CN104387504A - 一种利用猪小肠制备肝素钠的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明具体涉及一种利用猪小肠制备肝素钠的方法。该利用猪小肠制备肝素钠的方法，包括：肠粘膜的制备；酶解；吸附；洗涤洗脱；沉淀脱盐；脱水干燥。工艺简单，操作简便，投资少，不必改变现有设备，适合大规模工业化生产；肝素钠收率提高，质量稳定。以本方法生产的肝素钠纯度可达100-1150IU/mg，肝素钠收率可达1亿IU/1200-1500根重量在1200克-1400克猪小肠粘膜，较现有技术至少提高20-30％。
Description
（一） 技术领域
本发明属于生物制药制作技术领域，具体涉及一种利用猪小肠制备肝素钠的方法。
（二） 背景技术
肝素哺乳动物体内含的一种粘多糖，与蛋白质结合在一起存在于肠粘膜、肺、肝等器官内，是一种重要的抗凝血生化药物，主要应用于心脑血管疾病和血液透析治疗，其中，其在血液透析治疗中是唯一有效的特效药物。其治疗范围广，药用价值高，市场需求量大。肝素是世界上迄今为止已知的分子结构最复杂的化合物，短期内无法人工化学合成，目前只有来源于猪小肠粘膜的肝素能够用于临床治疗。肝素原料药的原料是肝素粗品，其提取只能源自健康生猪的小肠粘膜，由于含有大量杂质蛋白、杂质核酸、微生物等杂质，需经过物理和化学提取分离过程，定向获取天然结构基团完整的肝素，从而制成肝素原料药。
（三） 发明内容
本发明提供了一种利用猪小肠制备肝素钠的方法，其成本低、收率高、能耗低、污染小。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种利用猪小肠制备肝素钠的方法，其特殊之处在于：包括以下步骤：
(1)肠粘膜的制备：在猪小肠内灌入清水，用肠衣机挤压出小肠粘膜至粘膜池；用粘膜泵将粘膜从粘膜池打入酶解罐中，往酶解罐中加水，粘膜与水的重量比为100gk副小肠粘膜加水300L-500L；
(2)酶解：搅拌均匀后加入2709碱性蛋白酶：木瓜蛋白酶比例为1-1.5：2-3.5，调节PH值为8-9，加热使温度达到55℃-60℃，再加入重量百分比为3％-5％的肠衣专用盐，测其盐度达到3-4%，保温，继续加热使温度达到80℃-85℃，保温后，用40-60目尼龙布过滤收集过滤液；
(3)吸附：将上述过滤液打入吸附罐中，搅拌，待温度降到58℃-60℃时加入树脂，加入量为母液的5%，继续冷却到40℃-45℃，放出液体至一滤袋，收集过滤树脂，滤袋中的液体用树脂吸附；
(4)洗涤洗脱：
(4-1)：将收集的树脂用清水反复漂洗干净后滤干，倒入洗脱器中，加入2倍树脂体积的质量分数为1.4mol/L的盐水温度保持在50℃-55℃，搅拌；
(4-2)：随后将废液倒掉，加入1.5倍树脂体积的质量分数为3.5 mol/L的盐水，温度保持在50℃-55℃，搅拌后，收集洗脱液；
(4-3)：再分别用1倍的 3.0mol/L的盐水洗脱多次；
(4-4)：将上述收集的洗脱液合并待用；
(5)沉淀脱盐：
将上述洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为80％-85％的乙醇至终浓度为45%，调PH值至7-8，搅匀密封沉淀23-25小时，虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用；
（6）脱水干燥：将上述沉淀物滤干，用2倍量的95%以上的乙醇脱水多次，放入烘箱干燥后即得肝素钠。
本发明的利用猪小肠制备肝素钠的方法，
