CN104231115A - 肺组织降解提取肝素新工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种肺组织降解提取肝素新工艺，包括以下步骤：将原料猪肺，牛肺去脂肪和支气管后，捣碎，通过配制复合酶制剂，再加入辅酶成分制得活化酶使用液，酶解猪肺，牛肺。能将猪肺和牛肺组织酶解成水溶性成分。由于降解条件温和，充分保留了猪肺和牛肺中的活性成分，更利于其肝素，蛋白质，多肽等成分的分离。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，涉及一种生物组织的降解方法，具体涉及一种肺组织降解提取肝素新工艺。
背景技术
猪肺和牛肺中含有抗凝血成分——肝素。肝素是一种由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成的黏多糖硫酸脂，平均分子量为15KD，呈强酸性。肝素在组织中可与蛋白质结合。国内外一般采取单一蛋白酶降解法，此法仅能部分降解猪肺和牛肺组织，使得原料中肝素，多肽，蛋白质活性成分在后续常规分离中收率降低，提取的肝素钠效价在10-30IU/MG范围，规模生产可能性减小。另外，也有研究者采取较激烈的强酸强碱分离手段，此手段较多破坏了其中的活性成分。
发明内容
本发明为了解决猪肺和牛肺充分降解，同时又不破坏其生理活性成分的问题，提供了一种条件温和的生物降解方法。
解决上述技术问题的技术方案为：
首先，进行原料处理：取适量新鲜猪肺和牛肺，去脂肪和支气管，清水浸60分钟，清水洗去红细胞，捣碎成糊状。
进一步地，酶解：取糊状肺浆，加4～8倍盐水，盐水浓度为1.8％-3.8％，升温至40±2℃，调PH8.0～9.0，加活化酶使用液总量的一半，搅匀，缓慢升温至58±2℃，酶解1小时，加入0.6‰～1‰的十二烷基磺酸钠(SDS)，缓慢搅拌，再加入剩余活化酶使用液，酶解2小时，至体系无固体物。酶解过程中维持酶解温度58±2℃，pH8.5～9.0。
其中，活化酶使用液的配制方法如下：
a)按重量百分比称取碱性蛋白酶粉3～5％、果胶酶粉3～5％、纤维素酶粉15～40％、淀粉酶15～20％、木聚糖酶15～20％、β-葡聚糖酶15～20％混合均匀；
b)按重量百分比取鱼腥草25％、蒲公英16％、丹参4％、野菊花4％、五味子5％、夏枯草15％、海藻5％、海带5％、甘草6％、车前草15％加入至500ml去离子水中，煎煮60分钟后再加入300ml去离子水煎煮30分钟，取上清液；
c)将步骤b)所得的上清液加入步骤a)所得的混合酶中，搅拌均匀制得复合酶；
d)取总质量为新鲜猪肺和牛肺总质量的2‰～6‰的复合酶，调pH值在8.5～9.0之间，再加入浓度为75％的食用酒精和辅酶成分，食用酒精的体积比达到6％～10％，辅酶成分质量比达到0.6‰～1‰，搅匀，静置3小时；配制成活化酶使用液。
进一步地，吸附：将酶解液升温至85～90℃，保温30分钟，80目尼龙网过滤。降温至58～60℃，盐度1.8～2.0，0.5％阴离子交换树脂吸附8小时。
进一步地，洗脱：共3次，时间分别为5小时，3小时，2小时。洗脱液的浓度分别为：18°～20°盐水，21°～22°盐水，22°～24°盐水，第三次盐水洗脱后，配成24°～25°盐水回收，可供下次第一次洗脱用。
进一步地，沉淀：集中第一次洗脱液和第二次洗脱液，用85°～88°食用酒精，加至酒精度为38°～40°，沉淀24小时。
更进一步地，脱水干燥：用虹吸法弃去上清液，收集沉淀物，用95％酒精，脱水两次，每次酒精的使用量为沉淀物的2～3倍，处理时间不超过30分钟。挥干酒精，干燥得肝素粗品。
