特性，因此与羟脯氨酸比色法相比，天狼猩红测定方法结果更为准确；且在胶原提取过程中常使用的蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、白蛋白、卵清蛋白等）及其它试剂（1M NaCl、3M NaCl、1M KCl、0.1M MgCl2、1M KH2PO4、1M K2HPO4、1M(NH4)2SO4、0.1M Tris、0.5M Tris以及0.5MTris＋4M NaCl）等，以及鱼鳞（皮）提取过程中产生的杂蛋白及脂类物质都不会对测定结果产生显著影响，可以用来分析胶原提取过程中含量的变化。
附图说明
图1为胶原蛋白标准曲线图。
图2为不同提取次数对胃蛋白酶提取胶原的影响研究。
图3为不同提取次数对乙酸提取胶原的影响研究。
图4为不同温度下乙酸提取胶原含量的曲线。
图5为不同乙酸浓度提取胶原含量的曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：经胃蛋白酶提取的鱼鳞胶原蛋白含量测定
（1）标准曲线的绘制：胶原标准品（大鼠皮肤I型胶原）用0.5M乙酸溶解，稀释为每100ul含1～300ug胶原的标准溶液。取11份胶原标准溶液，每份0.1mL，胶原含量分别为为1ug、3ug、5ug、10ug、20ug、30ug、50ug、100ug、150ug、200ug和300ug。每份中各加入1ml69mg/L天狼猩红溶液，混匀，室温静置30min，然后以11000r/min离心30min，收集上清液，沉淀用相同浓度的乙酸复溶，以相同条件进行离心得到上清液。合并两次离心上清液，测定上清液在540nm处的吸光度。最后以吸光度为纵坐标，胶原浓度为横坐标，绘制上清液的标准曲线。结果见图1和表1。
（2）将在4℃下经胃蛋白酶提取后的胶原蛋白配置成饱和的0.5M乙酸溶液，取一份样品0.1ml，加入1ml69mg/L天狼猩红溶液，搅匀，室温下静置30min进行染色，离心后，读取540nm处吸光度，查标准曲线，求得对应的胶原浓度。结果见图2。
表1标准胶原样品的浓度和相对应的吸光度值
实施例2：经乙酸提取后的鱼鳞胶原蛋白含量测定
标准曲线绘制同实施例1。
将在4℃下经乙酸提取后的胶原蛋白配置成饱和的0.5M乙酸溶液，按照1:10用量加入69mg/L天狼猩红溶液，搅匀，室温下静置15min进行染色，离心后，读取540nm处吸光度，查标准曲线，求得对应的胶原浓度，结果如图3。
实施例3：鱼鳞在EDTA脱钙过程中胶原蛋白的损失量测定
分别取100mL0.05mol/L、0.10mol/L、0.15mol/L、0.20mol/L和0.25mol/L的EDTA脱钙液与2g鱼鳞胶原蛋白混合，反应120min，按照实施例1的测定步骤用天狼猩红染色的方法测定脱钙后胶原蛋白含量，换算脱钙过程中胶原蛋白的损失量。结果见表2。
表2脱钙过程中胶原蛋白的损失量
Figure BDA0000455403850000042
实施例4：测定不同时间胶原的酸法溶出量，确定实验的提取温度。
精确称取5g鱼鳞2份，脱钙后，以1:10的料液比加入0.5M的乙酸溶液，分别在4℃和30℃的温度下，按照实施例1的天狼猩红的方法测定不同时间胶原的溶出情况，确定最适提取温度，结果见图4。由此可见，本发明方法在室温下即可获得较优的效果，特别适用于现时现测。
实施例5：测定不同时间胶原的酸法溶出量，确定实验最适提取酸浓度。
精确称取5g鱼鳞4份，脱钙后，以1︰10的料液比加入0.2mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L和1.1mol/L的乙酸溶液，按照实施例1的天狼猩红染色方法测定不同时间胶原的溶出情况，确定最适提取酸浓度为0.5mol/L。结果见图5。
由上述实施例可知，本发明的通过乙酸溶液溶出胶原，利用天狼猩红与胶原的特异性结合，通过简单地测定其吸光度即可定量其中胶原含量，简便、快速实现胶原的定量测定，且原胶原溶液体系中多种试剂均对测试结果无显著影响，可广泛应用于各种胶原定量测定中。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种鱼胶原蛋白提取过程中的定量检测方法，其特征在于利用乙酸溶液配制胶原蛋白待测溶液，用天狼猩红染色后，离心，测定上清液的吸光度，对比标准曲线，定量胶原蛋白含量。
2.根据权利要求1所述的鱼胶原蛋白提取过程中的定量检测方法，其特征在于具体包括以下步骤：
（1）以乙酸溶液为溶剂配置胶原标准溶液，得到待测溶液，用天狼猩红染色，离心后收集上清液，沉淀用乙酸溶液复溶，离心再次得到上清液；合并两次上清液，测定在540nm处的吸光度，绘制标准曲线；
（2）样品的测定：取鱼胶原蛋白样品，以乙酸溶液为溶剂配置成饱和溶液，得到待测溶液，用天狼猩红染色，离心后，测定上层清液在540nm处的吸光度，对照标准曲线，定量胶原蛋白含量。
3.根据权利要求1所述的鱼胶原蛋白提取过程中的定量检测方法，其特征在于：所述乙酸溶液的浓度为0.3～0.8mol/L。
4.根据权利要求1所述的鱼胶原蛋白提取过程中的定量检测方法，其特征在于：所述乙酸溶液的浓度为0.5mol/L。
5.根据权利要求1所述的鱼胶原蛋白提取过程中的定量检测方法，其特征在于：所述天狼猩红的溶液浓度为65～75mg/L。
6.根据权利要求1所述的鱼胶原蛋白提取过程中的定量检测方法，其特征在于：所述天狼猩红溶液浓度为69mg/L。
7.根据权利要求1所述的鱼胶原蛋白提取过程中的定量检测方法，其特征在于：所述用天狼猩红染色具体操作为把天狼猩红溶液加入待测溶液中，混匀，室温静置10～40min染色。
8.根据权利要求1所述的鱼胶原蛋白提取过程中的定量检测方法，其特征在于：所用天狼猩红的量为每0.1ml待测溶液添加1mL天狼猩红溶液；所述的离心指在10000～15000r/min离心30min。
9.根据权利要求2所述的鱼胶原蛋白提取过程中的定量检测方法，其特征在于：步骤（1）所述配置胶原标准溶液采用大鼠皮肤I型胶原为胶原标准样品。
10.根据权利要求1～9任一项所述的鱼胶原蛋白提取过程中的定量检测方法在胶原提取过程中快速定量的应用。
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