(2)酶解：搅拌均匀后加入2709碱性蛋白酶：木瓜蛋白酶比例为1-1.5：2-3.5，调节PH值为8-9，加热使温度达到55℃-60℃，再加入重量百分比为3％-5％的肠衣专用盐，测其盐度达到3-4%，保温2-3小时，继续加热使温度达到80℃-85℃，保温30-40分钟后，用40-60目尼龙布过滤收集过滤液；
(3)吸附：将上述过滤液打入吸附罐中，搅拌，待温度降到58℃-60℃时加入树脂，加入量为母液的5%，搅拌6-8小时，继续冷却到40℃-45℃，放出液体至一滤袋，收集过滤树脂；滤袋中的液体再加一半量的树脂吸附一次；
(4)洗涤洗脱：
(4-1)：将收集的树脂用清水反复漂洗干净后滤干，倒入洗脱器中，加入2倍树脂体积的质量分数为1.4mol/L的盐水温度保持在50℃-55℃，搅拌2小时 ；
(4-2)：随后将废液倒掉，加入1.5倍树脂体积的质量分数为3.5 mol/L的盐水，温度保持在50℃-55℃，搅拌3-4小时后，收集洗脱液；
(4-3)：再分别用1倍的 3.0mol/L的盐水洗脱两次；
(4-4)：将上述收集的洗脱液合并待用；
(5)沉淀脱盐：
将上述洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为80％-85％的乙醇至终浓度为45%，调PH值至7-8，搅匀密封沉淀23-25小时，虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用；
（6）脱水干燥：将上述沉淀物滤干，用2倍量的95%以上的乙醇脱水两次，放入烘箱干燥后即得肝素钠。
本发明的利用猪小肠制备肝素钠的方法，步骤（3）中树脂的加入量为13－15KG/100副小肠。
本发明的有益效果：工艺简单，操作简便，投资少，不必改变现有设备，适合大规模工业化生产；肝素钠收率提高，质量稳定。以本方法生产的肝素钠纯度可达100-1150IU/mg，肝素钠收率可达1亿IU/1200-1500根重量在1200克-1400克猪小肠粘膜，较现有技术至少提高20-30％；减少污染，降低成本，本发明方法可以杜绝在吸附罐的树脂在洗脱时流入排水系统进而对水源造成长期污染；降低能耗，减少生产成本，本发明方法采用循环水系统，较传统工艺节水40%；本发明采用车间废气净化处理装置，大大减少了空气中的恶臭气味，极大改善了工作环境。
（四） 具体实施方式
实施例1：
利用猪小肠生产肝素钠的制备方法，采用如下步骤：
(1)肠粘膜的制备：
取200根猪小肠用肠衣机挤压出小肠粘膜，沿着粘膜管道进入粘膜池；刮制过程中的肠头、碎肠皮绞碎后再投入粘膜池，共收集粘膜220千克。
(2)酶解：
打开粘膜泵，将220千克粘膜从粘膜池打入酶解罐中，将660千克水加入酶解罐中，打开搅拌机进行搅拌，搅拌均匀，再加入2709碱性蛋白酶：木瓜蛋白酶（1:2）添加到酶解罐中，调节PH值为8.0；打开蒸汽阀门使温度达到55℃，再加入肠衣专用盐，测其盐度达到3%，保温2-3小时，继续加热使温度达到80℃-85℃，保温30-40分钟后，用60目尼龙布过滤收集过滤液；
(3)吸附：
将上述过滤液打入吸附罐中，搅拌，待温度降到58℃-60℃时加入5%母液量的树脂，搅拌6-8小时，继续冷却到40℃-45℃，放出液体至一滤袋，收集过滤树脂；滤袋中的液体再加一半量的树脂吸附一次，可提高收率10－15%。
(4)洗涤洗脱：
(4-1)：将收集的树脂用清水反复漂洗干净后滤干，倒入洗脱器中，加入2倍树脂体积的质量分数为1.4mol/L的盐水温度保持在50℃-55℃，搅拌2小时 ；
(4-2)：随后将废液倒掉，加入1.5倍树脂体积的质量分数为3.5 mol/L的盐水，温度保持在50℃-55℃，搅拌3-4小时后，收集洗脱液；
