CN108314749A - 一种从动物体提取肝素钠的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从动物体中提取肝素钠的方法，包括以下步骤：(1)盐解；(2)吸附；(3)树脂清洗；(4)脱附；(5)除杂；(6)沉淀；(7)干燥。本发明提供的肝素钠提取方法能减少环境污染，提高肝素钠产量，减少企业投入成本，具有极为广阔的市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及肝素钠的提取方法，尤其是涉及一种从动物体中提取肝素钠的方法。
背景技术
肝素广泛存在于在猪、牛、狗等哺乳动物的内脏和肠粘膜中。肝素主要是由D-葡糖胺， L-艾杜糖醛酸，N-乙酰葡萄糖胺及D-葡糖醛酸交替组成的粘多糖硫酸酯，分子量分布在 6000～20000，为白色或类白色粉末，无毒无味，有吸湿性。肝素易溶于水，不溶于乙醇、丙酮、二氧六环等有机溶剂，分子结构单元中含有5个硫酸基和2个羟基，呈强酸性，为聚阴离子，能与阳离子发生反应生成盐。因而肝素通常以钠盐或钙盐的形式存在，称为肝素钠(Heparin Sodium)或肝素钙，在使用中尤以肝素钠为主。肝素钠是肝素以钠盐的形式被提取出来，并制成药用制剂。实际上产生药效的是肝素，肝素具有抗凝血作用，是一种应用已久的抗凝血剂。把肝素制成合适的钠盐能便于他的保存，制剂和使用，使其不至于在一定时期内失去活性和药效。
目前，国内从动物体中提取肝素钠的方法主要有盐解法及酶解法，其中以盐解法应用最为普遍。动物体内的肝素通常是与其它粘多糖及蛋白质结合在一起的，用盐解法使肝素在碱性条件下与纳离子反应生成肝素钠，从而从蛋白质的复合物中分离出来，并用强碱性阴离子交换树脂从解离液中对肝素负离子进行吸附，再用盐水将吸附在树脂上的肝素负离子洗脱下来，最后进行过干燥，获得成品。
盐解法从哺乳动物小肠粘膜中提取肝素钠的工艺虽简单稳定，但在盐解过程中有部分肝素阴离子并未与钠离子结合形成肝素钠，使得获得的粗品肝素钠收率较低；最后得到的肝素钠中蛋白质残留量较高，对肝素钠的生物活性影响很大，一般会损失5-7％的肝素钠活性，使得质量难以控制和稳定。
发明内容
本发明提供了一种从动物体中提取肝素钠的方法，以解决现有技术从哺乳动物的小肠粘膜中提取肝素钠时，最终得到的肝素钠效价低的问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案概述如下：
一种从动物体中提取肝素钠的方法，包括以下步骤：
(1)盐解：将用于提取肝素钠新鲜小肠粘膜绞碎，按水与绞碎的小肠粘膜重量比为5.5:1的配比向绞碎的小肠粘膜中加入水混合均匀，并加入盐或盐水调节盐度为6.2度，再加入NaOH溶液调节pH至9.5-9.7，先升温至50-55℃，保温2h，而后升温至92-95℃，保温10-12min，捞出残渣并收集作为饲料，剩下混合液；
(2)吸附：用130-150目双层纱布过滤步骤(1)中所述的混合液，并将得到的滤渣按步骤(1)进行二次提取，将两次所得滤液进行合并在一起，并加入清水调节盐度2.6-2.8度，调节pH为8.3-8.7，控制温度为55-58℃，加入预处理好的树脂，进行搅拌吸附，搅拌时间为5-7h，其中所用树脂为德国肝素钠树脂WD-1701，使用重量比为树脂：小肠为 1-1.2:60；
(3)树脂清洗：将步骤(2)所述的经树脂吸附后的溶液收集起来，作为下次步骤(1)中代替溶解小肠粘膜水，收集步骤(2)所述用于吸附后的树脂，并用自来水清洗至无粘膜杂质为止；
(4)脱附：将步骤(3)所述的清洗后的树脂按1:1的配比浸入盐度为24-25度的盐水中，并控制温度在45-50℃，搅拌3-4h后收集一次洗脱液，并调节一次洗脱液盐度为19-21度；将一次洗脱后的树脂按1:1的配比浸入18.5-19度的盐水中，温度控制在45-50℃，搅拌3-4h收集二次洗脱液，调节二次洗脱液盐度为19-21度；
(5)除杂：将步骤(4)中所述的一次洗脱液及二次洗脱液进行合并，并加入NaOH 溶液将pH调节至10-11，静置沉淀20-22h，抽出上层药液，并用120-130目双层纱布进行过滤，得到清液；
(6)沉淀：将步骤(5)中所述的除杂后的清液加入盐酸调节pH至7.0-7.3，加入80％以上乙醇进行沉淀直至酒精计测测酒精度为10-11％，酒精需快搅慢加，并封存24-40h，得到的下层浆糊即为糊状肝素钠；
(7)干燥：将步骤(6)所述的糊状肝素钠加入沉淀物体积90％的酒精，静置沉淀21-22h，滤去上部酒精，并在55-58℃进行烘干至恒重，得到粗品肝素钠。
更进一步地，当步骤(2)中所述吸附进行3.5-4h时，再次加入重量比为树脂：小肠为0.2-0.4：100的树脂进行二次吸附，以增加肝素钠的收率。
更进一步地，将步骤(4)中所述的二次洗脱后的树脂浸入盐度为15-16度的盐水中，控制温度为45-50℃，搅拌3-4h收集三次洗脱液，并调节三次洗脱液盐度为24-25度，将三次洗脱液用于下次生产时进行第一次洗脱时用，使得树脂上吸附的肝素钠完全脱附，并将剩余的少量肝素钠留待下一次脱附时进行回收处理，减少了肝素钠的浪费，同时也能减少每次生产时后期除杂所述的碱液及盐酸，减少生产成本。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明将盐解后分离出的残渣作为饲料，减少了对环境的污染；将在不同盐度下对树脂进行两次脱附的脱附液用于沉淀提取肝素钠粗品，提高了肝素钠的收率；增加了盐解时的盐度，使得对肝素钠的提取更为有效，同时在吸附时配合适当的吸附条件及吸附效果好的WD-1701对盐解液中的肝素钠进行吸附，使得吸附效果并没有因为盐解时盐度升高而受到影响，最终大幅度提高了肝素钠的产量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。本发明的实施方式包括但不限于下列实施例。
实施例1
一种从动物体中提取肝素钠的方法，包括以下步骤：
(1)盐解：将用于提取肝素钠新鲜小肠粘膜绞碎，按水与绞碎的小肠粘膜重量比为5.5:1的配比向绞碎的小肠粘膜中加入水混合均匀，并加入盐或盐水调节盐度为6.2度，再加入NaOH溶液调节pH至9.5，先升温至50℃，保温2h，而后升温至92℃，保温12min，捞出残渣并收集作为饲料，剩下混合液；
(2)吸附：用130目双层纱布过滤步骤(1)中所述的混合液，并将得到的滤渣按步骤(1)进行二次提取，将两次所得滤液进行合并在一起，并加入清水调节盐度2.6度，调节pH为8.3，控制温度为55℃，加入预处理好的树脂，进行搅拌吸附，搅拌速度为60-80r/min, 搅拌时间为5h，其中所用树脂为德国肝素钠树脂WD-1701，使用重量比为树脂：小肠为1:60；在吸附时，需进行搅拌使树脂上下翻动，否则树脂的吸附效果差，最终导致产品收率低；
(3)树脂清洗：将步骤(2)所述的经树脂吸附后的溶液收集起来，作为下次步骤(1)中代替溶解小肠粘膜水，收集步骤(2)所述用于吸附后的树脂，并用自来水清洗至无粘膜杂质为止；
(4)脱附：将步骤(3)所述的清洗后的树脂按1:1的配比浸入盐度为24度的盐水中，并控制温度在45℃，搅拌3h后收集一次洗脱液，并调节一次洗脱液盐度为19度；将一次洗脱后的树脂按1:1的配比浸入18.5度的盐水中，温度控制在45℃，搅拌3h收集二次洗脱液，调节二次洗脱液盐度为19度；
(5)除杂：将步骤(4)中所述的一次洗脱液及二次洗脱液进行合并，并加入NaOH 溶液将pH调节至10，静置沉淀20h，抽出上层药液，并用120目双层纱布进行过滤，得到清液；
(6)沉淀：将步骤(5)中所述的除杂后的清液加入盐酸调节pH至7.0，加入80％以上乙醇进行沉淀直至酒精计测测酒精度为10％，酒精需快搅慢加，并封存24h，得到的下层浆糊即为糊状肝素钠；在抽出上层酒精时，不可抽动沉淀的糊状肝素钠，且在实际生产过程中，可将多次生产的糊状肝素钠集中在一起进行干燥，以便节省能源，减少成本；
(7)干燥：将步骤(6)所述的糊状肝素钠加入沉淀物体积90％的酒精，静置沉淀21h，滤去上部酒精，并在55℃进行烘干至恒重，得到粗品肝素钠；在干燥时，干燥温度必须进行严格控制，温度过低，会使得干燥缓慢，而温度过高会使得肝素钠的生物活性下降，影响肝素钠的质量。
实施例2
一种从动物体中提取肝素钠的方法，包括以下步骤：
(1)盐解：将用于提取肝素钠新鲜小肠粘膜绞碎，按水与绞碎的小肠粘膜重量比为5.5:1的配比向绞碎的小肠粘膜中加入水混合均匀，并加入盐或盐水调节盐度为6.2度，再加入NaOH溶液调节pH至906，先升温至53℃，保温2h，而后升温至94℃，保温11min，捞出残渣并收集作为饲料，剩下混合液；
(2)吸附：用145目双层纱布过滤步骤(1)中所述的混合液，并将得到的滤渣按步骤(1)进行二次提取，将两次所得滤液进行合并在一起，并加入清水调节盐度2.7度，调节pH为8.5，控制温度为56℃，加入预处理好的树脂，进行搅拌吸附，搅拌速度为60-80r/min, 搅拌时间为6h，其中所用树脂为德国肝素钠树脂WD-1701，使用重量比为树脂：小肠为 1.15:60；
(3)树脂清洗：将步骤(2)所述的经树脂吸附后的溶液收集起来，作为下次步骤(1)中代替溶解小肠粘膜水，收集步骤(2)所述用于吸附后的树脂，并用自来水清洗至无粘膜杂质为止；
(4)脱附：将步骤(3)所述的清洗后的树脂按1:1的配比浸入盐度为24.5度的盐水中，并控制温度在48℃，搅拌3.5h后收集一次洗脱液，并调节一次洗脱液盐度为20度；将一次洗脱后的树脂按1:1的配比浸入18.8度的盐水中，温度控制在48℃，搅拌3.5h收集二次洗脱液，调节二次洗脱液盐度为20度；
(5)除杂：将步骤(4)中所述的一次洗脱液及二次洗脱液进行合并，并加入NaOH 溶液将pH调节至10.5，静置沉淀21h，抽出上层药液，并用125目双层纱布进行过滤，得到清液；
(6)沉淀：将步骤(5)中所述的除杂后的清液加入盐酸调节pH至7.2，加入80％以上乙醇进行沉淀直至酒精计测测酒精度为10.5％，酒精需快搅慢加，并封存30h，得到的下层浆糊即为糊状肝素钠；
(7)干燥：将步骤(6)所述的糊状肝素钠加入沉淀物体积90％的酒精，静置沉淀21.5h，滤去上部酒精，并在57℃进行烘干至恒重，得到粗品肝素钠。
进一步地，当步骤(2)中所述吸附进行3.5-4h时，再次加入重量比为树脂：小肠为0.2-0.4：100的树脂进行二次吸附，以增加肝素钠的收率。
进一步地，将步骤(4)中所述的二次洗脱后的树脂浸入盐度为15-16度的盐水中，控制温度为45-50℃，搅拌3-4h收集三次洗脱液，并调节三次洗脱液盐度为24-25度，将三次洗脱液用于下次生产时进行第一次洗脱时用，使得树脂上吸附的肝素钠完全脱附，并将剩余的少量肝素钠留待下一次脱附时进行回收处理，减少了肝素钠的浪费，同时也能减少每次生产时后期除杂所述的碱液及盐酸，减少生产成本。
实施例3
一种从动物体中提取肝素钠的方法，包括以下步骤：
(1)盐解：将用于提取肝素钠新鲜小肠粘膜绞碎，按水与绞碎的小肠粘膜重量比为5.5:1的配比向绞碎的小肠粘膜中加入水混合均匀，并加入盐或盐水调节盐度为6.2度，再加入NaOH溶液调节pH至9.7，先升温至55℃，保温2h，而后升温至95℃，保温10min，捞出残渣并收集作为饲料，剩下混合液；
(2)吸附：用150目双层纱布过滤步骤(1)中所述的混合液，并将得到的滤渣按步骤(1)进行二次提取，将两次所得滤液进行合并在一起，并加入清水调节盐度2.8度，调节pH为8.7，控制温度为58℃，加入预处理好的树脂，进行搅拌吸附，搅拌速度为60-80r/min, 搅拌时间为7h，其中所用树脂为德国肝素钠树脂WD-1701，使用重量比为树脂：小肠为 1.2:60；
(3)树脂清洗：将步骤(2)所述的经树脂吸附后的溶液收集起来，作为下次步骤(1)中代替溶解小肠粘膜水，收集步骤(2)所述用于吸附后的树脂，并用自来水清洗至无粘膜杂质为止；
(4)脱附：将步骤(3)所述的清洗后的树脂按1:1的配比浸入盐度为25度的盐水中，并控制温度在50℃，搅拌3-4h后收集一次洗脱液，并调节一次洗脱液盐度为21度；将一次洗脱后的树脂按1:1的配比浸入19度的盐水中，温度控制在50℃，搅拌4h收集二次洗脱液，调节二次洗脱液盐度为21度；
(5)除杂：将步骤(4)中所述的一次洗脱液及二次洗脱液进行合并，并加入NaOH 溶液将pH调节至11，静置沉淀22h，抽出上层药液，并用130目双层纱布进行过滤，得到清液；
(6)沉淀：将步骤(5)中所述的除杂后的清液加入盐酸调节pH至7.3，加入80％以上乙醇进行沉淀直至酒精计测测酒精度为11％，酒精需快搅慢加，并封存40h，得到的下层浆糊即为糊状肝素钠；
(7)干燥：将步骤(6)所述的糊状肝素钠加入沉淀物体积90％的酒精，静置沉淀22h，滤去上部酒精，并在58℃进行烘干至恒重，得到粗品肝素钠。
进一步地，当步骤(2)中所述吸附进行3.5-4h时，再次加入重量比为树脂：小肠为0.2-0.4：100的树脂进行二次吸附，以增加肝素钠的收率。
进一步地，将步骤(4)中所述的二次洗脱后的树脂浸入盐度为15-16度的盐水中，控制温度为45-50℃，搅拌3-4h收集三次洗脱液，并调节三次洗脱液盐度为24-25度，将三次洗脱液用于下次生产时进行第一次洗脱时用，使得树脂上吸附的肝素钠完全脱附，并将剩余的少量肝素钠留待下一次脱附时进行回收处理，减少了肝素钠的浪费，同时也能减少每次生产时后期除杂所述的碱液及盐酸，减少生产成本。
如上所述即为本发明的实施例。本发明不局限于上述实施方式，任何人应该得知在本发明的启示下做出的结构变化，凡是与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种从动物体中提取肝素钠的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)盐解：将用于提取肝素钠新鲜小肠粘膜绞碎，按水与绞碎的小肠粘膜重量比为5.5:1的配比向绞碎的小肠粘膜中加入水混合均匀，并加入盐或盐水调节盐度为6.2度，再加入NaOH溶液调节pH至9.5-9.7，先升温至50-55℃，保温2h，而后升温至92-95℃，保温10-12min，捞出残渣并收集作为饲料，剩下混合液；
(2)吸附：用130-150目双层纱布过滤步骤(1)中所述的混合液，并将得到的滤渣按步骤(1)进行二次提取，将两次所得滤液进行合并在一起，并加入清水调节盐度2.6-2.8度，调节pH为8.3-8.7，控制温度为55-58℃，加入预处理好的树脂，进行搅拌吸附，搅拌时间为5-7h，其中所用树脂为德国肝素钠树脂WD-1701，使用重量比为树脂：小肠为1-1.2:60；
(3)树脂清洗：将步骤(2)所述的经树脂吸附后的溶液收集起来，作为下次步骤(1)中代替溶解小肠粘膜水，收集步骤(2)所述用于吸附后的树脂，并用自来水清洗至无粘膜杂质为止；
(4)脱附：将步骤(3)所述的清洗后的树脂按1:1的配比浸入盐度为24-25度的盐水中，并控制温度在45-50℃，搅拌3-4h后收集一次洗脱液，并调节一次洗脱液盐度为19-21度；将一次洗脱后的树脂按1:1的配比浸入18.5-19度的盐水中，温度控制在45-50℃，搅拌3-4h收集二次洗脱液，调节二次洗脱液盐度为19-21度；
(5)除杂：将步骤(4)中所述的一次洗脱液及二次洗脱液进行合并，并加入NaOH溶液将pH调节至10-11，静置沉淀20-22h，抽出上层药液，并用120-130目双层纱布进行过滤，得到清液；
(6)沉淀：将步骤(5)中所述的除杂后的清液加入盐酸调节pH至7.0-7.3，加入80％以上乙醇进行沉淀直至酒精计测测酒精度为10-11％，酒精需快搅慢加，并封存24-40h，得到的下层浆糊即为糊状肝素钠；
(7)干燥：将步骤(6)所述的糊状肝素钠加入沉淀物体积90％的酒精，静置沉淀21-22h，滤去上部酒精，并在55-58℃进行烘干至恒重，得到粗品肝素钠。
2.如权利要求1所述的一种从动物体中提取肝素钠的方法，其特征在于，当步骤(2)中所述吸附进行3.5-4h时，再次加入重量比为树脂：小肠为0.2-0.4：100的树脂进行二次吸附。
3.如权利要求1所述的一种从动物体中提取肝素钠的方法，其特征在于，将步骤(4)中所述的二次洗脱后的树脂浸入盐度为15-16度的盐水中，控制温度为45-50℃，搅拌3-4h收集三次洗脱液，并调节三次洗脱液盐度为24-25度，将三次洗脱液用于下次生产时进行第一次洗脱时用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180724 |
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