CN109265535A - 鱼皮胶原蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种鱼皮胶原蛋白的制备方法,包括如下步骤:(1)制备鱼真皮;(2)酸溶液II浸泡鱼真皮至成为胶体状后放入过滤袋,加压挤出胶状物,获得鱼皮胶原蛋白胶体;(3)向鱼皮胶原蛋白胶体中添加碱性物质溶液,絮凝析出鱼皮胶原蛋白;(4)纯化处理。本发明所述的鱼皮胶原蛋白的制备方法可简单高效地制备具有水不溶解特性及三螺旋结构未破坏掉的大分子胶原蛋白。可进一步用于制作生物膜材料、医用止血和吸血材料、食品用蛋白质原料、人造肠衣的基础原料等,用途广泛。
Description
技术领域
本发明涉及鱼皮的开发利用领域,特指一种鱼真皮制备的水不溶解及三螺旋结构未被破坏的大分子胶原蛋白。
背景技术
胶原蛋白最普遍的结构特征是三螺旋结构。由3条左手螺旋构型多肽链相互缠绕成右手螺旋结构,即超螺旋结构,使其分子结构稳定,具有良好的生物相容性和低免疫原性。但是随着温度升高,胶原蛋白三条肽链间氢键断裂,三螺旋结构被打开,形成明胶。胶原物化性质改变的温度点称之为热变性温度,通常鱼皮胶原蛋白变性温度低于32℃。
为了区别目前以热水抽提胶原蛋白而破坏其三螺旋结构成为明胶,且将热提取明胶被蛋白酶水解制成小分子胶原蛋白的胶原蛋白制作工艺,故本专利所涉及的胶原蛋白称为未变性大分子胶原蛋白。
胶原蛋白为一种新型的生物材料,是生物医药工程应用中的一种常见基质如促进烧伤和创伤伤口愈合,胶原膜为表皮细胞的迁移、增殖铺垫了支架,并提供了良好的营养基础,有利于上皮细胞的增生修复,因而能促进创面的愈合,促进眼角膜上皮损伤细胞的修复和生长,已有用于人工角膜的原料的报道。胶原蛋白作为药物释放载体时可以通过控制胶原蛋白的结构来实现对药物的缓慢释放。将胶原蛋白交联成大分子网状结构,使其强度增大,载药量增加,同时其生物降解速率减慢,延长对药物的释放时间。添加2%胶原蛋白可以改善肉类品质,作为食品食用膜和胶囊包装材料,可减少食品污染。也可以作为食品添加剂,如作为饮料澄清剂。
胶原蛋白与人皮肤有高度亲和性,有保养和保湿性,透明性,可用于制作人工角膜,胶原纤维本身无色透明,与植物纤维结合可以制造高级生活用纸。造纸业将其还用于增强剂、胶黏剂、表面活性剂、絮凝剂、施胶剂等,市场前景广阔。
而鱼类在加工成鱼片及鱼糜的工艺中,会产生大量的鱼皮副产物,目前,主要作为饲料,也有用其作为提取小分子胶原蛋白的原料。而利用其提取大分子胶原蛋白,目前主要采用酸溶解析出后,在加碱中和絮凝沉淀的方法,此方法大量使用酸、碱,污染环境,成本高,且提取率低。因此,降低酸碱使用量,提高提取率对制备大分子胶原蛋白的技术尤为重要。
鱼皮中的胶原蛋白。鱼皮是由表皮层和真皮层构成;真皮层在表皮下方,主要由排列构造均匀一致的结缔组织纤维组成,且以胶原纤维为主,是鱼皮中胶原蛋白存在的主要部位。而鱼表皮所以去除鱼表皮,可增加鱼皮制备胶原蛋白的提取率以及提高胶原蛋白的纯度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鱼皮胶原蛋白的制备方法,尤其是以鱼皮为原料制备优质胶原蛋白的技术工艺。所述方法包括如下步骤:
(1)制备鱼真皮;在不超过50℃条件下,使用浓度0.05-0.1mol/L的酸溶液I浸泡鱼皮0.1-48小时,至鱼皮溶胀后,用滤网过滤去除游离溶液部分;过滤后鱼皮的深灰黑色部分呈絮装或豆腐状,用刮除的物理方法,去除呈深灰黑色絮装或豆腐状部分,所获白色或灰白色部分即为鱼皮的真皮,所使用的工具可选用硬质具有摩擦和刮除功能的所有工具,如刮刀、砂轮、砂纸、钢刷、毛刷、无纺布、擦洗海绵等。
(2)酸溶液II浸泡鱼真皮至成为胶体状后放入过滤袋,加压挤出胶状物,获得鱼皮胶原蛋白胶体;
(3)向鱼皮胶原蛋白胶体中添加质量浓度0.001-0.5%的碱性物质溶液,絮凝析出鱼皮胶原蛋白,使胶原蛋白沉淀而富集;以清水清洗去除碱性溶液。
(4)纯化处理。所使用的过滤是采用滤纸或滤布脱除溶液部分后,以去离子水、纯净水进行清洗后,再次过滤分离;沉淀部分冷冻干燥或30℃以下的冷风干燥,获得大分子胶原蛋白。
本发明所述的鱼皮胶原蛋白的制备方法可简单高效地制备具有水不溶解特性及三螺旋结构未破坏掉的大分子胶原蛋白。可进一步用于制作生物膜材料、医用止血和吸血材料、食品用蛋白质原料、人造肠衣的基础原料等,用途广泛。
本发明中使用鳕鱼真皮分别制备胶原蛋白膜与市售肠衣膜相比,抗拉伸强度为7.89N/mm2,高出(3.23N/mm2);断裂伸长率为10.5%低出(6.75%);热收缩温度为138.84℃,显著高于市售肠衣膜的114.52℃。
附图说明
本发明附图4幅,分别是:
图1是狭鳕鱼全皮照片。
图2是经处理获得的狭鳕鱼真皮照片。
图3是鲽鱼真皮来源的胶原蛋白的SDS-PAGE电泳图,其中:泳道1:标准蛋白质;泳道2:鲽鱼真皮胶原蛋白(未加β-巯基乙醇);泳道3:鲽鱼真皮胶原蛋白(加β-巯基乙醇)。
图4是鲽鱼真皮来源的胶原蛋白的红外光谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种鱼皮胶原蛋白的制备方法,包括如下步骤:(1)制备鱼真皮;(2)酸溶液II浸泡鱼真皮至成为胶体状后放入过滤袋,加压挤出胶状物,获得鱼皮胶原蛋白胶体;(3)向鱼皮胶原蛋白胶体中添加碱性物质溶液,絮凝析出鱼皮胶原蛋白;(4)纯化处理。
上述制备方法中,所述的步骤(1)描述如何将采集来的鱼皮原料处理为本发明直接处理的对象,即鱼真皮。具体实施方式中,所述的步骤(1)是使用酸溶液I浸泡鱼皮至鱼皮溶胀,脱除鱼皮表皮,获得鱼真皮。其中所述的脱除表皮使用刮除的物理方法,所使用的工具可选用硬质具有摩擦和刮除功能的所有工具,如刮刀、砂轮、砂纸、钢刷、毛刷、无纺布、擦洗海绵等。更加具体的实施方式中,所述的酸溶液I是盐酸或磷酸的水溶液。优选浓度为0.05-0.1mol/L的盐酸水溶液或磷酸水溶液。
更加具体的以鱼皮为原料制备鱼真皮的方法可以包括如下步骤:(a)在不超过30℃条件下,使用浓度0.05-0.1mol/L的盐酸、硫酸或磷酸溶液浸泡鱼0.1-48小时,用滤网过滤去除游离溶液部分;(b)过滤后鱼皮的深灰黑色部分呈絮装或豆腐状,用刮除的物理方法,去除呈深灰黑色絮装或豆腐状部分,所获白色或灰白色部分即为鱼皮的真皮;此外,步骤(b)获得的鱼真皮再经过质量浓度为0.001-0.5%的NaOH、KOH、Na2CO3或K2CO3水溶液浸泡以中和和溶出碱溶解性物质后,流水清洗,即可得到用于步骤(2)鱼真皮。
另一具体的实施方式中,所述步骤(2)中以酸溶液II浸泡鱼真皮至成为胶体状,所述的酸溶液II选自乳酸水溶液、柠檬酸水溶液或醋酸水溶液。优选浓度为0.05-0.1mol/L的乳酸水溶液、柠檬酸水溶液或醋酸水溶液。该酸溶液浸泡溶胀的步骤,以所述的酸溶液II浸泡至鱼真皮溶胀至原质量的1.5-10倍,根据不同原料,该步骤耗时0.1-24小时。
溶胀之后的鱼真皮需放入过滤袋,加压挤出胶状物,获得鱼皮胶原蛋白胶体;所述的加压挤出操作在0-50℃条件下进行。根据挤出物的透明程度,直至挤出呈白色不透明胶状物为止,加压挤出胶状物的操作持续0.1-24小时。