(4-3)：再分别用1倍的 3.0mol/L的盐水洗脱两次。
(4-4)：将上述收集的洗脱液合并待用；
(5)沉淀脱盐：
将上述洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为80％-85％的乙醇至终浓度为45%，调PH值至7-8，搅匀密封沉淀23-25小时，虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用；
（6）脱水干燥：将上述沉淀物滤干。用2倍量的95%以上的乙醇脱水两次，放入烘箱干燥后即得肝素钠。
实施例2：
利用猪小肠生产肝素钠的制备方法，采用如下步骤：
(1)肠粘膜的制备：
取200根猪小肠用肠衣机挤压出小肠粘膜，沿着粘膜管道进入粘膜池；刮制过程中的肠头、碎肠皮绞碎后再投入粘膜池，共收集粘膜220千克。
(2)酶解：
打开粘膜泵，将220千克粘膜从粘膜池打入酶解罐中，将880千克水加入酶解罐中，打开搅拌机进行搅拌，搅拌均匀，再加入2709碱性蛋白酶：木瓜蛋白酶（1:3.5）添加到酶解罐中，调节PH值为8.0；打开蒸汽阀门使温度达到57℃，再加入重量百分比为4%的肠衣专用盐，测其盐度达到3.5%，保温2-3小时，继续加热使温度达到80℃，保温30-40分钟后，用60目尼龙布过滤收集过滤液；
(3)吸附：
将上述过滤液打入吸附罐中，搅拌，待温度降到60℃时加入5%母液量的树脂，搅拌6小时，继续冷却到40℃，放出液体至一滤袋，收集过滤树脂；滤袋中的液体再加一半量的树脂吸附一次，可提高收率10%。
(4)洗涤洗脱：
(4-1)：将收集的树脂用清水反复漂洗干净后滤干，倒入洗脱器中，加入2倍树脂体积的质量分数为1.4mol/L的盐水温度保持在50℃，搅拌2小时 ；
(4-2)：随后将废液倒掉，加入1.5倍树脂体积的质量分数为3.5 mol/L的盐水，温度保持在50℃，搅拌3-4小时后，收集洗脱液；
(4-3)：再分别用1倍的 3.0mol/L的盐水洗脱两次。
(4-4)：将上述收集的洗脱液合并待用；
(5)沉淀脱盐：
将上述洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为80％的乙醇至终浓度为45%，调PH值至7-8，搅匀密封沉淀25小时，虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用；
（6）脱水干燥：将上述沉淀物滤干。用2倍量的95%以上的乙醇脱水两次，放入烘箱干燥后即得肝素钠。
实施例3：
利用猪小肠生产肝素钠的制备方法，采用如下步骤：
(1)肠粘膜的制备：
取200根猪小肠用肠衣机挤压出小肠粘膜，沿着粘膜管道进入粘膜池；刮制过程中的肠头、碎肠皮绞碎后再投入粘膜池，共收集粘膜220千克。
(2)酶解：
打开粘膜泵，将220千克粘膜从粘膜池打入酶解罐中，将1100千克水加入酶解罐中，打开搅拌机进行搅拌，搅拌均匀，再加入2709碱性蛋白酶：木瓜蛋白酶（2:3.5）添加到酶解罐中，调节PH值为8.0；打开蒸汽阀门使温度达到60℃，再加入重量百分比为5%的肠衣专用盐，测其盐度达到4%，保温2-3小时，继续加热使温度达到85℃，保温30分钟后，用60目尼龙布过滤收集过滤液；
(3)吸附：
将上述过滤液打入吸附罐中，搅拌，待温度降到60℃时加入5%母液量的树脂，搅拌6小时，继续冷却到45℃，放出液体至一滤袋，收集过滤树脂；滤袋中的液体再加一半量的树脂吸附一次，可提高收率15%。
(4)洗涤洗脱：
(4-1)：将收集的树脂用清水反复漂洗干净后滤干，倒入洗脱器中，加入2倍树脂体积的质量分数为1.4mol/L的盐水温度保持在55℃，搅拌2小时 ；
