CN103951768A - 利用猪、牛肺提取肝素钠并联产多肽蛋白粉、氨基酸蛋白粉的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用猪、牛肺提取肝素钠并联产多肽蛋白粉、氨基酸蛋白粉的方法，属于生物医药制作技术领域，其采用如下步骤：(1)制浆；(2)盐解；(3)酶解；(4)沉淀、吸附；(5)洗脱、干燥；(6)制取多肽蛋白粉；(7)制取氨基酸蛋白粉。本发明工艺设计合理，无废气、废水、废渣排出污染环境，适合大规模进行生产；将生产过程中产生的废液、废渣进行回收利用，变废为宝，提高了经济效益；操作简单，生产周期短，生产收率高，适合推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药制作技术领域，具体涉及一种利用猪、牛肺提取肝素钠并联产多肽蛋白粉、氨基酸蛋白粉的方法。
背景技术
肝素是1916年从狗的肝脏中发现的，广泛存在于动物的肝、肺、肠等脏器中。肝素具有阻止血液凝固和溶解血栓的功能，是优良的天然抗凝血药，目前肝素是世界上最有效和临床用量最大的抗凝血药，欧美国家最早从牛肺、牛肠中大量提取肝素，曾由于疯牛病盛行，才停止对肝素的提取，后来有关专家，从猪小肠中发现了有大量的肝素存在，又由于我国是养猪大国，所以肝素的提取原料逐渐被猪小肠所取代，国外大多依靠我国进口肝素。
目前，我国粗品肝素生产多以猪小肠粘膜为原料，由于提取技术简单，投资不大，几乎每个县市一家，挣夺小肠资源，形成恶性竞争，以致肝素生产者利润微薄。加上由于国外经融危机，导致以猪小肠为原料生产肝素的企业，除去猪肠粘膜提取肝素后的肠衣制品出口困难，举步维艰。因此，要想提高经济效益，必须选择新的肝素提取原料，研发新的提取技术。据专家分析，动物肺脏中虽然具有大量的肝素存在，但由于其组织特异性，存在大量杂蛋白，与肝素结合得非常牢固，如何将肺脏中的肝素有效提取出来，是当今生物界研究的重要课题。国内外关于猪、牛肺提取肝素的论文有许多，诸如国立台湾大学畜牧学研究所林庆文博士关于猪肺脏中肝素之分离与纯化工艺；私立中原大学化学工程学系阮若屈博士猪肝素之萃取与纯化工艺；国立清华大学工程系吴文腾博士关于利用几丁聚醣以纯化肝素之研究的论文等，所述理论指标与实际相差甚大，产品收率低，质量不达标，效益低，而无法规模生产。通过在网上检索，涉及到从猪肺或者牛肺中提取肝素钠的专利共11项。其中，涉及到利用猪、牛肺提取肝素钠并联产多肽蛋白粉、氨基酸蛋白粉相关专利只有一项，即申请号为201110242666.4“从猪肺中提取肝素钠并联产多肽蛋白粉的工艺”，其处理方法为：(1)原料前处理；(2)酶解；(3)两次盐解；(4)除渣；(5)超滤浓缩除灰分；(6)铵盐沉淀；(7)沉淀肝素钠；(8)酶解沉淀；(9)脱色；(10)压滤；(11)喷雾干燥。该工艺为联产，对设备利用率高，节约资源，增加猪肺的附加值，但其产品收率低，质量不达标，效益低，无法规模生产。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种利用猪、牛肺提取肝素钠并联产多肽蛋白粉、氨基酸蛋白粉的方法，以解决我国现有的粗品肝素钠生产技术简单，产品收率低，质量不达标，效益低，无法规模生产而存在的不足。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：
利用猪、牛肺提取肝素钠并联产多肽蛋白粉、氨基酸蛋白粉的方法，采用如下步骤：
(1)制浆：取新鲜或冷冻的猪肺或牛肺绞碎成浆料，然后向浆料中加入非离子表面活性剂，加入的非离子表面活性剂与浆料的重量比为0.4-0.6:1，再间歇搅拌25-35min后，压滤得滤液Ⅰ以及滤渣Ⅰ；