进一步具体实施方式中,本发明的鱼皮胶原蛋白制备方法中(3)所述及的向鱼皮胶原蛋白胶体中添加碱性物质溶液,絮凝析出鱼皮胶原蛋白;具体使用的碱性物质优选NaOH、KOH、Na2CO3、K2CO3;所述的碱性物质溶液尤其优选质量浓度0.001-0.5%的NaOH、KOH、Na2CO3或K2CO3的水溶液。
更为具体地,本发明所述方法的步骤(3)包括如下步骤:(3a)使用碱性物质溶液中和絮凝;(3b)沉淀富集。
另一具体实施方式中,对本发明所述的鱼皮胶原蛋白的制备方法中步骤(4)的纯化处理进行具体的描述,可包括如下步骤:
(4a)过滤除杂、洗净分离;
(4b)低温干燥。(50℃以下冷风干燥或者冷冻干燥)
上述步骤中,步骤(4a)所使用的过滤是是采用滤纸或滤布脱除溶液部分后,以去离子水、纯净水进行清洗后,再次过滤分离。
下面结合实施例对本发明作进一步的阐述。如无特殊说明,本发明中:
鱼皮中脂肪的测量方法采用索氏抽提法,蛋白质的测量方法采用凯氏定氮法,胶原蛋白含量的测量方法及胶原蛋白纯度均采用GB/T-9695.23-2008的肉与肉制品-羟脯氨酸含量测定法,计算得出。
实施例1.鳕鱼真皮的制备
秤取100g狭鳕鱼皮放入玻璃烧杯中,放入含有1L浓度为0.1mol/L的盐酸水溶液中,浸泡2小时后,观测到多含色素的表皮呈豆腐状,用钢刷去除色素部分获得白色的真皮。狭鳕鱼皮全皮处理后所得的真皮照片分别如图1、图2所示。检测鳕鱼皮的全皮与真皮、表皮的主要成分,结果如表1所示。可见:鳕鱼全皮水分含量为67.3%,全皮干物质中胶原蛋白含量为47.3%;鳕鱼表皮为灰黑色,表皮水分含量为74.3%,表皮干物质中胶原蛋白含量为36.7%,深黑灰色;鳕鱼真皮水分含量为63.4%,真皮干物质中胶原蛋白含量为56.2%,乳白色。可见真皮的胶原蛋白含量高于全皮,特别远高于表皮。另一方面,从鱼皮的颜色、灰份含量及水分含量也反映出真皮所含色素、矿物质等杂质低于全皮特别是远低于表皮。
表1鳕鱼皮的基本组成(w%)
实施例2.鲽鱼真皮胶原蛋白的制备
称取鲽鱼皮100kg,放入1500L浓度为0.05mol/L的磷酸水溶液中,20℃浸泡2小时后取出,在滤网上除去鱼皮表面液体,观测到多含色素的表皮呈豆腐状,用刀背刮去大部分灰黑色表皮,再用钢刷来刷掉残余的表皮获得白色的真皮;再将其放入含有500L质量浓度为0.01%的NaOH水溶液中,20℃浸泡2小时,滤网过滤后,再用0.05mol/L的乳酸水溶液溶胀至鱼皮原料重量的2-5倍,随后将溶胀的鱼皮装入滤布袋,挤出胶原蛋白胶体,用0.5%NaOH溶液中和,使蛋白质絮凝析出,静置0.5小时沉淀富集后,过滤除掉上清液,再用蒸馏水或去离子水多次洗净,过滤后再次挤压成豆腐状蛋白,在低温的冷风或冷冻干燥,获得大分子胶原蛋白14.2kg,以鱼皮干重计算其收率为38.8%,以鱼皮中所含胶原蛋白计算其收率为82.0%;以羟脯氨酸含量推算出其胶原蛋白纯度为92%以上。
对所获得的胶原蛋白进行了SDS-PAGE电泳检测和红外光谱检测,结果分别如附图3和附图4所示。从附图3SDS-PAGE电泳检测结果可以看出,所制备得到的胶原蛋白条带清楚,间隔明显。具有典型的α1、α2、β和γ条带:有两条α链,由α1和α2组成,α1链含量比α2含量高,β链含量也较高,含有少量的γ链,此图符合I型胶原蛋白的特点。泳道3(加入β-巯基乙醇)与泳道2图谱基本一致,因此该胶原蛋白的三螺旋结构中不含二硫键。
