TWI662131B - 一種米糠脂肪酶的製備方法 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示一種用於米糠脂肪酶的製備方法，包括：萃取步驟及純化 步驟，萃取步驟中，將米糠加入酵素萃取溶液中攪拌，予以離心後得到米糠脂肪酶酵素萃取液，在純化步驟中，將米糠脂肪酶酵素萃取液，加入硫酸銨暨酒精中攪拌，得到米糠脂肪酶純化酵素沉澱。本發明的功效在於，利用硫酸銨及酒精共沉澱進行酵素純化，可以有效地提升米糠脂肪酶製備效率及縮短米糠脂肪酶生產製程，且經過放大規模驗證，證實本發明可以應用於商業化生產米糠脂肪酶。

Description

一種米糠脂肪酶的製備方法
本發明揭示一種用於米糠脂肪酶的製備方法，其包括：米糠脂肪酶的萃取及純化製程，從而取得米糠脂肪酶純化酵素。
台灣年產150~170萬噸稻穀，而米糠佔稻穀總重8~10%，完全碾製成白米可產生12~15萬噸米糠。米糠是稻米加工過程的副產物，稻穀經脫殼後為糙米，糙米再經過部分除糠過程(去除糙米的外皮，亦稱米皮)而成為胚芽米，或經過完整除糠過程最後變成白米。除糠過程除下來的米皮就是所謂米糠。目前台灣米糠多被當作低價動物飼料使用，價格約每公斤6~10元。雖然米糠是種農業廢棄物，但其含有很多營養價值，包括：膳食纖維(佔20~30%，有助血脂維持與腸道健康)、胺基酸組成均衡(蛋白質生物價高達72.6%)、脂肪酸組成均衡(硬脂酸含量低、油酸含量高)、玄米油(即米糠油，可用於高溫油炸、抗氧化、保護心血管)、富含維生素E(幫助油脂抗氧化)、富含維生素B群及礦物質(鎂、磷、鐵、鋅)、植物固醇類(降低人體的膽固醇吸收率)、 阿魏酸(有效清除自由基)、γ-米糠醇(米糠特有，有助促進血液循環)。雖然米糠具有如此多元化之營養價值，但其利用率並不高。
此外，米糠有油脂酸敗的缺點，且容易滋生微生物，所以保存不易。米糠酸敗的原因主要來自於米糠本身含有的一種酵素作用，該酵素稱為脂肪酶(lipase)，米糠脂肪酶主要存在於米皮中，在未與脂肪接觸時並不會產生作用。但是當自米皮碾下成米糠後，會導致脂肪酶與油脂發生接觸，使脂肪酶酵素活性迅速提升，並開始降解脂肪釋放出游離脂肪酸，進而造成油脂氧化性酸敗，最終導致米糠發生酸敗變質(CN 102279166 A)。所以對於米糠而言，脂肪酶的存在不利於米糠保存及後續利用。但是，脂肪酶除了可降解酯鍵釋放出脂肪酸外，它還含有許多酵素活性，例如轉酯化活性，可用於生質柴油製程(Borrelli GM and Trono D.2015,Int.J.Mol.Sci.,16(9)：20774-20840)。與傳統化學反應相比較，脂肪酶的反應條件溫和，並具有良好的受質立體選擇性(可用於藥物製備)，且對環境友善不會造成污染，因此脂肪酶廣泛應用於食品、皮革、醫藥、飼料及清潔等工業領域中。
在工業酵素市場方面，2014年全球市場產值達42億美元(MarketsandMarkets 2015市場報告：Lipase Market by Source(Microbial Lipases,Animal Lipases),Application(Animal Feed,Dairy,Bakery,Confectionery,Others),& by Geography(North America,Europe,Asia-Pacific,Latin America,RoW)-Global Forecast to 2020)，其中脂肪酶約佔整體市場10%(許嘉伊，2007，全球特用酵素市場分析，台灣經濟研究院生物科技產業研究中心)。就脂肪酶市場分析，預估2020年全球市場將達近6億美元，2015~2020年間的年成長率可達6.5%，主要用途為清潔工業及食品工業，主要市場以亞洲最大(亞洲>北美>歐洲>拉丁美洲>其他)。全球知名公司(例如Novozymes/丹麥)以酵素切入工業酵素市場，使用的酵素種類以脂肪酶為主，脂肪酶相關產品有10種(Lipozyme® CALB、Novocor® AD L、Lipozyme® TL 100 L、Resinase® HT、Palatase® 20000 L、Novozym® 51032、Novozym® 435、Lipozyme® TL IM、Lipozyme® RM IM、Grease GuardTM)，產品用途為生物性催化劑及油汙清潔劑，酵素來源為微生物(真菌)及油汙分解菌(Bacillus sp.)。