(4-2)：随后将废液倒掉，加入1.5倍树脂体积的质量分数为3.5 mol/L的盐水，温度保持在55℃，搅拌3-4小时后，收集洗脱液；
(4-3)：再分别用1倍的 3.0mol/L的盐水洗脱两次。
(4-4)：将上述收集的洗脱液合并待用；
(5)沉淀脱盐：
将上述洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为85％的乙醇至终浓度为45%，调PH值至7-8，搅匀密封沉淀23小时，虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用；
（6）脱水干燥：将上述沉淀物滤干。用2倍量的95%以上的乙醇脱水两次，放入烘箱干燥后即得肝素钠。
实施例4：
利用猪小肠生产肝素钠的制备方法，采用如下步骤：
(1)肠粘膜的制备：
取200根猪小肠用肠衣机挤压出小肠粘膜，沿着粘膜管道进入粘膜池；刮制过程中的肠头、碎肠皮绞碎后再投入粘膜池，共收集粘膜220千克。
(2)酶解：
打开粘膜泵，将220千克粘膜从粘膜池打入酶解罐中，将880千克水加入酶解罐中，打开搅拌机进行搅拌，搅拌均匀，再加入2709碱性蛋白酶：木瓜蛋白酶：氯化锌：氯化钙1:3.5：0.1:0.05（重量比）添加到酶解罐中，调节PH值为8.0；打开蒸汽阀门使温度达到57℃，再加入重量百分比为4%的肠衣专用盐，测其盐度达到3.5%，保温0.5小时，继续加热使温度达到80℃，保温10分钟后，用60目尼龙布过滤收集过滤液；
(3)吸附：
将上述过滤液打入吸附罐中，搅拌，待温度降到60℃时加入5%母液量的树脂，搅拌0.5小时，继续冷却到40℃，放出液体至一滤袋，收集过滤树脂；滤袋中的液体再加一半量的树脂吸附一次，可提高收率20%。
(4)洗涤洗脱：
(4-1)：将收集的树脂用清水反复漂洗干净后滤干，倒入洗脱器中，加入2倍树脂体积的浓度为1.4mol/L的盐水温度保持在50℃，搅拌1小时 ；
(4-2)：随后将废液倒掉，加入1.5倍树脂体积的质量分数为3.5 mol/L的盐水，温度保持在50℃，搅拌1小时后，收集洗脱液；
(4-3)：再分别用1倍的 3.0mol/L的盐水洗脱两次。
(4-4)：将上述收集的洗脱液合并待用；
(5)沉淀脱盐：
将上述洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为85％的乙醇至终浓度为45%，调PH值至7-8，搅匀密封沉淀1.5小时，虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用；
（6）脱水干燥：将上述沉淀物滤干。用2倍量的95%以上的乙醇脱水两次，放入烘箱干燥后即得肝素钠。
本实施例较实施例1-3反应时间又进一步缩短，收率也较传统工艺方法提高了40%。
实施例5
实施例中使用的2709碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶均购自河南省所以化工有限公司。实施例所使用的树脂是经过预处理后的，处理步骤为：三次一小处理，9次一大处理。小处理用2mol/L HCl浸泡2-4小时，水洗至中性。 大处理用95%酒精浸泡24小时后，2mol/L HCl浸泡2小时，水洗至中性再用2mol/L NaOH浸泡2小时，水洗至中性再用2mol/L HCl浸泡2小时，水洗至中性。
实施例1-3与传统工艺方法有效收率比较表:
Claims (3)
1.一种利用猪小肠制备肝素钠的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)肠粘膜的制备：在猪小肠内灌入清水，用肠衣机挤压出小肠粘膜至粘膜池；用粘膜泵将粘膜从粘膜池打入酶解罐中，往酶解罐中加水，粘膜与水的重量比为100kg副小肠粘膜加水300L-500L；