从附图4的的红外光谱图可以看出,所获的胶原蛋白的酰胺A的吸收在3293cm-1,表明胶原蛋白中含有氢键;鲽鱼皮胶原蛋白酰胺B的吸收在2921cm-1,主要是由胶原蛋白分子中CH2基团的不对称伸缩振动产生的;酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ带是反映蛋白质肽链骨架结构的最重要的吸收峰,其中,C=O振动为酰胺Ⅰ,其特征吸收在1700~1600cm-1处,鲽鱼皮胶原蛋白酰胺Ⅰ带的吸收在1631cm-1处;N-H和C-N扭转振动峰为酰胺其特征吸收峰通常位于1600~1500cm-1处,鲽鱼皮胶原蛋白酰胺Ⅱ带的吸收在1544cm-1处;甘氨酸和羟脯氨酸残基-H2特征峰为酰胺Ⅲ,其特征吸收峰通常位于1300~1200cm-1处,鲽鱼皮胶原蛋白酰胺Ⅲ带的吸收在1235cm-1处,均为I型胶原蛋白的特征。
实施例3.罗非鱼真皮胶原蛋白提取
称取罗非鱼皮200kg,放入2500L浓度为0.08mol/L的盐酸水溶液,25℃浸泡2小时后取出,在滤网上除去鱼皮表面液体,观测到多含色素的表皮呈豆腐状,用刀背刮去大部分灰黑色表皮,再用钢刷来刷掉残余的表皮获得白色的真皮;再将真皮放入1000L质量浓度为0.001%的KOH水溶液中,25℃浸泡2小时,滤网过滤除去游离的液体后,将鱼真皮用0.05mol/L的醋酸水溶液溶胀到鱼皮原料重量的8倍,将溶胀的鱼真皮装入滤布袋,挤出胶原蛋白胶体,并用0.2%的NaOH水溶液中和,使蛋白质絮凝析出,静置4小时沉淀富集后,过滤除掉上清液,再用蒸馏水或去离子水多次洗净,过滤后再次挤压成豆腐状蛋白,在低温的冷风或冷冻干燥,获得大分子胶原蛋白24kg,以羟脯氨酸含量推算出其胶原蛋白纯度为93%以上。
实施例4.鱼真皮胶原蛋白海绵的制备
称取100g实施例2所制备的鲽鱼真皮胶原蛋白,溶于质量浓度0.2%的乙酸水溶液中,制得胶原蛋被溶液I;将预先制备(在沸水浴中搅拌溶解)的质量浓度为1%聚合度为11-88的聚乙烯醇水溶液与溶解后的胶原蛋白溶液按体积比3:1混合,再加入质量浓度为2%的戊二醛水溶液0.5L,混合均匀后倒入硅胶模具中,于40℃条件下静置聚合反应24h;反应结束后放于-20℃环境中冷冻,冻结后于真空冷冻干燥机中冷冻干燥48h,得到的多孔海绵状固体即为胶原蛋白止血海绵。
止血实验以大鼠后肢股静脉切面的止血时间和出血量为指标,比较胶原海绵、市售明胶海绵、医用纱布的止血效果。结果表2所示,胶原海绵的止血时间最短,耗时仅60±13s,出血量最少,为0.17±0.07g,优于市售明胶海绵和医用纱布的止血效果,其中医用纱布的止血效果最差,耗时为165±35s,出血量为0.54±0.1g。在止血试验中发现,胶原海绵与创伤面接触时,能紧密的粘附于伤口上,填塞创伤面,可迅速止血;市售明胶海绵对伤口的粘附性较差;而医用纱布对创伤面几乎无粘附作用,因此其止血时间长且出血量多。
表2.止血效果测试结果
医用纱布 | 明胶海绵 | 胶原蛋白海绵 | |
出血量(g) | 0.54±0.1 | 0.33±0.04 | 0.17±0.07 |
止血时间(s) | 165±35 | 102±16 | 60±13 |
施例5.鱼真皮胶原蛋白肠衣的制备
称取100g实施例3所制备的罗非鱼真皮胶原蛋白,溶于质量浓度为0.01-2%的乙酸水溶液中,制得胶原蛋被溶液II;将预先制备(沸水浴中搅拌溶解)的质量浓度为1%聚合度为17-99的聚乙烯醇水溶液与溶解后的胶原蛋白溶液II按体积比8:2混合,再加入质量浓度为10%戊二醛水溶液0.5L,然后添加甘油10克,混合均匀后倒入硅胶模具中,于50℃条件下静置聚合反应24h;反应结束后放于80℃干燥箱内干燥24h,得到的富有弹性且透明管状薄膜状固体即为鱼皮人工胶原蛋白肠衣。
实施例6.鱼真皮胶原蛋白肠衣的特性