(2)盐解：首先向滤渣Ⅰ中加入去离子水配制成混合液，去离子水的添加量是滤渣的0.5-1.5倍，同时，控制该混合液中氯化钠的含量为2-4％，调节混合溶液pH为8-9，并控制温度为40-60℃搅拌使其充分反应3-5h，压滤提取得滤液Ⅱ以及滤渣Ⅱ；
(3)酶解：将滤液Ⅰ和滤液Ⅱ混合后得滤液混合液，然后向滤液混合液中加入复合蛋白酶，添加复合蛋白酶的重量为滤液混合液的0.05-0.15％，控制其在温度为48-52℃，pH为8.5-9的条件下间歇搅拌酶解3.5-4.5h得酶解液；
(4)沉淀、吸附：控制酶解液的温度为45-50℃，并向酶解液中加入蛋白变性剂，每升酶解液中加入蛋白变性剂0.4-0.6g，搅拌均匀后静观放变性沉淀25-35min，然后经离心，再经5KD超滤后得到5KD截留液、5KD透过液以及沉淀物；将5KD截留液超滤浓缩至10-20％得到浓缩液，调节浓缩液的pH为4.5-6.5，并控制其盐度为3％，最后加入1M醋酸缓钠缓冲液，平衡通过弱碱性阴离子交换树脂层析柱，吸附至终点，浓缩液与醋酸钠缓冲液的体积比为100:0.5-1.5；
(5)洗脱、干燥：将吸附至终点的树脂用氯化钠溶液进行梯度洗脱；收集7-14％氯化钠活性峰，也即为肝素钠洗脱液，将其pH值调节为7-7.5后干燥，即可得到肝素钠粗品；
(6)制取多肽蛋白粉：将滤渣Ⅱ和步骤(4)中沉淀物混合并向其中加水得到混合液，水的加入量为滤渣和沉淀物质量的1倍，然后调节混合液的pH为8-9，再加入0.3％的动物水解蛋白酶，将其控制在45-50℃的温度下酶解3.5-4.5h，然后加入混合液总质量2-3％的活性炭搅拌反应50-70min，滤出活性炭，调节滤液pH为7，先经蒸发浓缩，再经过干燥后得多肽蛋白粉；
(7)制取氨基酸蛋白粉：将步骤(4)中5KD透过液与被树脂吸附后的浓缩液混合，调节其pH值为6.5-7，再经200D纳滤脱盐至盐度0.1-0.3％后浓缩至8-12％，喷干得氨基酸蛋白粉，脱盐废液可回收用于盐解。
进一步，所述的非离子表面活性剂为曲拉通×-100。
进一步，所述的蛋白复合酶为胰酶、2709碱性蛋白酶和动物水解蛋白酶的任意一种或几种。
进一步，所述的蛋白变性剂为十二烷基硫酸钠、十二醇聚氧乙烯醚基二甲基氯化铵的任意一种或两种的混合物。
优选地，所述步骤(1)中，非离子表面活性剂与浆料的重量比为1.5:1，搅拌时间为50min。
优选地，所述步骤(2)中，去离子水的添加量是滤渣的1倍，控制氯化钠在混合液中的含量为3％，混合溶液pH为8.5，控制温度为50℃搅拌反应4h。
优选地，所述步骤(3)中，添加复合蛋白酶的重量为滤液混合液的0.1％，控制其在温度为50℃，pH为8.5-9的条件下间歇搅拌酶解4h。
优选地，所述步骤(4)中，控制酶解液的温度为48℃，每升酶解液中加入蛋白变性剂0.5g，搅拌均匀后静观放变性沉淀30min，浓缩液与醋酸钠缓冲液的体积比为100:1；
优选地，所述步骤(6)中，将混合液控制在48℃的温度下酶解4h，然后加入混合液总质量2.5％的活性炭搅拌反应60min。
优选地，所述步骤(7)中，将5KD透过液与被树脂吸附后的浓缩液的混合液脱盐至盐度0.2％后浓缩至10％。
本发明的有益效果在于：
1.本发明以非离子型表面活性剂强化肺细胞的破裂，以复合酶解加盐解强化肝素与蛋白的解离，避免高温、强酸、过碱、氧化、高频等过激反应条件，保存了肝素天然分子结构的完整性。
2.本发明以变性沉淀剂取代热变性除蛋白，控制适宜的PH条件强化超滤层析效果，以喷干代替乙醇复沉再干燥，消除了乙醇易燃易爆而存在的不安全隐患。
3.本发明工艺设计合理，无废气、废水、废渣排出污染环境，适合大规模进行生产。
4.本发明将生产过程中产生的废液、废渣进行回收利用，变废为宝，提高了经济效益。