關於脂肪酶的相關專利，根據搜索指令為「ABST/(lipase and activity)」，於美國專利商標局網站進行檢索所獲得之專利資料，共查獲56件專利，將其依據技術分類後得知，相關專利主要是關於具有「酵素」特性之專利(共24件)，例如具有酵素活性之核酸或多肽序列、酵素 的製備或修飾，以及酵素活性測定等；雖然從結果當中可以搜尋出脂肪酶的用途專利(例如應用在醫藥、發酵或是食品)，但專利數量並不多，醫藥相關者為19件、食品相關者為4件、清潔相關者為3件。在分類過程中，發現許多專利之專利權人為相同機構，故以專利權人進行分類，以得知主要研究脂肪酶之機構，其中Novozymes A/S公司所擁有的專利數量最多，其次為Novozymes,INC.，第三為The Nisshin Oilloi Group。再者於WIPO網站進行檢索所獲得之日本專利資料，主要是關於具有「酵素抑制劑」特性之專利最多(35筆)，其次依序為「含酵素之組合物」(14筆)，「酵素製備」(5筆)，以及「酵素」(4筆)，其中擁有專利最多之機構為UHA MIKAKUTO CO LTD，其次為SUNTORY HOLDINGS LTD。於中國專利商標局網站進行檢索所獲得之專利資料，共14件，主要是關於具有「酵素」特性之專利。在這些脂肪酶相關專利中，脂肪酶來源絕大多數為微生物，製程技術多為基因重組及宿主異源表現酵素。
再者，以米糠脂肪酶進行搜尋，則全世界專利共只有5件(美國專利1件、日本專利1件、PCT專利1件、中國專利2件)，其中1件日本專利(JP 2002-306162 A)與美國專利(US 2004-0235128 A1)相同，所以共只有4件，其中只有2件專利(CN 103642771B及WO 02/101033 A1)與提取具酵素活性的米糠脂肪酶直接相關。
CN 103642771 B揭示一種米糠脂肪酶的粗酶提取及保存方法，該方法包括：第一步進行米糠脫脂作用，按每1g米糠對應3mL正己烷的比例進行，混勻後震盪(170-190rpm)處理25-35分鐘，爾後經過充分過濾將濾渣內米糠顆粒取出，於常溫下放置4-8小時，每1小時攪拌3-4次以使正己烷充分揮發；第二步進行脫脂米糠脂肪酶之提取，將充分乾燥的脫脂米糠顆粒，按每1g脫脂米糠對應8mL蒸餾水的比例進行，混勻後震盪(170-190rpm)處理25-35分鐘，再於低溫下(2-6℃)離心(2,000-4,000rpm)處理25-35分鐘後，取離心上清液即為米糠脂肪酶之粗酶提取液；最後一步進行米糠脂肪酶粗酶保存，將粗酶提取液製成冷乾粉或以含有0.5mM氯化鈣的磷酸緩衝液(50mM,pH7.0)進行保存。相較於傳統磷酸緩衝液研磨提取法，本專利使用蒸餾水震盪法進行米糠脂肪酶的提取，所提取米糠脂肪酶粗酶的比活性較高且純度好，該方法操作簡單且耗時較短。然所得粗酶未進一步進行純化以取得純度較高的脂肪酶。
WO 02/101033 A1揭示一種米糠脂肪酶的純化方法，該方法包括：第一步進行米糠脫脂作用，按每1g米糠對應10mL乙醚的比例進行米糠脫脂；第二步進行脫脂米糠脂肪酶之提取，將脫脂米糠顆粒置入含有1mM EDTA的Tris-HCl緩衝液(10mM,pH7.5)，攪拌處理12小時後， 經多層棉布過濾，所得濾液經離心(3,000×g)處理30分鐘後，取離心上清液即為米糠脂肪酶之粗酶提取液；最後一步進行米糠脂肪酶粗酶提取液之純化，使用octyl-Sepharose管柱(預先以pH7.5的0.01M Tris-HCl緩衝液進行平衡)對米糠脂肪酶粗酶提取液進行純化，並利用0-40%甲醇進行線性梯度溶離(一個溶離液分劃收集量為10mL)，純化米糠脂肪酶存在於較後期溶離出來的溶離液。最終純化倍率為6.8倍，活性回收率為20%。本專利雖可取得純度高的米糠脂肪酶並進行相關詳盡的酵素特性分析，然製程複雜、費時且操作危險(使用乙醚進行米糠脫脂)，專利內容偏向學術研究，不利於商業化生產米糠脂肪酶。
由以上專利整理得知，CN 103642771 B雖揭示一種操作簡單且耗時較短的米糠脂肪酶提取方法，然所得米糠脂肪酶為粗酶，未進一步純化取得純度較佳的脂肪酶；而WO 02/101033 A1雖揭示一種詳細的米糠脂肪酶純化方法，然使用製程複雜、費時且危險(使用乙醚)，不利於商業化生產大量米糠脂肪酶。由此可知，截至目前為止，米糠脂肪酶的大量生產製程技術未近完善，因此，若能發展出具有良好酵素萃取純化效率、簡易操作程序以及低成本之新式米糠脂肪酶製備製程，會是吾人所企望達成的。所以本發明提出之米糠脂肪酶之萃取及純化製程，非常符合專利申請新穎性與進步性特點，具有專利可行性。
因此，本發明的目的在於，提高米糠脂肪酶的萃取及純化效率，進而能利用米糠脂肪酶來進行高值化的酵素相關產品開發。
本發明一種米糠脂肪酶的製備方法，其包括萃取步驟及純化步驟，萃取步驟：將米糠加入酵素萃取溶液中攪拌，予以離心後得到米糠脂肪酶酵素萃取液，純化步驟：將米糠脂肪酶酵素萃取液，加入硫酸銨暨酒精中攪拌，得到米糠脂肪酶純化酵素沉澱。
本發明米糠脂肪酶的製備方法，其中，米糠是未脫脂米糠。
本發明米糠脂肪酶的製備方法，萃取步驟中，米糠：酵素萃取溶液之比例為1：2以上。
本發明米糠脂肪酶的製備方法，萃取步驟中，米糠：酵素萃取溶液之比例為1：4。
本發明米糠脂肪酶的製備方法，萃取步驟中，酵素萃取溶液是含有表面活性劑之蒸餾水。
本發明米糠脂肪酶的製備方法，萃取步驟中，酵素萃取溶液是含有表面活性劑為0.1% Tritonx X-100之蒸餾水。
本發明米糠脂肪酶的製備方法，純化步驟分為兩階段進行，第一階段純化步驟：將米糠脂肪酶酵素萃取液 加入硫酸銨攪拌，得到純化第一階段完成之米糠脂肪酶酵素溶液，第二階段純化步驟：將純化第一階段完成之米糠脂肪酶酵素溶液，加入酒精攪拌後靜置，得到米糠脂肪酶純化酵素沉澱。
本發明米糠脂肪酶的製備方法，其中酒精濃度為20%以上。
本發明米糠脂肪酶的製備方法，其中酒精濃度為50%。
本發明一種米糠脂肪酶的製備方法，其包括萃取步驟及純化步驟，萃取步驟：將米糠加入酵素萃取溶液中攪拌，酵素萃取溶液是含有表面活性劑之蒸餾水，予以離心後得到米糠脂肪酶酵素萃取液，純化步驟：將米糠脂肪酶酵素萃取液，加入硫酸銨中攪拌，得到米糠脂肪酶純化酵素沉澱。
本發明的功效在於，利用硫酸銨及酒精共沉澱進行酵素純化，可以有效地提升米糠脂肪酶製備效率及縮短米糠脂肪酶生產製程，且經過放大規模驗證，證實本發明可以應用於商業化生產米糠脂肪酶。
1‧‧‧萃取步驟
2‧‧‧純化步驟
21‧‧‧純化步驟第一階段
22‧‧‧純化步驟第二階段
本發明之其他的特徵及功效，將於參照圖式的實施方式中清楚地呈現，其中：圖1是本發明之米糠脂肪酶的製備方法的流程示意圖。
圖2是脂肪酶標準品之脂肪酶酵素活性檢量線。
圖3是牛血清白蛋白標準品之蛋白質濃度檢量線(蛋白質濃度分析方法一)。
圖4是牛血清白蛋白標準品之蛋白質濃度檢量線(蛋白質濃度分析方法二)。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。
參閱圖1，本發明一種米糠脂肪酶的製備方法的較佳'實施例，其包括萃取步驟1及純化步驟2。
萃取步驟1：將米糠加入酵素萃取溶液中攪拌，攪拌歷時30-60分鐘，予以離心後得到米糠脂肪酶酵素萃取液，進一步說明的是，酵素萃取溶液是含有表面活性劑之蒸餾水，表面活性劑為0.1% Tritonx X-100。
較佳地，米糠是使用未脫脂米糠，降低進料成本，而米糠：酵素萃取溶液之比例為1：2以上，較佳地比例為1：4。
純化步驟2：將米糠脂肪酶酵素萃取液，加入硫酸銨暨酒精中攪拌，得到米糠脂肪酶純化酵素沉澱。
純化步驟2分為兩階段進行，第一階段純化步驟21：將米糠脂肪酶酵素萃取液加入0-60%飽和濃度硫酸銨攪拌，攪拌歷時30-60分鐘，靜置10分鐘，再予以離心或重力 沉降，得到純化第一階段完成之米糠脂肪酶酵素溶液，第二階段純化步驟22：將純化第一階段完成之米糠脂肪酶酵素溶液，加入酒精攪拌後靜置，得到米糠脂肪酶純化酵素沉澱。
其中酒精的最終濃度為20%以上，更佳地，酒精濃度為50%。
本發明為了簡化取得米糠脂肪酶所進行的萃取步驟1及純化步驟2，並且提高製程效率，申請人經戮力研究結果發現，對米糠施以簡易酵素萃取步驟1，爾後利用硫酸銨及酒精共沉澱進行酵素純化步驟2，可以有效地提升米糠脂肪酶製備效率及縮短米糠脂肪酶生產製程，並利用試驗工廠等級設備，進行米糠脂肪酶製備製程之放大規模驗證。
