CN103755837A - 一种利用猪小肠制备肝素钠的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从猪小肠粘膜中分离出生化药物的制备方法,特别公开了一种利用猪小肠制备肝素钠的方法。该利用猪小肠生产肝素钠的制备方法,其特征是:包括如下步骤:肠粘膜的制备、酶解、吸附、洗脱、沉淀脱盐和脱水干燥即得肝素钠。因此,本发明的有益效果是:收率高,肝素钠活性损失小,质量稳定,废液排放无污染且能循环使用,采用车间废气净化处理装置,解决了肝素钠车间气味恶臭的问题:利用旧工艺生产1亿个单位的肝素钠,需要2000-2400根猪小肠,而利用本发明的制备方法生产1亿个单位的肝素钠,只需要1400-1600根猪小肠,且肝素钠效价和洁性都有大幅度提高,从而使生产成本大大降低,利润可提高40%以上。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体涉及到一种用猪小肠制备肝素钠的方法。
背景技术
肝素是一种广泛存在于哺乳动物组织中的黏多糖,主要存在与肥大细胞中,具有抗凝血作用,被广泛用于手术和脑血栓、心肌梗死等的治疗。肝素的分子量大约3000-37500,对商品肝素的研究提示至少有21种分子个体。肝素钠是肝素的钠盐。肝素钠作为天然抗凝血物质受到世界各国的重视。也是我国主要的出口药物之一。随着研究的深入,人们发现肝素钠不但有抗凝、抗血栓形成和调节血脂的作用,还具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等功能。目前,肝素钠主要是从猪、羊小肠黏膜和牛肺、盹肠衣盐水等中提取。研究显示肝素钠是在猪小肠粘膜中含量最高。肝素钠粗品是我国的传统出口产品,在国际上占有重要的地位。但是传统生产工艺落后,肝素钠产率低,肝素钠产品质量不稳定,
生产过程中资源浪费严重,污染环境严重。
发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足,提供了一种收率高、肝素钠活性损失小的利用猪小肠生产肝素钠的制备方法。
发明是通过如下技术方案实现的:
一种利用猪小肠生产肝素钠的制备方法,其特征是:包括如下步骤:
(1)肠粘膜的制备:在猪小肠内灌入清水,用肠衣机挤压出小肠粘膜至粘膜池;
(2)酶解:用粘膜泵将粘膜从粘膜池打入酶解罐中,往酶解罐中加水,粘膜与水的重量比为1∶7-9,搅拌均匀后加入2709碱性蛋白酶调节PH值为8-9,加热使温度达到55℃-60℃,再加入重量百分比为3%-5%的肠衣专用盐,测其盐度达到2%-2.5%,保温2-3小时,继续加热使温度达到80℃-85℃,保温30-40分钟后,用80目尼龙布过滤,收集过滤液;
(3)吸附:将上述过滤液打入吸附罐中,搅拌,待温度降到58℃-60℃时加入树脂,搅拌8-10小时,继续冷却到40℃-45℃,放出废液,收集过滤树脂;
(4)洗脱:
(4-1):将收集的树脂反复冲洗后倒入洗脱器中,加入质量分数为5%-7%的盐水,温度保持在50℃-55℃,搅拌30-40分钟;
(4-2):随后将废液倒掉,加入质量分数为20%-24%的盐水,温度保持在50℃-55℃,搅拌3-4小时后,收集洗脱液;
(4-3):重复(4-2)的步骤,将两次收集的洗脱液合并待用;
(5)沉淀脱盐:
将上述洗脱液过滤移入沉淀罐中,边搅拌边加入质量分数为80%-85%的乙醇,调PH值至7-8,搅匀密封沉淀23-25小时,虹吸上层清液用于回收乙醇,收集沉淀物待用;
(6)脱水干燥:将上述沉淀物滤干脱水,放入烘箱干燥后即得肝素钠。
步骤(2)酶解中粘膜与2709碱性蛋白酶的重量比为500∶1。
说明书
步骤(3)吸附中树脂的添加量按每根猪小肠加入20-30克树脂的比例添加。
步骤(4-1)中树脂与加入的质量分数为5%-7%盐水的重量比为1∶1.1-1.3,步骤
(4-2)中树脂与加入的质量分数为20%-24%盐水的重量比为1∶1.1-1.3。
步骤(4-3)收集完洗脱液后,再接着加入质量分数为20%-24%的盐水,温度保持在50℃-55℃,搅拌30-40分钟后,收集洗脱液做高浓度盐水循环使用。
步骤(5)沉淀脱盐中搅拌加入预冷过的乙醇。
步骤(5)沉淀脱盐中洗脱液与乙醇的体积比为1∶1.8-2.2。
步骤(6)脱水干燥中烘箱的温度为80℃-90℃,干燥时间为6-8小时。
上述步骤(3)吸附中,所加树脂为德国拜耳树脂;步骤(4)洗脱中,盐水是指用肠衣专用盐所配制的水溶液。
为了使粘膜刮制容易,常习惯将小肠浸泡24-48小时,这样能保护肠衣免受破损,但长时间浸泡会发酵产生肝素酶,分解肝素钠,此外发酵还会产生一些有害物质,使树脂中毒,因此在浸泡时间上一定要准确把握,夏季适当缩短时间,冬季可适当延长时间,在弱碱性或质量分数为4%的盐水条件下,能减缓微生物的发酵和抑制肝素酶活性,可以放于低温处作短期贮存。
乙醇沉淀时,必须在搅拌的同时逐渐加入乙醇,以避免局部乙醇浓度突然增高,而且乙醇要用预冷过的,否则就会使肝素钠的部分空间构象受到破坏,从而降低其活性。
酶解、吸附肝素钠过程中的废液(煮锅废水),气味恶臭,致使生产车间空气环境及其混乱,使人难以忍受,甚至影响工作人员的身心健康。为此本发明采用车间废气净化处理装置,大大减少了空气中的恶臭气味,极大改善了工作环境。
因此,本发明的有益效果是:收率高,肝素钠洁性损失小,质量稳定,废液排放无污染且能循环使用,采用车间废气净化处理装置,解决了肝素钠车间气味恶臭的问题;利用旧工艺生产1亿个单位的肝素钠,需要2000-2400根猪小肠,而利用本发明的制备方法生产1亿个单位的肝素钠,只需要1400-1600根猪小肠,且肝素钠效价和活性都有大幅度提高,从而使生产成本大大降低,
利润可提高40%以上。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1:
利用猪小肠生产肝素钠的制备方法,采用如下步骤:
(1)肠粘膜的制备:
取400根猪小肠灌水洗涤,除去残留粪便,清洗干净;将肠内灌入清水,用肠衣机挤压出小肠粘膜,操作用力均匀,粘膜沿着粘膜管道进入粘膜池;刮制过程中的肠头、碎肠皮绞碎后再投入粘膜池,共收集粘膜420千克;
(2)酶解:
打开粘膜泵,将420千克粘膜从粘膜池打入酶解罐中,将3360千克水加入酶解罐中,打开搅拌机进行搅拌,转速为50r/min,搅拌均匀,再加入840克2709碱性蛋白酶添加到酶解罐中,调节PH值为8.0;打开蒸汽阀门使温度达到55℃,加入150千克肠衣专用盐,用盐度计测其盐度达到2.5%,保温2小时;恒温结束后,再打开蒸汽阀门继续加温,使温度达到80℃,停止加温,保温30分钟;保温后,即刻用80目尼龙布过滤,收集过滤液用于吸附;
(3)吸附:
将酶解过滤液打入吸附罐中,打开搅拌机,转速为50r/min,使罐中的温度自然降到58℃,保持溶液的PH值为8.0,盐度2.5%;将10千克树脂加入吸附罐中,搅拌8小时;自然冷却温度到45℃,放出废液,用80目尼龙丝袋收集过滤树脂;
(4)洗脱:
(4-1):将放入尼龙丝袋中的树脂反复冲洗;将冲洗干净的树脂倒入洗脱器中,加入质量分数为5%的盐水,加入盐水的量刚好没过树脂,温度保持在50℃,开启搅拌机转速为30r/min,搅拌30分钟;
(4-2):随后将废液倒掉,加入质量分数为22%的盐水,加入盐水的量刚好没过树脂,温度保持在50℃,开启搅拌机转速30r/min,搅拌3小时后,收集洗脱液;
(4-3):重复(4-2)的步骤一次,将两次收集的洗脱液合并待;
(步骤(4-3)收集完洗脱液后,再接着加入质量分数为22%的盐水,温度保持在50℃,开启搅拌机转速30r/min,搅拌30分钟后,收集洗脱液做高浓度盐水循环使用;)
(5)沉淀脱盐:
将洗脱液过滤移入沉淀罐中,边搅拌边加入质量分数为80%的预冷过的乙醇,加入乙醇的体积量为洗脱液的两倍,使乙醇浓度降到40%,调PH值至7.0,搅匀密封沉淀24小时;虹吸上层清液用于回收乙醇,收集沉淀物待用;
(6)脱水干燥:
将收集的沉淀物滤干脱水;将脱水后的沉淀物移入烘箱在80℃,蒸汽干燥6小时,烘干即得肝素钠。
实施例2:
利用猪小肠生产肝素钠的制备方法,采用如下步骤:
(1)肠粘膜的制备:
取300根猪小肠灌水洗涤,除去残留粪便,清洗干净;将肠内灌入清水,用肠衣机挤压出小肠粘膜,操作用力均匀,粘膜沿着粘膜管道进入粘膜池;刮制过程中的肠头、碎肠皮绞碎后再投入粘膜池,共收集粘膜310千克;
(2)酶解:
打开粘膜泵,将310千克粘膜从粘膜池打入酶解罐中,将2790千克水加入酶解罐中,打开搅拌机进行搅拌,转速为55r/min,搅拌均匀,再加入620克2709碱性蛋白酶添加到酶解罐中,调节PH值为8.0;打开蒸汽阀门使温度达到58℃,加入93千克肠衣专用盐,用盐度计测其盐度达到2.5%,保温2.5小时;恒温结束后,再打开蒸汽阀门继续加温,使温度达到82℃,停止加温,保温35分钟;保温后,即刻用80目尼龙布过滤,收集过滤液用于吸附;
(3)吸附:
将酶解过滤液打入吸附罐中,打开搅拌机,转速为55r/min,使罐中的温度自然降到59℃,保持溶液的PH值为7.5,盐度2.5%;将9千克树脂加入吸附罐中,搅拌9小时;自然冷却温度到42℃,放出废液,用80目尼龙丝袋收集过滤树脂;
(4)洗脱:
(4-1):将放入尼龙丝袋中的树脂反复冲洗;将冲洗干净的树脂倒入洗脱器中,加入质量分数为6%的盐水,加入盐水的量刚好没过树脂,温度保持在52℃,开启搅拌机转速为35r/min,搅拌35分钟;
(4-2):随后将废液倒掉,加入质量分数为20%的盐水,加入盐水的量刚好没过树脂,温度保持在52℃,开启搅拌机转速35r/mn,搅拌3.5小时后,收集洗脱液;
(4-3):重复(4-2)的步骤一次,将两次收集的洗脱液合并待用;
(步骤(4-3)收集完洗脱液后,再接着加入质量分数为20%的盐水,温度保持在52℃,开启搅拌机转速35r/min,搅拌35分钟后,收集洗脱液做高浓度盐水循环使用;)
(5)沉淀脱盐:
将洗脱液过滤移入沉淀罐中,边搅拌边加入质量分数为82%的预冷过的乙醇,加入乙醇的体积量为洗脱液的两倍,使乙醇浓度降到42%,调PH值至7.5,搅匀密封沉淀23小时;虹吸上层清液用于回收乙醇,收集沉淀物待用;
(6)脱水干燥:
将收集的沉淀物滤干脱水;将脱水后的沉淀物移入烘箱在85℃下用蒸汽干燥7小时,烘干即得肝素钠。
实施例3:
利用猪小肠生产肝素钠的制备方法,采用如下步骤:
(1)肠粘膜的制备:
取500根猪小肠灌水洗涤,除去残留粪便,清洗干净;将肠内灌入清水,用肠衣机挤压出小肠粘膜,操作用力均匀,粘膜沿着粘膜管道进入粘膜池;刮制过程中的肠头、碎肠皮绞碎后再投入粘膜池,共收集粘膜50千克;
(2)酶解:
打开粘膜泵,将520千克粘膜从粘膜池打入酶解罐中,将3640千克水加入酶解罐中,打开搅拌机进行搅拌,转速为60r/min,搅拌均匀,再加入1040克2709碱性蛋白酶添加到酶解罐中,调节PH值为9.0;打开蒸汽阀门使温度达到60℃,入208千克肠衣专用盐,用盐度计测其盐度达到2.5%,保温3小时;恒温结束后,再打开蒸汽阀门继续加温使温度达到85℃,停止加温,保温40分钟;保温后,即刻用80目尼龙布过滤,收集过滤液用于吸附;
(3)吸附:
将酶解过滤液打入吸附罐中,打开搅拌机,转速为60r/min,使罐中的温度自然降到60℃,保持溶液的PH值为8.0,盐度2.5%;将10千克树脂加入吸附罐中,搅拌10小时;自然冷却温度到45℃,放出废液,用80目尼龙丝袋收集过滤树脂;
(4)洗脱:
(4-1):将放入尼龙丝袋中的树脂反复冲洗;将冲洗干净的树脂倒入洗脱器中,加入质量分数为7%的盐水,加入盐水的量刚好没过树脂,温度保持在55℃,开启搅拌机转速为40r/min,搅拌40分钟;
(4-2):随后将废液倒掉,加入质量分数为24%的盐水,加入盐水的量刚好没过树脂,温持在55℃,开启搅拌机转速40r/min,搅拌4小时后,收集洗脱液;
(4-3):重复(4-2)的步骤一次,将两次收集的洗脱液合并待用;
(步骤(4-3)收集完洗脱液后,再接着加入质量分数为24%的盐水,温度保持在55℃,开启搅拌机转速40r/min,搅拌40分钟后,收集洗脱液做高浓度盐水循环使用;)
(5)沉淀脱盐:
将洗脱液过滤移入沉淀罐中,边搅拌边加入质量分数为85%的预冷过的乙醇,加入乙醇的体积量为洗脱液的两倍,使乙醇浓度降到45%,调PH值至8.0,搅匀密封沉淀25小时;虹吸上层清液用于回收乙醇,收集沉淀物待用;
(6)脱水干燥:
将收集的沉淀物滤干脱水;将脱水后的沉淀物移入烘箱在90℃蒸汽干燥6小时,烘干即得肝素钠。
上述步骤(3)吸附中,所加树脂为德国拜耳树脂;步骤(4)洗脱中,盐水是指用肠衣专用盐所配制的水溶液。
Claims (8)
1.一种利用猪小肠制备肝素钠的方法,其特征是:包括如下步骤:
(1)肠粘膜的制备:在猪小肠内灌入清水,用肠衣机挤压出小肠粘膜至粘膜池;
(2)酶解:用粘膜泵将粘膜从粘膜池打入酶解罐中,往酶解罐中加水,粘膜与水的重量比为1∶7-9,搅拌均匀后加入2709碱性蛋白酶调节PH值为8-9,加热使温度达到55℃-60℃,再加入重量百分比为3%-5%的肠衣专用盐,测其盐度达到2%-2.5%,保温2-3小时,继续加热使温度达到80℃-85℃,保温30-40分钟后,用80目尼龙布过滤收集过滤液;
(3)吸附:将上述过滤液打入吸附罐中,搅拌,待温度降到58℃-60℃时加入树脂,搅拌8-10小时,继续冷却到40℃-45℃,放出废液,收集过滤树脂;
(4)洗脱:
(4-1):将收集的树脂反复冲洗后倒入洗脱器中,加入质量分数为5%-7%的盐水温度保持在50℃-55℃,搅拌30-40分钟;
(4-2):随后将废液倒掉,加入质量分数为20%-24%的盐水,温度保持在50℃-55℃,搅拌3-4小时后,收集洗脱液;
(4-3):重复(4-2)的步骤,将两次收集的洗脱液合并待用;
(5)沉淀脱盐:
将上述洗脱液过滤移入沉淀罐中,边搅拌边加入质量分数为80%-85%的乙醇,调PH值至7-8,搅匀密封沉淀23-25小时,虹吸上层清液用于回收乙醇,收集沉淀物待用;
(6)脱水干燥:将上述沉淀物滤干脱水,放入烘箱干燥后即得肝素钠。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征是:步骤(2)酶解中粘膜与2709碱性蛋白酶的重量比为500∶1。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征是:步骤(3)吸附中树脂的添加量按每根猪小肠加入20-30克树脂的比例添加。
4.根据权利要求1所述的制备方法其特征是:步骤(4-1)中树脂与加入的质量分数为5%-7%盐水的重量比为1∶1.1-1.3,步骤(4-2)中树脂与加入的质量分数为20%-24%盐水的重量比为1∶1.1-1.3。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征是:步骤(4-3)收集完洗脱液后,再接着加入质量分数为20%-24%的盐水,温度保持在50℃-55℃,搅拌30-40分钟后,收集洗脱液做高浓度盐水循环使用。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征是:步骤(5)沉淀脱盐中搅拌加入预冷过的乙醇。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征是:步骤(5)沉淀脱盐中洗脱液与乙醇的体积比为1∶1.8-2.2。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征是:步骤(6)的脱水干燥中烘箱的温度为80℃-90℃,干燥时间为6-8小时。
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