CN104177511A - 反萃取法制备硫酸软骨素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了反萃取法制备硫酸软骨素的方法，该硫酸软骨素制备方法包括下列步骤：（1）蒸煮、碱提；（2）酶解；（3）吸附；（4）反萃取；（5）沉淀、干燥。本发明的生产工艺简单，适合规模化生产，产品质量稳定，硫酸软骨素回收率达到80%以上。

Description

反萃取法制备硫酸软骨素的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种反萃取法制备硫酸软骨素的方法。
背景技术
硫酸软骨素，英文名chondroitin sulfate，是以动物（猪、牛、马、羊、鸡、鲨鱼等）的软骨为原料的一种高分子酸性粘多糖，其分子结构为β-D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖通过β1→3糖苷键形成的重复二糖单位所组成的多糖链。它是一种白色或微黄色粉末，吸水性强，易溶于水而成粘稠液体，不溶于酒精、丙酮、乙醚和氯仿等有机溶剂，其盐类对热较稳定。硫酸软骨素的生物活性，随分子量而不同。其药理活性与分子量有密切关系，分子量的大小对口服后肠胃吸收率的影响也十分明显。
目前，硫酸软骨素的提取方法有酶解、碱法、超声波法和中性盐法等；其分离纯化有乙醇沉淀法、离子交换色谱法、季铵盐配合法、吸附法和纤维素分离法等。提取硫酸软骨素主要采用碱-酶提取法，包括如下步骤：碱提、酶解、氧化、醇沉，操作过程繁琐，周期长，生产成本高，产品纯度低。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种反萃取法制备硫酸软骨素的方法，操作过程简单，避免氧化及多次醇沉工序，缩短周期，制备的硫酸软骨素的产品纯度高。   
本发明采取以下技术解决方案予以实现：该反萃取法制备硫酸软骨素的方法包括下列步骤：
（1）蒸煮、碱提：先将软骨在80-100℃水中煮4-6ｈ，然后加入原料干重的6.25倍的质量浓度3％氢氧化钠溶液，30-40℃提取1.5-2ｈ，再用盐酸调pH到5.5-6.5，纱布过滤，留下滤液；
（2）酶解：将步骤（1）的滤液调节pH8.0～9.0，按滤液与胰酶1000∶0.5-2的质量比加入胰酶，于40～50℃水解4h，再按滤液与胃蛋白酶1000∶0.5-2的质量比加入胃蛋白酶，40～50℃水解3ｈ，过滤；
（3）吸附：步骤（2）的酶解液中加入吸附剂吸附，缓慢间歇搅拌4h，置4℃自然澄清，取上清液；
（4）反萃取：将步骤（3）的上清液按体积比1∶1加入氯仿进行反萃取，静置分层后留水层；
（5）沉淀、干燥：将步骤（4）的萃取液调PH6，加入体积的2.5倍量酒精沉淀，沉淀后再用质量浓度95%酒精脱水两次，干燥，粉碎，得硫酸软骨素成品。
其中，步骤（3）的吸附剂为硅藻土、高岭土或活性炭，其终浓度0.2%-0.8%。
本发明的效果是：应用反萃取法制备硫酸软骨素，方法简单，工艺周期短，减少碱解带来的环境污染，所得的硫酸软骨素产品纯度高，收率好。
具体实施方式
    下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，这些实施例不能理解为是对技术方案的限制。
实施例1：依以下步骤制备硫酸软骨素
（1）蒸煮、碱提：先将2公斤软骨原料加水浸没，在80℃水中煮6ｈ，使附在软骨表面的肌肉组织剥离，漏勺捞出软骨；软骨放入反应釜，加入12.5公斤质量浓度3％氢氧化钠溶液，30℃提取2ｈ，再用盐酸调pH到5.5，纱布过滤，留下滤液；
（2）酶解：将步骤（1）的滤液调节pH8.0，按滤液与胰酶1000∶0.5的质量比加入胰酶，于40℃水解4h，再按滤液与胃蛋白酶1000∶0.5的质量比加入胃蛋白酶，40℃水解3ｈ，过滤；
（3）吸附：步骤（2）的酶解液中加入硅藻土吸附，硅藻土终浓度为0.2%，缓慢间歇搅拌4h，置4℃自然澄清，取上清液；
（4）反萃取：将步骤（3）的上清液按体积比1∶1加入氯仿进行反萃取，静置分层后留水层；
（5）沉淀、干燥：将步骤（4）的萃取液调PH6，加入其体积的2.5倍量酒精沉淀，沉淀后再用质量浓度95%酒精脱水两次，干燥，粉碎，得125g硫酸软骨素成品；其中，硫酸软骨素成品中葡萄糖醛酸的含量达35.0%。
实施例2：依以下步骤制备硫酸软骨素
（1）蒸煮、碱提：先将2公斤软骨原料加水浸没，在90℃水中煮5ｈ，使附在软骨表面的肌肉组织剥离，漏勺捞出软骨；软骨放入反应釜，加入12.5公斤质量浓度3％氢氧化钠溶液，35℃提取1.75ｈ，再用盐酸调pH到6.0，纱布过滤，留下滤液；
（2）酶解：将步骤（1）的滤液调节pH8.5，按滤液与胰酶1000∶1.25的质量比加入胰酶，于45℃水解4h，再按滤液与胃蛋白酶1000∶1.25的质量比加入胃蛋白酶，45℃水解3ｈ，过滤；
（3）吸附：步骤（2）的酶解液中加入高岭土吸附，高岭土终浓度为0.5%，缓慢间歇搅拌4h，置4℃自然澄清，取上清液；
（4）反萃取：将步骤（3）的上清液按体积比1∶1加入氯仿进行反萃取，静置分层后留水层；
（5）沉淀、干燥：将步骤（4）的萃取液调PH6，加入体积的2.5倍量酒精沉淀，沉淀后再用质量浓度95%酒精脱水两次，干燥，粉碎，得127g硫酸软骨素成品；其中，硫酸软骨素成品中葡萄糖醛酸的含量达35.7%。
实施例3：依以下步骤制备硫酸软骨素
（1）蒸煮、碱提：先将2公斤软骨原料加水浸没，在100℃水中煮4ｈ，使附在软骨表面的肌肉组织剥离，漏勺捞出软骨；软骨放入反应釜，加入12.5公斤
质量浓度3％氢氧化钠溶液，40℃提取1.5ｈ，再用盐酸调pH到6.5，纱布过滤，留下滤液；
（2）酶解：将步骤（1）的滤液调节pH9.0，按滤液与胰酶1000∶2的质量比加入胰酶，于50℃水解4h，再按滤液与胃蛋白酶1000∶2的质量比加入胃蛋白酶，50℃水解3ｈ，过滤；
（3）吸附：步骤（2）的酶解液中加入活性炭吸附，活性炭终浓度为0.8%，缓慢间歇搅拌4h，置4℃自然澄清，取上清液；
（4）反萃取：将步骤（3）的上清液按体积比1∶1加入氯仿进行反萃取，静置分层后留水层；
（5）沉淀、干燥：将步骤（4）的萃取液调PH6，加入体积的2.5倍量酒精沉淀，沉淀后再用质量浓度95%酒精脱水两次，干燥，粉碎，得128g硫酸软骨素成品；硫酸软骨素成品中葡萄糖醛酸的含量达36.5%。