本發明的功效在於，利用硫酸銨及酒精共沉澱進行酵素純化，可以有效地提升米糠脂肪酶製備效率及縮短米糠脂肪酶生產製程，且經過放大規模驗證，證實本發明可以應用於商業化生產米糠脂肪酶，有效提高米糠脂肪酶的萃取及純化，進而能利用米糠脂肪酶來進行高值化的酵素相關產品開發。
本發明將就下面的實驗例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實驗例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。
《實驗例1：一般實驗方法：》
1.脂肪酶酵素活性分析：
在本實驗例1中，各種酵素活性(0,1.05,2.63,5.25,7.88及10.5 U)的脂肪酶標準品(Lipase from wheat germ-Type I,Sigma L3001)及待測米糠脂肪酶樣品，各取0.1mL加入3.2mL受質溶液(表1，含有受質0.55mM p-nitrophenyl-palmitate)，於35℃震盪反應20分鐘後，於100℃處理5分鐘以中止酵素反應，爾後離心(6,000rpm)處理10分鐘，取離心上清液進行400nm吸光值測定。
以各種酵素活性的脂肪酶標準品之酵素反應400nm吸光值為Y軸、酵素活性為X軸(脂肪酶標準品以15units/mg protein及Protein=70%的條件進行作圖)，製作一條脂肪酶酵素活性檢量線(圖2)。將待測米糠脂肪酶樣品之酵素反應400nm吸光值代入該檢量線，即可求得脂肪酶酵素活性(U)，再將求得酵素活性數值除以0.1(樣品取0.1mL進行酵素反應)，即可得每毫升米糠脂肪酶樣品的酵素活性(U/mL)。
2.蛋白質濃度分析方法一：
在本實驗例1中，使用Pierce TM Microplate BCA Protein Assay Kit(Thermo #23252)進行蛋白質濃度分析，依據此套組分析流程進行。配製不同蛋白質濃度(0,0.125,0.25,0.5,0.75,1,1.5,2mg/mL)的牛血清白蛋白標準品(Bovine serum albumin,BSA)及待測米糠脂肪酶樣品，各取9μL於96孔微孔盤的微孔中央，再加入4μL CRS溶液(Compatibility Reagent Solution)，震盪處理1分鐘後，於37℃反應15分鐘，再加入260μL WR試劑(working reagent)，震盪處理1分鐘後，於37℃反應30分鐘，再於室溫處理5分鐘，進行562nm吸光值測定。
以各種蛋白質濃度的牛血清白蛋白標準品之562nm吸光值為Y軸、蛋白質濃度為X軸，製作一條蛋白質濃度檢量線(圖3)。將待測米糠脂肪酶樣品之562nm吸光值代入該檢量線，即可求得米糠脂肪酶樣品的蛋白質濃度(mg/mL)。
3.蛋白質濃度分析方法二：
在本實驗例1中，各種蛋白質濃度(0,20,40,60,80,100,120,140,160,180,200μg/mL)的牛血清白蛋白標準品(Bovine serum albumin,Sigma A3803)及待測米糠脂肪酶樣品，各取20μL加入200μL染料溶劑(Bio-Rad protein assay_dye reagent concentrate #500-0006)，混合均勻後，於室溫反應5分鐘，進行595nm吸光值測定。
以各種蛋白質濃度的牛血清白蛋白標準品之595nm吸光值為Y軸、蛋白質濃度為X軸，製作一條蛋白質濃度檢量線(圖4)。將待測米糠脂肪酶樣品之595nm吸光值代入該檢量線，即可求得米糠脂肪酶樣品的蛋白質濃度(μg/mL)。
《實驗例2.不同酵素萃取溶液之米糠脂肪酶萃取效能比較：》
本實驗例2使用不同酵素萃取溶液，包括：本發明米糠脂肪酶萃取溶液、中國專利CN 103642771 B萃取溶液及傳統萃取溶液，分別對米糠進行脂肪酶萃取，比較不同酵素萃取溶液之米糠脂肪酶萃取效能。
實驗材料：
1.未脫脂米糠及脫脂米糠製備：
本實驗例2中所使用的未脫脂米糠是購自於聯發碾米工廠(台南，台灣)。關於脫脂米糠製備，首先，將購自於聯發碾米工廠的未脫脂米糠，以一為25%(v/v)的比例加入正己烷中進行脫脂反應，於室溫下攪拌30分鐘，移去上清液後，將脫脂米糠置於濾紙上，並放置於排煙櫃中乾燥60分鐘，而由此所得到的米糠即為脫脂米糠。
2.酵素萃取溶液：
本實驗例2中所使用的酵素萃取溶液包括：蒸餾水(包含有表面活性劑，例如：0.1~1% Triton X-100或SDS(十二烷基硫酸鈉)或Tween 20，本發明米糠脂肪酶萃取溶液)、蒸餾水(中國專利CN 103642771 B之米糠脂肪酶萃取溶液)或50mM磷酸鹽緩衝液(pH 7，含0.5mM CaCl2，傳統米糠脂肪酶萃取溶液)。
實驗方法：
參考中國專利CN 103642771 B的實驗方法，對未脫脂米糠或脫脂米糠進行脂肪酶萃取(CN 103642771 B未對未脫脂米糠進行脂肪酶萃取)。將乾燥之脫脂米糠或未脫脂米糠顆粒，按每1g米糠顆粒對應8mL酵素萃取溶液的比例進行，混勻後震盪(180rpm)處理30-60分鐘，再以離心(3,000×g)處理30分鐘後，取離心上清液即為米糠脂肪酶之酵素萃取液，並對各組酵素萃取液進行脂肪酶酵素活性分析。
實驗結果：
本實驗之脫脂與未脫脂米糠及不同酵素萃取溶液所測得的蛋白質濃度、每毫升脂肪酶酵素活性及比活性，結果比較被顯示於表2。
表2.脫脂與未脫脂米糠及不同酵素萃取溶液所測得之蛋白質濃度、每毫升脂肪酶酵素活性及比活性。
從表2結果可見，當使用米糠為脫脂米糠時，比較三種不同酵素萃取溶液所得米糠脂肪酶萃取液之每毫升脂肪酶酵素活性及比活性。結果發現，以本發明米糠脂肪酶萃取溶液(蒸餾水(包含有0.1% Triton X-100))進行米糠脂肪酶萃取可得最佳之每毫升脂肪酶酵素活性及比活性。與其他兩種酵素萃取溶液相比，本發明酵素萃取溶液所得米糠脂肪酶萃取液之每毫升脂肪酶酵素活性，分別為蒸餾水及磷酸鹽緩衝液萃取溶液所得米糠脂肪酶萃取液的1.6倍及1.7倍；而比活性則分別為1.2倍及1.5倍。
當使用米糠為未脫脂米糠時，比較三種不同酵素萃取溶液所得米糠脂肪酶萃取液之每毫升脂肪酶酵素活性及比活性。結果發現，以本發明米糠脂肪酶萃取溶液配方進行米糠脂肪酶萃取可得最佳之每毫升脂肪酶酵素活性及比活性。與其他兩種酵素萃取溶液相比，本發明酵素萃取溶液所得米糠脂肪酶萃取液之每毫升脂肪酶酵素活性，分別為蒸餾水及磷酸鹽緩衝液萃取溶液所得米糠脂肪酶萃取液的1.6倍及1.8倍；而比活性則分別為1.3倍及1.5倍。
比較脫脂米糠與未脫脂米糠實驗所得米糠脂肪酶萃取液之脂肪酶酵素比活性，結果發現，以本發明米糠脂肪酶萃取溶液進行米糠脂肪酶萃取，不論使用米糠是否經過脫脂處理，皆可萃取得到相同比活性的米糠脂肪酶萃取液；反觀其他兩種酵素萃取溶液，當使用米糠未經過脫脂處理時，則所萃取得到米糠脂肪酶萃取液的比活性會明顯下降或略微下降。
由上述實驗結果可知，本發明米糠脂肪酶萃取溶液萃取米糠脂肪酶的效能，明顯優於中國專利CN 103647771 B萃取溶液及傳統萃取溶液；且不論使用米糠是否經過脫脂處理，本發明米糠脂肪酶萃取溶液皆可達到相同的米糠脂肪酶萃取效能。
《實驗例3.米糠脂肪酶萃取製程之固液比例研究：》
本實驗例3使用米糠與酵素萃取溶液之不同固液比例，對米糠進行脂肪酶萃取，比較不同固液比例進行米糠脂肪酶的萃取效率。主要目的為希望透過提高固液比例，以降低酵素萃取溶液使用量及縮小米糠脂肪酶萃取製程之操作體積。
實驗材料：
1.未脫脂米糠：
本實施例中所使用的未脫脂米糠是購自於聯發碾米工廠。
2.酵素萃取溶液：
本實施例中所使用的酵素萃取溶液為蒸餾水(包含有0.1% Triton X-100，本發明米糠脂肪酶萃取溶液)。
實驗方法：
首先對未脫脂米糠進行脂肪酶萃取，依據米糠與酵素萃取溶液之不同固液比例，各固液比例(米糠：酵素萃取溶液)為1：1、1：2、1：4及1：8，分別取96g、48g、24g及12g米糠顆粒加入96mL酵素萃取溶液，混勻後震盪(180rpm)處理30~60分鐘，再以離心(3,000xg)處理30分鐘後，取離心上清液即為米糠脂肪酶之酵素萃取液。
實驗結果：
本實驗各固液比例之米糠脂肪酶酵素萃取液所測得的蛋白質濃度、每毫升脂肪酶酵素活性、比活性及總活性，結果比較被顯示於表3。
從表3結果可見，當固液比例太高時(固：液=1：1)，會導致米糠回溶液過於黏稠並呈現半凝固狀，使米糠酵素萃取製程無法順利進行。比較其餘三種不同固液比例所得米糠脂肪酶萃取液之每毫升脂肪酶酵素活性、比活性及總活性。結果發現，與原固液比例(1：8)比較，當固液比例提高至1：4時，每毫升脂肪酶酵素活性增加為2.2倍、比活性增加為1.4倍、總活性增加為2倍；而當固液比例提高至1：2時，每毫升脂肪酶酵素活性增加為3.4倍、比活性增加為1.6倍、總活性增加為2.8倍。由米糠使用量及總活性結果判斷，當固液比例提高至1：4時，米糠脂肪酶萃取效率與原製程(固液比例=1：8)相似； 但當固液比例提高至1：2時，則米糠脂肪酶萃取效率較原製程(固液比例=1：8)為差。
由上述實驗結果可知，米糠與酵素萃取溶液之不同固液比例確實會影響米糠脂肪酶酵素萃取的效率，當製程使用的固液比例提高至1：4時，米糠脂肪酶萃取效率與原製程(固液比例=1：8)相似，可有效地降低酵素萃取溶液使用量及縮小米糠脂肪酶萃取製程之操作體積。
《實驗例4.米糠脂肪酶之純化製程研究：》
本實驗例4使用兩種不同的酵素純化方法，對米糠脂肪酶酵素萃取液進行脂肪酶酵素純化，兩種酵素純化方法分別為本發明特有米糠脂肪酶之硫酸銨暨酒精純化法及傳統硫酸銨純化法，比較兩種酵素純化方法進行米糠脂肪酶酵素純化的效率。
實驗材料：
1.未脫脂米糠：
本實驗例4中所使用的未脫脂米糠是購自於聯發碾米工廠。
2.酵素萃取溶液：
本實驗例4中所使用的酵素萃取溶液為蒸餾水(包含有0.1% Triton X-100，本發明米糠脂肪酶萃取溶液配方)。
3.酵素沉澱回溶液
本實驗例4中所使用的酵素沉澱回溶液為50-100mM磷酸緩衝液(pH8.0)。
實驗方法：
首先使用兩種固液比例(1：4及1：8)對未脫脂米糠進行脂肪酶萃取，當使用固液比例為1：4時，取7.5g米糠顆粒加入30mL酵素萃取溶液進行酵素萃取；當使用固液比例為1：8時，取3.75g米糠顆粒加入30mL酵素萃取溶液進行酵素萃取。米糠顆粒與酵素萃取溶液混勻後震盪(180rpm)處理30-60分鐘，再於室溫下離心(3,000×g)處理30分鐘後，取離心上清液即為米糠脂肪酶之酵素萃取液。
對酵素萃取液進行脂肪酶純化，分為實驗組及對照組。對照組使用傳統的硫酸銨純化法，實驗步驟為取25mL酵素萃取液加入9.025g硫酸銨(0-60%飽和濃度硫酸銨)，攪拌混勻30-60分鐘，再以高速離心(12,000×g)處理15分鐘後，取離心沉澱塊即為米糠脂肪酶之對照組純化酵素沉澱。對照組純化酵素沉澱以酵素沉澱回溶液進行酵素沉澱回溶，回溶後即為對照組純化酵素液。
實驗組使用本專利特有的硫酸銨暨酒精純化法，實驗組實驗步驟為取25mL酵素萃取液加入9.025g硫酸銨(0-60%飽和濃度硫酸銨)，攪拌混勻30分鐘(總體積為30mL)，分別加入8mL、13.8mL、21.8mL及33.3mL 95%工業酒精(最終酒精濃度分別為20%、30%、40%及50%)，於室溫下攪拌混勻30分鐘後，靜置10分鐘，再以低速離心(3,000×g)處理10分鐘後，取離心沉澱塊即為米糠脂肪酶之實驗組純化酵素沉澱。實驗組純化酵素沉澱以酵素沉澱回溶液進行酵素沉澱回溶，回溶後即為實驗組純化酵素液。
實驗結果：
本實驗兩種酵素純化方法所製得之純化酵素液，其蛋白質濃度、每毫升脂肪酶酵素活性、比活性及總活性，結果比較被顯示於表4。
從表4結果可見，當固液比例為1：8時，與對照組比較，最終酒精濃度20%、30%、40%及50%實驗組之每毫升脂肪酶酵素活性分別為對照組之0.46倍、0.45倍、0.44倍及1.05倍；比活性分別為對照組之5.67倍、5.55倍、5.45倍及8.23倍；總活性分別為對照組之0.48倍、0.73倍、0.68倍及3.96倍。當固液比例為1：4時，與對照組比較，最終酒精濃度20%、30%、40%及50%實驗組之每毫升脂肪酶酵素活性分別為對照組之0.48倍、0.47倍、0.51倍及1.01倍；比活性分別為對照組之6.35倍、5.72倍、6.28倍及10.07倍；總活性分別為對照組之0.54倍、0.58倍、0.71倍及3.67倍。
由脂肪酶總活性結果進行不同固液比之米糠脂肪酶萃取及純化效率判斷，就對照組而言，固液比例1：4之對照組的脂肪酶總活性為固液比例1：8之對照組的脂肪酶總活性之1.94倍，顯示將固液比例提高至1：4時，其米糠脂肪酶萃取及純化效率與原製程(固液比例=1：8)相似。
由脂肪酶總活性結果進行不同酵素純化法之米糠脂肪酶萃取及純化效率判斷，相較於傳統硫酸銨純化法(對照組)，本發明特有米糠脂肪酶之硫酸銨暨酒精純化法(酒精濃度50%實驗組)的米糠脂肪酶萃取及純化效率明顯較佳，於固液比1：8及1：4情況下，酒精濃度50%實驗組之米糠脂肪酶總活性分別為對照組之米糠脂肪酶總活性的3.96倍及 3.67倍。然而，當酒精濃度<50%時(酒精濃度20%、30%及40%實驗組)，則其米糠脂肪酶總活性較對照組之米糠脂肪酶總活性為低。此外，相較於對照組及酒精濃度20%、30%、40%實驗組，酒精濃度50%實驗組在進行酵素沉澱取得時，於低速離心(3,000×g)處理10分鐘後，極易取得米糠脂肪酶酵素沉澱，甚至使用重力沉降也可達相似沉澱效果；相反地，對照組及酒精濃度20%、30%、40%實驗組則較難順利取得米糠脂肪酶酵素沉澱。
由上述實驗結果可知，本發明特有米糠脂肪酶之硫酸銨暨酒精純化法的酵素純化效能，明顯優於傳統硫酸銨純化法；且本發明開發之酵素純化製程操作容易，不須使用高速離心設備即可順利取得純化酵素沉澱，有利於製程放大。
《實驗例5.米糠脂肪酶製備製程之放大規模驗證：》
本實驗例5使用試驗工廠等級設備，對本發明之米糠脂肪酶製備製程進行放大規模驗證，以有效地提升米糠脂肪酶製備效率及縮短米糠脂肪酶生產製程。
實驗材料：
1.未脫脂米糠
本實驗例5中所使用的未脫脂米糠是購自於聯發碾米工廠。
2.酵素萃取溶液
本實驗例5中所使用的酵素萃取溶液為蒸餾水(包含有0.1% Triton X-100，本發明米糠脂肪酶萃取溶液配方)。
3.酵素沉澱回溶液
本實驗例5中所使用的酵素沉澱回溶液為50-100mM磷酸緩衝液(pH8.0)。
4.試驗工廠等級設備
試驗工廠等級設備包含有500公升醱酵槽(Biotop BTF-C500L，頂生實業股份有限公司，台灣)、臥式連續離心機(Lw360×1600，遼寧富一機械有限公司，中國)、系統串聯管線設備(頂生實業股份有限公司，台灣)及連續式高速遠心分離機(S-VT No.6，泉泰鐵工廠，台灣)。
實驗方法：
首先對未脫脂米糠進行脂肪酶萃取，依據米糠與酵素萃取溶液之固液比例1：4，於500公升醱酵槽中加入35kg米糠顆粒及140L酵素萃取溶液，進行攪拌(120rpm)處理60分鐘，再以臥式連續離心機進行連續式離心處理30分鐘後，所收集之離心上清液即為米糠脂肪酶之酵素萃取液。
對酵素萃取液進行脂肪酶純化，分為對照組及實驗組。對照組使用傳統的硫酸銨純化法，實驗步驟為取上 述製備之酵素萃取液(體積為160L)於500公升醱酵槽中，加入60kg硫酸銨(0-60%飽和濃度硫酸銨)，攪拌(120rpm)混勻60分鐘，再以臥式連續離心機或連續式高速遠心分離機(16,000×g)進行連續式離心處理，然無法取得酵素沉澱。
實驗組使用本專利特有的硫酸銨暨酒精純化法，實驗組實驗步驟為取上述製備之酵素萃取液(體積為160L)於500公升醱酵槽中，加入60kg硫酸銨(0-60%飽和濃度硫酸銨)，攪拌(120rpm)混勻60分鐘，此時溶液總體積為200L，再加入200L 95%工業酒精，攪拌(120rpm)混勻60分鐘，再靜置10分鐘後，待重力沉降即可得米糠脂肪酶之實驗組純化酵素沉澱(約60kg)。實驗組純化酵素沉澱以酵素沉澱回溶液進行酵素沉澱回溶，回溶後即為實驗組純化酵素液。
實驗結果：
本實驗依據傳統硫酸銨純化法，利用試驗工廠等級設備進行米糠脂肪酶酵素純化，然無法取得酵素沉澱(對照組)。
本實驗使用本專利特有的硫酸銨暨酒精純化法，利用試驗工廠等級設備進行米糠脂肪酶酵素純化，可順利取得酵素沉澱(實驗組)。取5g實驗組純化酵素沉澱以3mL酵素沉 澱回溶液進行回溶，回溶後得總體積為6.5mL之實驗組純化酵素液，其蛋白質濃度、每毫升脂肪酶酵素活性、比活性及總活性顯示於表5。
從表5結果可見，本發明之米糠脂肪酶製備製程，使用試驗工廠等級設備可順利地進行放大規模驗證，放大規模驗證所得米糠脂肪酶純化酵素液(5g純化酵素沉澱以3mL酵素沉澱回溶液進行回溶，回溶後總體積為6.5mL)，其蛋白質濃度為0.64mg/mL、每毫升脂肪酶酵素活性為400U/mL、比活性為623U/mg、總活性為2598 U。