采用了上述方案，由于酶解过程中维持酶解温度58±2℃，pH8.5～9.0，条件温和，在不破坏生理活性成分的情况下，解决了猪肺和牛肺等动物肺组织完全降解的问题，提高了肺组织中肝素、蛋白质多肽等生物活性成分的提取和分离效率，使以猪肺、牛肺等动物肺组织作为原料规模化生产肝素、蛋白质多肽等生物活性成分的成本大大降低，收益率显著提高。并且充分保留了肺组织中的生理活性成分，提取的肝素钠效价较单一蛋白酶降解法显著提高，一次提取出的肝素钠效价大于60IU/MG。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
首先，进行原料处理：取1份新鲜猪肺和牛肺，去脂肪和支气管，清水浸60分钟，清水洗去红细胞，捣碎成糊状。
进一步地，酶解：取糊状肺浆，加4倍盐水，盐水浓度为1.8％～3.8％，升温至40±2℃，调pH8.0～9.0，加活化酶使用液总量的一半，搅匀，缓慢升温至58±2℃，酶解1小时，加入0.6‰的十二烷基磺酸钠(SDS)，缓慢搅拌，再加入剩余活化酶使用液，酶解2小时，至体系无固体物。酶解过程中维持酶解温度58±2℃，pH8.5～9.0。
其中，活化酶使用液的配制方法如下：a)按重量百分比称取碱性蛋白酶粉3％、果胶酶粉3％、纤维素酶粉34％、淀粉酶20％、木聚糖酶20％、β-葡聚糖酶20％混合均匀；
b)按重量百分比取鱼腥草25％、蒲公英16％、丹参4％、野菊花4％、五味子5％、夏枯草15％、海藻5％、海带5％、甘草6％、车前草15％加入至500ml去离子水中，煎煮60分钟后再加入300ml去离子水煎煮30分钟，取上清液；
c)将步骤b)所得的上清液加入步骤a)所得的混合酶中，搅拌均匀制得复合酶；
d)取总质量为新鲜猪肺和牛肺总质量的2‰～6‰的复合酶，调pH值在8.5～9.0之间，再加入浓度为75％的食用酒精和辅酶成分，食用酒精的体积比达到6％～10％，辅酶成分质量比达到0.6‰～1‰，搅匀，静置3小时；配制成活化酶使用液。
进一步地，吸附：将酶解液升温至85～90℃，保温30分钟，80目尼龙网过滤。降温至58～60℃，盐度1.8～2.0，0.5％阴离子交换树脂吸附8小时。
进一步地，洗脱：共3次，时间分别为5小时，3小时，2小时。洗脱液的浓度分别为：18°～20°盐水，21°～22°盐水，22°～24°盐水，第三次盐水洗脱后，配成24°～25°盐水回收，可供下次第一次洗脱用。
进一步地，沉淀：集中第一次洗脱液和第二次洗脱液，用85°～88°食用酒精，加至酒精度为38°～40°，沉淀24小时。
更进一步地，脱水干燥：用虹吸法弃去上清液，收集沉淀物，用95％酒精，脱水两次，每次酒精的使用量为沉淀物的2～3倍，处理时间不超过30分钟。挥干酒精，干燥得肝素粗品。
实施例2
首先，进行原料处理：取1份新鲜猪肺和牛肺，去脂肪和支气管，清水浸60分钟，清水洗去红细胞，捣碎成糊状。
进一步地，酶解：取糊状肺浆，加8倍盐水，盐水浓度为1.8％～3.8％，升温至40±2℃，调PH8.0～9.0，加活化酶使用液总量的一半，搅匀，缓慢升温至58±2℃，酶解1小时，加入1‰的十二烷基磺酸钠(SDS)，缓慢搅拌，再加入剩余活化酶使用液，酶解2小时，至体系无固体物。酶解过程中维持酶解温度58±2℃，pH8.5～9.0。
其中，活化酶使用液的配制方法如下：
a)按重量百分比称取碱性蛋白酶粉5％、果胶酶粉5％、纤维素酶粉40％、淀粉酶15％、木聚糖酶15％、β-葡聚糖酶20％混合均匀；