5.本发明操作简单，生产周期短，生产收率高，适合推广使用。
具体实施方式
为了方便本领域的技术人员理解，下面将结合实施例对本发明做进一步的描述。实施例仅仅是对该发明的举例说明，不是对本发明的限定，实施例中未作具体说明的步骤均是已有技术，在此不做详细描述。
实施例一
利用猪、牛肺提取肝素钠并联产多肽蛋白粉、氨基酸蛋白粉的方法，采用如下步骤：
(1)制浆：取新鲜的猪肺绞碎成500um的浆料，然后向浆料中加入9％曲拉通X-100的重量为600g，再间歇搅拌35min后，压滤得滤液Ⅰ以及滤渣Ⅰ；
(2)盐解：首先向滤渣Ⅰ中加入1500g纳滤废盐液，控制其中氯化钠的含量为4％，再调节其pH为9，并控制温度为60℃搅拌反应5h，压滤提取得滤液Ⅱ以及滤渣Ⅱ；
(3)酶解：将滤液Ⅰ和滤液Ⅱ混合后得滤液混合液，然后向滤液混合液中加入胰酶、2709碱性蛋白酶和动物水解蛋白酶的混合酶3g，控制其在温度为52℃，pH为9的条件下间歇搅拌酶解4.5h得酶解液；
(4)沉淀、吸附：控制酶解液的温度为50℃，并向酶解液中加入1.2g由十二烷基硫酸钠和十二醇聚氧乙烯醚基二甲基氯化铵组成蛋白变性剂，搅拌均匀后静观放变性沉淀35min，然后经离心，再经5KD超滤后得到5KD截留液、5KD透过液以及沉淀物；将5KD截留液超滤浓缩至200mL得到浓缩液，调节浓缩液的pH为6.5，并控制其盐度为3％，最后加入3mL1M醋酸缓钠缓冲液，平衡通过弱碱性阴离子交换树脂层析柱，吸附至终点；
(5)洗脱、干燥：将吸附至终点的树脂用pH为4的5％氯化钠溶液进行洗涤，然后用水冲洗，再用12％氯化钠溶液洗脱，将洗脱液的pH值调节为7.5后干燥，即可得到肝素钠粗品0.73g,效价为105usp/mg；
(6)制取多肽蛋白粉：将滤渣Ⅱ和步骤(4)中沉淀物混合并向其中加水600g，然后调节混合液的pH为9，再加入3g的动物水解蛋白酶，将其控制在50℃的温度下酶解4.5h，然后再加入活性炭18g后搅拌反应70min，滤出活性炭，调节滤液pH为7，先经蒸发浓缩，再经过干燥后得多肽蛋白粉102g；
(7)制取氨基酸蛋白粉：将步骤(4)中5KD透过液与被树脂吸附后的浓缩液混合，调节其pH值为7，再经200D纳滤脱盐至盐度0.3％后浓缩至240mL，喷干得氨基酸蛋白粉50g，脱盐废液可回收用于盐解。
实施例二
利用猪、牛肺提取肝素钠并联产多肽蛋白粉、氨基酸蛋白粉的方法，采用如下步骤：
(1)制浆：取冷冻的猪肺绞碎成500um的浆料，然后向浆料中加入9％曲拉通X-100的重量为400g，再间歇搅拌25min后，压滤得滤液Ⅰ以及滤渣Ⅰ；
(2)盐解：首先向滤渣Ⅰ中加入500g纳滤废盐液，控制其中氯化钠的含量为2％，再调节其pH为8，并控制温度为40℃搅拌反应3h，压滤提取得滤液Ⅱ以及滤渣Ⅱ；
(3)酶解：将滤液Ⅰ和滤液Ⅱ混合后得滤液混合液，然后向滤液混合液中加入胰酶、2709碱性蛋白酶和动物水解蛋白酶的混合酶1g，控制其在温度为48℃，pH为8.5的条件下间歇搅拌酶解3.5h得酶解液；
(4)沉淀、吸附：控制酶解液的温度为45℃，并向酶解液中加入0.8g由十二烷基硫酸钠和十二醇聚氧乙烯醚基二甲基氯化铵组成蛋白变性剂，搅拌均匀后静观放变性沉淀25min，然后经离心，再经5KD超滤后得到5KD截留液、5KD透过液以及沉淀物；将5KD截留液超滤浓缩至100mL得到浓缩液，调节浓缩液的pH为4.5，并控制其盐度为3％，最后加入1mL1M醋酸缓钠缓冲液，平衡通过弱碱性阴离子交换树脂层析柱，吸附至终点；
(5)洗脱、干燥：将吸附至终点的树脂用pH为4的5％氯化钠溶液进行洗涤，然后用水冲洗，再用7％氯化钠溶液洗脱，将洗脱液的pH值调节为7后干燥，即可得到肝素钠粗品0.69g,效价为103usp/mg；
(6)制取多肽蛋白粉：将滤渣Ⅱ和步骤(4)中沉淀物混合并向其中加水600g，然后调节混合液的pH为8，再加入3g的动物水解蛋白酶，将其控制在45℃的温度下酶解3.5h，然后再加入活性炭12g后搅拌反应50min，滤出活性炭，调节滤液pH为7，先经蒸发浓缩，再经过干燥后得多肽蛋白粉98g；
(7)制取氨基酸蛋白粉：将步骤(4)中5KD透过液与被树脂吸附后的浓缩液混合，调节其pH值为6.5，再经200D纳滤脱盐至盐度0.1％后浓缩至160mL，喷干得氨基酸蛋白粉49g，脱盐废液可回收用于盐解。
实施例三
利用猪、牛肺提取肝素钠并联产多肽蛋白粉、氨基酸蛋白粉的方法，采用如下步骤：
(1)制浆：取新鲜的牛肺绞碎成500um的浆料，然后向浆料中加入9％曲拉通X-100的重量为500g，再间歇搅拌30min后，压滤得滤液Ⅰ以及滤渣Ⅰ；
(2)盐解：首先向滤渣Ⅰ中加入1000g纳滤废盐液，控制其中氯化钠的含量为3％，再调节其pH为8.5，并控制温度为50℃搅拌反应4h，压滤提取得滤液Ⅱ以及滤渣Ⅱ；
(3)酶解：将滤液Ⅰ和滤液Ⅱ混合后得滤液混合液，然后向滤液混合液中加入胰酶、2709碱性蛋白酶和动物水解蛋白酶的混合酶2g，控制其在温度为50℃，pH为8.8的条件下间歇搅拌酶解4h得酶解液；
(4)沉淀、吸附：控制酶解液的温度为48℃，并向酶解液中加入1g由十二烷基硫酸钠和十二醇聚氧乙烯醚基二甲基氯化铵组成蛋白变性剂，搅拌均匀后静观放变性沉淀30min，然后经离心，再经5KD超滤后得到5KD截留液、5KD透过液以及沉淀物；将5KD截留液超滤浓缩至150mL得到浓缩液，调节浓缩液的pH为5，并控制其盐度为3％，最后加入2mL1M醋酸缓钠缓冲液，平衡通过弱碱性阴离子交换树脂层析柱，吸附至终点；
(5)洗脱、干燥：将吸附至终点的树脂用pH为4的5％氯化钠溶液进行洗涤，然后用水冲洗，再用9％氯化钠溶液洗脱，将洗脱液的pH值调节为7.2后干燥，即可得到肝素钠粗品0.7g,效价为106usp/mg；
(6)制取多肽蛋白粉：将滤渣Ⅱ和步骤(4)中沉淀物混合并向其中加水600g，然后调节混合液的pH为8.5，再加入3g的动物水解蛋白酶，将其控制在45℃的温度下酶解4h，然后再加入活性炭15g后搅拌反应60min，滤出活性炭，调节滤液pH为7，先经蒸发浓缩，再经过干燥后得多肽蛋白粉100g；
(7)制取氨基酸蛋白粉：将步骤(4)中5KD透过液与被树脂吸附后的浓缩液混合，调节其pH值为6.8，再经200D纳滤脱盐至盐度0.2％后浓缩至200mL，喷干得氨基酸蛋白粉50g，脱盐废液可回收用于盐解。
Claims (10)
1.利用猪、牛肺提取肝素钠并联产多肽蛋白粉、氨基酸蛋白粉的方法，其特征在于：采用如下步骤：
(1)制浆：取新鲜或冷冻的猪肺或牛肺绞碎成浆料，然后向浆料中加入非离子表面活性剂，加入的非离子表面活性剂与浆料的重量比为0.4-0.6:1，再间歇搅拌25-35min后，压滤得滤液Ⅰ以及滤渣Ⅰ；
(2)盐解：首先向滤渣Ⅰ中加入去离子水配制成混合液，去离子水的添加量是滤渣的0.5-1.5倍，同时，控制该混合液中氯化钠的含量为2-4％，调节混合溶液pH为8-9，并控制温度为40-60℃搅拌使其充分反应3-5h，压滤提取得滤液Ⅱ以及滤渣Ⅱ；
(3)酶解：将滤液Ⅰ和滤液Ⅱ混合后得滤液混合液，然后向滤液混合液中加入复合蛋白酶，添加复合蛋白酶的重量为滤液混合液的0.05-0.15％，控制其在温度为48-52℃，pH为8.5-9的条件下间歇搅拌酶解3.5-4.5h得酶解液；
(4)沉淀、吸附：控制酶解液的温度为45-50℃，并向酶解液中加入蛋白变性剂，每升酶解液中加入蛋白变性剂0.4-0.6g，搅拌均匀后静观放变性沉淀25-35min，然后经离心，再经5KD超滤后得到5KD截留液、5KD透过液以及沉淀物；将5KD截留液超滤浓缩至10-20％得到浓缩液，调节浓缩液的pH为4.5-6.5，并控制其盐度为3％，最后加入1M醋酸缓钠缓冲液，平衡通过弱碱性阴离子交换树脂层析柱，吸附至终点，其中，浓缩液与醋酸钠缓冲液的体积比为100:0.5-1.5；
(5)洗脱、干燥：将吸附至终点的树脂用氯化钠溶液进行梯度洗脱；收集7-14％氯化钠活性峰，也即为肝素钠洗脱液，将其pH值调节为7-7.5后干燥，即可得到肝素钠粗品；
(6)制取多肽蛋白粉：将滤渣Ⅱ和步骤(4)中沉淀物混合并向其中加水得到混合液，水的加入量为滤渣和沉淀物质量的1倍，调节 混合液的pH为8-9，再加入0.3％的动物水解蛋白酶，将其控制在45-50℃的温度下酶解3.5-4.5h，然后加入与混合液质量比为2-3：100的活性炭搅拌反应50-70min，然后滤出活性炭，调节滤液pH为7，先经蒸发浓缩，再经过干燥后得多肽蛋白粉；
(7)制取氨基酸蛋白粉：将步骤(4)中5KD透过液与被树脂吸附后的浓缩液混合，调节其pH值为6.5-7，再经200D纳滤脱盐至盐度0.1-0.3％后浓缩至8-12％，喷干得氨基酸蛋白粉，脱盐废液可回收用于盐解。
2.根据权利要求1所述的利用猪、牛肺提取肝素钠并联产多肽蛋白粉、氨基酸蛋白粉的方法，其特征在于：所述的非离子表面活性剂为曲拉通×-100。
3.根据权利要求1所述的利用猪、牛肺提取肝素钠并联产多肽蛋白粉、氨基酸蛋白粉的方法，其特征在于：所述的蛋白复合酶为胰酶、2709碱性蛋白酶和动物水解蛋白酶的任意一种或几种。
4.根据权利要求1所述的利用猪、牛肺提取肝素钠并联产多肽蛋白粉、氨基酸蛋白粉的方法，其特征在于：所述的蛋白变性剂为十二烷基硫酸钠、十二醇聚氧乙烯醚基二甲基氯化铵的任意一种或两种的混合物。
5.根据权利要求1所述的利用猪、牛肺提取肝素钠并联产多肽蛋白粉、氨基酸蛋白粉的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，非离子表面活性剂与浆料的重量比为1.5:1，搅拌时间为50min。
6.根据权利要求1所述的利用猪、牛肺提取肝素钠并联产多肽蛋白粉、氨基酸蛋白粉的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，去离子水的添加量是滤渣的1倍，控制混合溶液中氯化钠的含量为3％，混合溶液pH为8.5，控制温度为50℃搅拌反应4h。
7.根据权利要求1所述的利用猪、牛肺提取肝素钠并联产多肽蛋白粉、氨基酸蛋白粉的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，添 加复合蛋白酶的重量为滤液混合液的0.1％，控制其在温度为50℃，pH为8.5-9的条件下间歇搅拌酶解4h。
8.根据权利要求1所述的利用猪、牛肺提取肝素钠并联产多肽蛋白粉、氨基酸蛋白粉的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，控制酶解液的温度为48℃，每升酶解液中加入蛋白变性剂0.5g，搅拌均匀后静观放变性沉淀30min，浓缩液与醋酸钠缓冲液的体积比为100:1。
9.根据权利要求1所述的利用猪、牛肺提取肝素钠并联产多肽蛋白粉、氨基酸蛋白粉的方法，其特征在于：所述步骤(6)中，将混合液控制在48℃的温度下酶解4h，然后加入混合液总质量2.5％的活性炭搅拌反应60min。
10.根据权利要求1所述的利用猪、牛肺提取肝素钠并联产多肽蛋白粉、氨基酸蛋白粉的方法，其特征在于：所述步骤(7)中，将5KD透过液与被树脂吸附后的浓缩液的混合液脱盐至盐度0.2％后浓缩至10％。
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