Claims (2)

1.反萃取法制备硫酸软骨素的方法，其特征是该硫酸软骨素制备方法包括下列步骤：
（1）蒸煮、碱提：先将软骨在80-100℃水中煮4-6ｈ，然后加入原料干重的6.25倍的质量浓度3％氢氧化钠溶液，30-40℃提取1.5-2ｈ，再用盐酸调pH到5.5-6.5，纱布过滤，留下滤液；
（2）酶解：将步骤（1）的滤液调节pH8.0～9.0，按滤液与胰酶1000∶0.5-2的质量比加入胰酶，于40～50℃水解4h，再按滤液与胃蛋白酶1000∶0.5-2的质量比加入胃蛋白酶，40～50℃水解3ｈ，过滤；
（3）吸附：步骤（2）的酶解液中加入吸附剂吸附，缓慢间歇搅拌4h，置4℃自然澄清，取上清液；
（4）反萃取：将步骤（3）的上清液按体积比1∶1加入氯仿进行反萃取，静置分层后留水层；
（5）沉淀、干燥：将步骤（4）的萃取液调PH6，加入体积的2.5倍量酒精沉淀，沉淀后再用质量浓度95%酒精脱水两次，干燥，粉碎，得硫酸软骨素成品。
2.如权利要求1所述的反萃取法制备硫酸软骨素的方法，其特征是：步骤（3）的吸附剂为硅藻土、高岭土或活性炭，其终浓度0.2%-0.8%。
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