b)按重量百分比取鱼腥草25％、蒲公英16％、丹参4％、野菊花4％、五味子5％、夏枯草15％、海藻5％、海带5％、甘草6％、车前草15％加入至500ml去离子水中，煎煮60分钟后再加入300ml去离子水煎煮30分钟，取上清液；
c)将步骤b)所得的上清液加入步骤a)所得的混合酶中，搅拌均匀制得复合酶；
d)取总质量为新鲜猪肺和牛肺总质量的2‰～6‰的复合酶，调pH值在8.5～9.0之间，再加入浓度为75％的食用酒精和辅酶成分，食用酒精的体积比达到6％～10％，辅酶成分质量比达到0.6‰～1‰，搅匀，静置3小时；配制成活化酶使用液。
进一步地，吸附：将酶解液升温至85～90℃，保温30分钟，80目尼龙网过滤。降温至58～60℃，盐度1.8～2.0，0.5％阴离子交换树脂吸附8小时。
进一步地，洗脱：共3次，时间分别为5小时，3小时，2小时。洗脱液的浓度分别为：18°～20°盐水，21°～22°盐水，22°～24°盐水，第三次盐水洗脱后，配成24°～25°盐水回收，可供下次第一次洗脱用。
进一步地，沉淀：集中第一次洗脱液和第二次洗脱液，用85°～88°食用酒精，加至酒精度为38°～40°，沉淀24小时。
更进一步地，脱水干燥：用虹吸法弃去上清液，收集沉淀物，用95％酒精，脱水两次，每次酒精的使用量为沉淀物的2～3倍，处理时间不超过30分钟。挥干酒精，干燥得肝素粗品。
实施例3
首先，进行原料处理：取1份新鲜猪肺和牛肺，去脂肪和支气管，清水浸60分钟，清水洗去红细胞，捣碎成糊状。
进一步地，酶解：取糊状肺浆，加6倍盐水，盐水浓度为1.8％～3.8％，升温至40±2℃，调PH8.0～9.0，加活化酶使用液总量的一半，搅匀，缓慢升温至58±2℃，酶解1小时，加入0.8‰的十二烷基磺酸钠(SDS)，缓慢搅拌，再加入剩余活化酶使用液，酶解2小时，至体系无固体物。酶解过程中维持酶解温度58±2℃，pH8.5～9.0。
其中，活化酶使用液的配制方法如下：
a)按重量百分比称取碱性蛋白酶粉3％、果胶酶粉5％、纤维素酶粉40％、淀粉酶17％、木聚糖酶20％、β-葡聚糖酶15％混合均匀；
b)按重量百分比取鱼腥草25％、蒲公英16％、丹参4％、野菊花4％、五味子5％、夏枯草15％、海藻5％、海带5％、甘草6％、车前草15％加入至500ml去离子水中，煎煮60分钟后再加入300ml去离子水煎煮30分钟，取上清液；
c)将步骤b)所得的上清液加入步骤a)所得的混合酶中，搅拌均匀制得复合酶；
d)取总质量为新鲜猪肺和牛肺总质量的2‰～6‰的复合酶，调pH值在8.5～9.0之间，再加入浓度为75％的食用酒精和辅酶成分，食用酒精的体积比达到6％～10％，辅酶成分质量比达到0.6‰～1‰，搅匀，静置3小时；配制成活化酶使用液。
进一步地，吸附：将酶解液升温至85～90℃，保温30分钟，80目尼龙网过滤。降温至58～60℃，盐度1.8～2.0，0.5％阴离子交换树脂吸附8小时。
进一步地，洗脱：共3次，时间分别为5小时，3小时，2小时。洗脱液的浓度分别为：18°～20°盐水，21°～22°盐水，22°～24°盐水，第三次盐水洗脱后，配成24°～25°盐水回收，可供下次第一次洗脱用。
进一步地，沉淀：集中第一次洗脱液和第二次沈脱液，用85°～88°食用酒精，加至酒精度为38°～40°，沉淀24小时。
更进一步地，脱水干燥：用虹吸法弃去上清液，收集沉淀物，用95％酒精，脱水两次，每次酒精的使用量为沉淀物的2～3倍5处理时间不超过30分钟。挥干酒精，干燥得肝素粗品。