(2)酶解：搅拌均匀后加入2709碱性蛋白酶：木瓜蛋白酶比例为1-1.5：2-3.5，调节PH值为8-9，加热使温度达到55℃-60℃，再加入重量百分比为3％-5％的肠衣专用盐，测其盐度达到3-4%，保温，继续加热使温度达到80℃-85℃，保温后，用40-60目尼龙布过滤收集过滤液；
(3)吸附：将上述过滤液打入吸附罐中，搅拌，待温度降到58℃-60℃时加入树脂，加入量为母液的5%，继续冷却到40℃-45℃，放出液体至一滤袋，收集过滤树脂，滤袋中的液体用树脂吸附；
(4)洗涤洗脱：
(4-1)：将收集的树脂用清水反复漂洗干净后滤干，倒入洗脱器中，加入2倍树脂体积的质量分数为1.4mol/L的盐水温度保持在50℃-55℃，搅拌；
(4-2)：随后将废液倒掉，加入1.5倍树脂体积的质量分数为3.5 mol/L的盐水，温度保持在50℃-55℃，搅拌后，收集洗脱液；
(4-3)：再分别用1倍的 3.0mol/L的盐水洗脱多次；
(4-4)：将上述收集的洗脱液合并待用；
(5)沉淀脱盐：
将上述洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为80％-85％的乙醇至终浓度为45%，调PH值至7-8，搅匀密封沉淀23-25小时，虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用；
（6）脱水干燥：将上述沉淀物滤干，用2倍量的95%以上的乙醇脱水多次，放入烘箱干燥后即得肝素钠。
2.根据权利要求1所述的利用猪小肠制备肝素钠的方法，其特征在于：
(2)酶解：搅拌均匀后加入2709碱性蛋白酶：木瓜蛋白酶比例为1-1.5：2-3.5，调节PH值为8-9，加热使温度达到55℃-60℃，再加入重量百分比为3％-5％的肠衣专用盐，测其盐度达到3-4%，保温2-3小时，继续加热使温度达到80℃-85℃，保温30-40分钟后，用40-60目尼龙布过滤收集过滤液；
(3)吸附：将上述过滤液打入吸附罐中，搅拌，待温度降到58℃-60℃时加入树脂，加入量为母液的5%，搅拌6-8小时，继续冷却到40℃-45℃，放出液体至一滤袋，收集过滤树脂；滤袋中的液体再加一半量的树脂吸附一次；
(4)洗涤洗脱：
(4-1)：将收集的树脂用清水反复漂洗干净后滤干，倒入洗脱器中，加入2倍树脂体积的质量分数为1.4mol/L的盐水温度保持在50℃-55℃，搅拌2小时 ；
(4-2)：随后将废液倒掉，加入1.5倍树脂体积的质量分数为3.5 mol/L的盐水，温度保持在50℃-55℃，搅拌3-4小时后，收集洗脱液；
(4-3)：再分别用1倍的 3.0mol/L的盐水洗脱两次；
(4-4)：将上述收集的洗脱液合并待用；
(5)沉淀脱盐：
将上述洗脱液过滤移入沉淀罐中，边搅拌边加入质量分数为80％-85％的乙醇至终浓度为45%，调PH值至7-8，搅匀密封沉淀23-25小时，虹吸上层清液用于回收乙醇，收集沉淀物待用；
（6）脱水干燥：将上述沉淀物滤干，用2倍量的95%以上的乙醇脱水两次，放入烘箱干燥后即得肝素钠。
3.根据权利要求1所述的利用猪小肠制备肝素钠的方法，其特征在于：步骤（3）中树脂的加入量为13－15KG/100副小肠。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150304 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |