CN108727514A - 一种提取鹅骨中硫酸软骨素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种硫酸软骨素的提取方法，具体涉及一种从鹅骨中提取硫酸软骨素的方法。本发明通过鹅骨预处理、碱解、双酶解、除杂、沉淀、干燥，有效提高了硫酸软骨素的提取率，提取率达到11.61％。
Description
技术领域
本发明涉及一种硫酸软骨素的提取方法，具体涉及一种从鹅骨中提取硫酸软骨素的方法。
技术背景
硫酸软骨素(Chondroitin sulfate，简称CS)，是一种酸性粘多糖，属糖胺聚糖类物质，一般呈白色或微黄色的粉末，略带碱味。硫酸软骨素存在于从线虫到人除植物外的所有生物中，发挥着许多重要的生理功能。虽然多糖的主链结构并不复杂，但就硫酸化程度、硫酸基和两种差异向异构糖醛酸再链内的分布来说，呈现高度的不均一性。硫酸软骨素的精细结构决定着功能的特异性和与多种蛋白质分子的相互作用。根据硫酸软骨素分子结构中糖醛酸种类和氨基已糖上硫酸酯的位置不同，硫酸软骨素有CS—A、B、C、D、E等多种异构体。近年来，CS的研究已逐渐受到人们的重视。
国家知识产权局于2010年9月29日公开了一件公开号为CN101845103A，名称为“一种硫酸软骨素的制备方法”的发明专利，该专利公开了一种硫酸软骨素的制备方法,属于生物工程领域。本方法采用超声波法包括预处理、提取、超声除杂、脱色、沉淀以及脱水等工艺步骤，可以保持生物活性，提高了破碎速度，缩短了破碎时间，可极大地提高提取效率，降低成本。上述专利中的硫酸软骨素的制备方法原料成本和生产成本都很高，且制得的硫酸软骨素质量不理想，收率较低。综合比较国内外的文献得知，采用浓碱和中碱提取工艺，虽然其提取速度较快，但是硫酸软骨素的品质较差、色泽黄或浅红、易变质，且提取过程中药品消耗量大，污染严重。
发明内容
本发明的目的是：提供一种从鹅骨中提取硫酸软骨素的方法，该硫酸软骨素的提取方法，以鹅骨为原料，成本低，提取率高。
一种提取鹅骨中硫酸软骨素的方法，包含以下步骤：
(1)鹅骨预处理:将鹅骨投入恒温蒸煮锅,在90℃条件下，煮2～4h,然后捞起鹅骨并用自来水冲洗干净,放入电热恒温鼓风干燥箱，在100℃条件下，烘烤6～8h，烘烤结束后，立即绞碎。
(2)碱解：准确称量步骤S1得到的鹅骨粉5g，加入30-35g质量分数为5％的NaOH溶液,室温浸提12h,然后用超声波辅助提取3h，再用2mol/L HCl溶液调pH至6～6.8。双层纱布过滤，留下滤液。滤渣再以2∶1的重量比例加入质量分数为5％的NaOH溶液,再用超声波辅助提取提取1h,再用双层滤布过滤,弃滤渣,取滤液。合并两次滤液。
(3)酶解:将步骤S2得到的滤液用2mol/L的HCl溶液调节pH至8.0～9.0,加入滤液重量0.15-0.25％的胰蛋白酶,在35～55℃条件下，水解2-10h,于90℃恒温水浴20min灭活，调节水解液至pH2.0～4.0，再加入重量比0.15-0.25％的胃蛋白酶,在40～50℃条件下，水解2-4h。
(4)除杂：步骤S3得到的酶解液用4层纱布过滤,并加入酶解液质量1％的高岭土和活性炭混合物，混合物中高岭土与活性炭质量比为1:1，进行吸附,同时慢速间歇搅拌4h或快速升温至90℃，间歇搅拌30min,冷却后抽滤。
(5)沉淀:将步骤S4得到的滤液,调pH至6.8～7.2,加入Nacl，使溶液中Nacl质量分数为3％，再加入2.5倍体积的95％乙醇，进行沉淀,弃清液,用95％的乙醇洗涤3～4次，以6000r/min离心10～15min,收集沉淀,其沉淀物即为硫酸软骨素粗成品。