采用了上述方案，由于酶解过程中维持酶解温度58±2℃，pH8.5～9.0，条件温和，在不破坏生理活性成分的情况下，解决了猪肺和牛肺等动物肺组织完全降解的问题，提高了肺组织中肝素、蛋白质多肽等生物活性成分的提取和分离效率，使以猪肺、牛肺等动物肺组织作为原料规模化生产肝素、蛋白质多肽等生物活性成分的成本大大降低，收益率显著提高。并且充分保留了肺组织中的生理活性成分，提取的肝素钠效价较单一蛋白酶降解法显著提高，一次提取出的肝素钠效价大于60IU/MG。
Claims (6)
1.肺组织降解提取肝素新工艺，其特征在于，包括以下步骤：
(1)原料处理：取适量新鲜猪肺和牛肺，去脂肪和支气管，清水浸泡60分钟，清水洗去红细胞之后捣碎成糊状；
(2)活化酶使用液的配制：
a)按重量百分比称取碱性蛋白酶粉3～5％、果胶酶粉3～5％、纤维素酶粉15～40％、淀粉酶15～20％、木聚糖酶15～20％、β-葡聚糖酶15～20％混合均匀；
b)按重量百分比取鱼腥草25％、蒲公英16％、丹参4％、野菊花4％、五味子5％、夏枯草15％、海藻5％、海带5％、甘草6％、车前草15％加入至500ml去离子水中，煎煮60分钟后再加入300ml去离子水煎煮30分钟，取上清液；
c)将步骤b)所得的上清液加入步骤a)所得的混合酶中，搅拌均匀制得复合酶；
d)取总质量为上述步骤(1)所述的新鲜猪肺和牛肺总质量的2‰～6‰的复合酶，调pH值在8.5～9.0之间，再加入浓度为75％的食用酒精和辅酶成分，食用酒精的体积比达到6％～10％，辅酶成分质量比达到0.6‰～1‰，搅匀，静置3小时；
(3)酶解：取上述步骤(1)所得的糊状肺浆，按照质量分数1：5的比例加入盐水，所述的盐水浓度为1.8％～3.8％，升温至38～42℃，调节pH在8.0～9.0之间，加入上述步骤(2)制得的活化酶液总量的一半，搅匀，缓慢升温至56～60℃，酶解1小时，加入辅酶成分，缓慢搅拌，再加入剩余活化酶使用液，酶解2小时，至体系无固体物；
(4)吸附：将上述步骤(3)得到的酶解液升温至85～90℃，保温30分钟，用80目尼龙网对其进行过滤，然后将滤液降温至58～60℃，调节盐度至1.8～2.0，0.5％阴离子交换树脂吸附8小时；
(5)洗脱：将上述步骤(4)得到的酶解液用盐水洗脱数次得洗脱液；
(6)沉淀：收集上述步骤(5)所得的洗脱液，用85°～88°食用酒精，加至酒精度为38°～40°，沉淀24小时；
(7)脱水干燥：用虹吸法弃去上清液，收集沉淀物，用95％的酒精，脱水两次，每次酒精的使用量为沉淀物的2～3倍，处理时间不超过30分钟，待挥干酒精，干燥得肝素粗品。
2.根据权利要求1所述的肺组织降解提取肝素新工艺，其特征在于：步骤(2)和步骤(3)中所述的辅酶成分为：十二烷基磺酸钠(SDS)。
3.根据权利要求2所述的肺组织降解提取肝素新工艺，其特征在于：所述的十二烷基硫酸钠(SDS)的加入量为总量的0.5～1.5‰。
4.根据权利要求1所述的肺组织降解提取肝素新工艺，其特征在于：酶解过程中均维持酶解温度56～60℃，pH8.5～9.0。
5.根据权利要求1所述的肺组织降解提取肝素新工艺，其特征在于：步骤(5)中所述的洗脱次数为三次，时间分别为5小时，3小时，2小时，所述的盐水的浓度分别为18°～20°盐水，21°～22°盐水，22°～24°盐水。
6.根据权利要求1所述的肺组织降解提取肝素新工艺，其特征在于：步骤(6)中所述的洗脱液包括第一次洗脱液和第二次洗脱液。
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