相較於傳統硫酸銨純化法無法順利以試驗工廠等級設備進行放大規模驗證，本發明之米糠脂肪酶製備製程使用新穎的硫酸銨暨酒精純化法，成功地使用試驗工廠等級設備完成規模放大驗證，且酵素沉澱製程不須利用離心設備或固液分離設備，僅需使用重力沉降法即可順利取得純化酵素沉澱，顯示本發明的酵素萃 取純化製程可有效地提升米糠脂肪酶製備效率及降低米糠脂肪酶生產成本。
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。
如本文中所用的，術語“脂肪酶”意指全名為triacylglycerol lipase(EC3.1.1.3)之具有水解脂肪酯鍵能力的酵素，其可對油脂進行水解作用，從而產生脂肪酸及醇類。
如本文中所用的，術語“萃取”意指利用水、溶劑、緩衝液等，對米糠進行酵素萃取反應，以提取含有米糠脂肪酶之酵素萃取液。而這些操作條件的選擇是熟習此項技藝者能例行性地自行決定的。
如本文中所用的，術語“純化”意指利用化學藥劑、溶劑、膠體等，對含有米糠脂肪酶之酵素萃取液進行酵素純化反 應，以取得具酵素活性之米糠脂肪酶純化酵素。而這些操作條件的選擇是熟習此項技藝者能例行性地自行決定的。
如本文中所用的，術語“試驗工廠等級設備”意指利用操作體積100公升以上之系統設備，對米糠脂肪酶製備製程進行放大規模驗證。而這些操作條件的選擇是熟習此項技藝者能例行性地自行決定的。
依據本發明，該酵素萃取及純化製程可以採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行。
可瞭解到的是，有關酵素萃取及純化的操作條件會進一步隨著所使用的溶劑以及化學藥品等因素而被變動，以便達致最佳的酵素萃取及純化效果。而這些操作條件的選擇是熟習此項技藝者能例行性地自行決定的。
如本文中所用的，術語“活性”意指脂肪酶活性，以脂肪酶標準品(Lipase from wheat germ-Type I,5-15units/mg protein,Protein：70%,Sigma L3001)的活性單位作為代表，以U表示。脂肪酶標準品的1個單位活性(1 U)定義為，在酸鹼值為7.4(pH7.4)及37℃的環境下，脂肪酶標準品每1小時可對受質三酸甘油酯作用，水解產生1微當量(microequivalent)的脂肪酸。
如本文中所用的，術語“比活性”意指每毫克蛋白質所含有的脂肪酶活性，以U/mg表示。
如本文中所用的，術語“總活性”意指酵素溶液所含有的總脂肪酶活性，總活性為每毫升米糠脂肪酶酵素溶液活性(U/mL)與米糠脂肪酶酵素溶液體積量(mL)的乘積，以U表示。
如本文中所用的，術語“蛋白質濃度”意指每毫升酵素溶液所含有的總蛋白質量，以mg/mL表示。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

Claims (8)

  1. 一種米糠脂肪酶的製備方法，其包括：萃取步驟：將未脫脂米糠加入酵素萃取溶液中攪拌，酵素萃取溶液是含有表面活性劑之蒸餾水，予以離心後得到米糠脂肪酶酵素萃取液；及純化步驟：將米糠脂肪酶酵素萃取液，加入硫酸銨暨酒精中攪拌，得到米糠脂肪酶純化酵素沉澱。
  2. 如請求項1的米糠脂肪酶的製備方法，萃取步驟中，米糠：酵素萃取溶液之比例為1：2以上。
  3. 如請求項2的米糠脂肪酶的製備方法，萃取步驟中，米糠：酵素萃取溶液之比例為1：4。
  4. 如請求項1的米糠脂肪酶的製備方法，萃取步驟中，酵素萃取溶液是含有表面活性劑為0.1% Triton X-100之蒸餾水。
  5. 如請求項1的米糠脂肪酶的製備方法，純化步驟分為兩階段進行，第一階段純化步驟：將米糠脂肪酶酵素萃取液加入硫酸銨攪拌，得到純化第一階段完成之米糠脂肪酶酵素溶液，第二階段純化步驟：將純化第一階段完成之米糠脂肪酶酵素溶液，加入酒精攪拌後靜置，得到米糠脂肪酶純化酵素沉澱。
  6. 如請求項5的米糠脂肪酶的製備方法，其中酒精濃度為20%以上。
  7. 如請求項6的米糠脂肪酶的製備方法，其中酒精濃度為50%。
  8. 一種米糠脂肪酶的製備方法，其包括：萃取步驟：將米糠加入酵素萃取溶液中攪拌，酵素萃取溶液是含有表面活性劑之蒸餾水，予以離心後得到米糠脂肪酶酵素萃取液；及純化步驟：將米糠脂肪酶酵素萃取液，加入硫酸銨中攪拌，得到米糠脂肪酶純化酵素沉澱。
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