(6)干燥:将步骤S5得到的沉淀物放入电热恒温鼓风干燥箱，在60～80℃条件下进行干燥，即得粗成品。
本发明的技术效果和优点：
本发明以鹅骨为原料，采用胰蛋白酶和胃蛋白酶分阶段酶解工艺，有效提高了硫酸软骨素的提取率，提取率达到11.61％。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
(1)鹅骨预处理:将鹅骨投入恒温蒸煮锅,在90℃条件下，煮2h,然后捞起鹅骨并用自来水冲洗干净,放入电热恒温鼓风干燥箱，在100℃条件下，烘烤6h，烘烤结束后，立即绞碎。
(2)碱解：准确称量步骤S1得到的鹅骨粉5g，加入30g质量分数为5％的NaOH溶液,室温浸提12h,然后用超声波辅助提取3h，再用2mol/L HCl溶液调pH至6.0。双层纱布过滤，留下滤液。滤渣再以2∶1的重量比例加入质量分数为5％的NaOH溶液,再用超声波辅助提取提取1h,再用双层滤布过滤,弃滤渣,取滤液。合并两次滤液。
(3)酶解:将步骤S2得到的滤液用2mol/L的HCl溶液调节pH至8.0,加入滤液重量0.2％的胰蛋白酶,在35℃条件下，水解2h,于90℃恒温水浴20min灭活，调节水解液至pH3.0，再加入重量比0.15％的胃蛋白酶,在40℃条件下，水解4h。
(4)除杂：步骤S3得到的酶解液用4层纱布过滤,并加入酶解液质量1％的高岭土和活性炭混合物，混合物中高岭土与活性炭质量比为1:1，进行吸附,同时慢速间歇搅拌4h或快速升温至90℃，间歇搅拌30min,冷却后抽滤。
(5)沉淀:将步骤S4得到的滤液,调pH至7.0,加入Nacl，使溶液中Nacl质量分数为3％，再加入2.5倍体积的95％乙醇，进行沉淀,弃清液,用95％的乙醇洗涤3次，以6000r/min离心10min,收集沉淀,其沉淀物即为硫酸软骨素粗成品。
(6)干燥:将步骤S5得到的沉淀物放入电热恒温鼓风干燥箱，在60～80℃条件下进行干燥，既得硫酸软骨素成品0.43g,提取率8.％。
实施例2：
(1)鹅骨预处理:将鹅骨投入恒温蒸煮锅,在90℃条件下，煮3h，然后捞起鹅骨并用自来水冲洗干净,放入电热恒温鼓风干燥箱，在100℃条件下，烘烤7h，烘烤结束后，立即绞碎。
(2)碱解：准确称量步骤S1得到的鹅骨粉5g，加入31.25g质量分数为5％的NaOH溶液,室温浸提12h,然后用超声波辅助提取3h，再用2mol/L HCl溶液调pH至6.5。双层纱布过滤，留下滤液。滤渣再以2∶1的重量比例加入质量分数为5％的NaOH溶液,再用超声波辅助提取提取1h,再用双层滤布过滤,弃滤渣,取滤液。合并两次滤液。
(3)酶解:将步骤S2得到的滤液用2mol/L的HCl溶液调节pH至8.5,加入滤液重量0.15％的胰蛋白酶,在40℃条件下，水解4h,于90℃恒温水浴20min灭活，调节水解液至pH4.0，再加入重量比0.2％的胃蛋白酶,在45℃条件下，水解3h。
(4)除杂：步骤S3得到的酶解液用4层纱布过滤,并加入酶解液质量1％的高岭土和活性炭混合物，混合物中高岭土与活性炭质量比为1:1，进行吸附,同时慢速间歇搅拌4h或快速升温至90℃，间歇搅拌30min,冷却后抽滤。
(5)沉淀:将步骤S4得到的滤液,调pH至7.2,加入Nacl，使溶液中Nacl质量分数为3％，再加入2.5倍体积的95％乙醇，进行沉淀,弃清液,用95％的乙醇洗涤3次，以6000r/min离心15min,收集沉淀,其沉淀物即为硫酸软骨素粗成品。
(6)干燥:将步骤S5得到的沉淀物放入电热恒温鼓风干燥箱，在75℃条件下进行干燥，既得硫酸软骨素成品0.5805g,提取率11.61.％。
实施例3：