将制作的鳕鱼真皮蛋白质膜未测试样品,市售的广东德福隆生物科技有限公司的肠衣膜为对照样品;测试与对照样品分别剪成3cm×1cm的形状长条,采用质构仪测定其抗拉伸强度及断裂伸长率。
抗拉伸强度指试样被拉伸到最大形变程度时破裂瞬间的力与破裂横截面积之比,抗拉伸强度可以检测膜的坚实度和韧性,断裂伸长率指试样在拉断时位移(长度和原长差值)与原长的比值,断裂伸长率可以检测鳕鱼真皮蛋白质膜的延展性。
抗拉伸强度(TS)=F/ld,式中:
TS为抗拉伸强度,N/mm2;F为鳕鱼真皮蛋白质膜断裂时所承受的最大拉力(N);l为鳕鱼真皮蛋白质膜宽度热收缩温度;d为鳕鱼真皮蛋白质膜厚度(mm)。
断裂伸长率(E)=[(L-L1)/L1]×100%,其中:
E为断裂伸长率(%);L1为样品原长(mm);L为断裂时长度(mm)。
热收缩温度:使用差示扫描热量仪(DSC)测定热收缩温度,称取5mg鳕鱼真皮蛋白肠衣膜的及对照市售广东德福隆生物科技有限公司的肠衣样本,放入DSC铝锅后密封,以空铝锅作空白对照,扫描范围从20℃到180℃,升温速10℃/min,氮气流量为50mL/min。
鳕鱼真皮制备胶原蛋白膜与对照的肠衣膜相比,抗拉伸强度为7.89N/mm2,远高出(3.23N/mm2);断裂伸长率为10.5%低出(6.75%);热收缩温度为138.84℃,显著高于对照样品的114.52℃。
Claims (10)
1.鱼皮胶原蛋白的制备方法,包括如下步骤:
(1)制备鱼真皮;
(2)酸溶液II浸泡鱼真皮至成为胶体状后放入过滤袋,加压挤出胶状物,获得鱼皮胶原蛋白胶体;
(3)向鱼皮胶原蛋白胶体中添加碱性物质溶液,絮凝析出鱼皮胶原蛋白;
(4)纯化处理。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤(1)是:使用酸溶液I浸泡鱼皮至鱼皮溶胀,脱除鱼皮表皮,获得鱼真皮。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的酸溶液I是盐酸、硫酸或磷酸的水溶液。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的酸溶液I是浓度为0.05-1.0mol/L的盐酸水溶液、硫酸水溶液或磷酸水溶液。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中所述的酸溶液II选自乳酸水溶液、柠檬酸水溶液或醋酸水溶液。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤(2)中所述的酸溶液II是浓度为0.05-1.0mol/L的乳酸水溶液、柠檬酸水溶液或醋酸水溶液。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中所述的加压挤出胶状物的操作在0-50℃条件下进行。
8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,步骤(2)中所述的酸溶液II浸泡至鱼真鱼皮溶胀至原质量的1.5-10倍。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤(3)所使用的碱性物质是NaOH、KOH、Na2CO3、K2CO3。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)中所述的碱性物质溶液是质量浓度0.001-0.5%的NaOH、KOH、Na2CO3或K2CO3的水溶液。
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