(1)鹅骨预处理:将鹅骨投入恒温蒸煮锅,在90℃条件下，煮4h，然后捞起鹅骨并用自来水冲洗干净,放入电热恒温鼓风干燥箱，在100℃条件下，烘烤8h，烘烤结束后，立即绞碎。
(2)碱解：准确称量步骤S1得到的鹅骨粉5g，加入35g质量分数为5％的NaOH溶液,室温浸提12h,然后用超声波辅助提取3h，再用2mol/L HCl溶液调pH至6.8。双层纱布过滤，留下滤液。滤渣再以2∶1的重量比例加入质量分数为5％的NaOH溶液,再用超声波辅助提取提取1h,再用双层滤布过滤,弃滤渣,取滤液。合并两次滤液。
(3)酶解:将步骤S2得到的滤液用2mol/L的HCl溶液调节pH至9.0,加入滤液重量0.25％的胰蛋白酶,在55℃条件下，水解10h,于90℃恒温水浴20min灭活，调节水解液至pH2.0，再加入重量比0.2％的胃蛋白酶,在50℃条件下，水解3h。
(4)除杂：步骤S3得到的酶解液用4层纱布过滤,并加入酶解液质量1％的高岭土和活性炭混合物，混合物中高岭土与活性炭质量比为1:1，进行吸附,同时慢速间歇搅拌4h或快速升温至90℃，间歇搅拌30min,冷却后抽滤。
(5)沉淀:将步骤S4得到的滤液,调pH至6.8,加入Nacl，使溶液中Nacl质量分数为3％，再加入2.5倍体积的95％乙醇，进行沉淀,弃清液,用95％的乙醇洗涤4次，以6000r/min离心13min,收集沉淀,其沉淀物即为硫酸软骨素粗成品。
(6)干燥:将步骤S5得到的沉淀物放入电热恒温鼓风干燥箱，在75℃条件下进行干燥，既得硫酸软骨素成品0.56g,提取率11.2.％。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其效物界定。
Claims (2)
1.一种提取鹅骨中硫酸软骨素的方法，其特征在于：包含以下步骤：
S1.鹅骨预处理:将鹅骨投入恒温蒸煮锅,在90℃条件下，煮2～4h,然后捞起鹅骨并用自来水冲洗干净,放入电热恒温鼓风干燥箱，在100℃条件下，烘烤6～8h，烘烤结束后，立即绞碎。
S2.碱解：准确称量步骤S1得到的鹅骨粉5g，加入30-35g质量分数为5％的NaOH溶液,室温浸提12h,然后用超声波辅助提取3h，再用2mol/L HCl溶液调pH至6～6.8。双层纱布过滤，留下滤液。滤渣再以2∶1的重量比例加入质量分数为5％的NaOH溶液,再用超声波辅助提取1h,再用双层滤布过滤,弃滤渣,取滤液。合并两次滤液。
S3.酶解:将步骤S2得到的滤液用2mol/L的HCl溶液调节pH至8.0～9.0,加入滤液重量0.15-0.25％的胰蛋白酶,在35～55℃条件下，水解2-10h,于90℃恒温水浴20min灭活，调节水解液至pH2.0～4.0，再加入重量比0.15-0.25％的胃蛋白酶,在40～50℃条件下，水解2-4h。
S4.除杂：步骤S3得到的酶解液用4层纱布过滤,并加入酶解液质量1％的高岭土和活性炭混合物，进行吸附,同时慢速间歇搅拌4h或快速升温至90℃，间歇搅拌30min,冷却后抽滤。
S5.沉淀:将步骤S4得到的滤液,调pH至6.8～7.2,加入Nacl，使溶液中Nacl质量分数为3％，再加入2.5倍体积的95％乙醇，进行沉淀,弃清液,用95％的乙醇洗涤3～4次，以6000r/min离心10～15min,收集沉淀,其沉淀物即为硫酸软骨素粗成品。
S6.干燥:将步骤S5得到的沉淀物放入电热恒温鼓风干燥箱，在60～80℃条件下进行干燥，即得粗成品。
2.根据权利要求1所述的一种提取鹅骨中硫酸软骨素的方法，其特征在于：步骤S4中所述的高岭土和活性炭混合物,高岭土与活性炭质量比为1:1。
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