CN100543041C

CN100543041C - 一种硫酸软骨素的制备方法

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Publication number: CN100543041C
Application number: CNB2007100514823A
Authority: CN
Inventors: 张万山; 杨华英; 张志武; 屈巍; 朱月华; 刘兰花; 曾英; 万偲; 李菊根
Original assignee: WANHUA BIOCHEMICAL PRODUCT CO Ltd NANCHANG CITY
Current assignee: WANHUA BIOCHEMICAL PRODUCT CO Ltd NANCHANG CITY
Priority date: 2007-02-02
Filing date: 2007-02-02
Publication date: 2009-09-23
Anticipated expiration: 2027-02-02
Also published as: CN101012288A

Abstract

一种硫酸软骨素的制备方法，解决了目前硫酸软骨素生产工艺流程复杂，酸碱或盐、乙醇用量较大，提取周期较长，含量低，收率低等问题，该方法主要特征为：软骨碎块经2709碱性蛋白酶酶解后，酶解液再经过滤、脱色等工序，得到的溶液用氯化十六烷基吡啶沉淀，沉淀解离，最后用乙醇沉淀、干燥等工序制得。本发明大大提高了产品纯度，易于工业化生产，采用本法生产的硫酸软骨素，硫酸软骨素含量达到96%以上，收率达到35%以上。

Description

一种硫酸软骨素的制备方法

技术领域

本发明涉及一种硫酸软骨素的制备方法，特别是直接从动物软骨中制备硫酸软骨素的方法。

背景技术

硫酸软骨素系从动物软骨组织中制备获得的一种酸性粘多糖，多存在于动物软骨、鼻骨、喉骨、牛、马中膈和气管、鲨鱼软骨中，它是一种酸性粘多糖，在2709碱性蛋白酶的作用下，粘多糖可以从软骨组织中的蛋白质中离解释放出来。硫酸软骨素临床上可用于预防动脉粥样硬化、提高机体免疫力、治疗风湿病和肾炎及由链霉素引起的听觉障碍。作为食品添加剂，硫酸软骨素可用于食品的乳化、保湿和祛除异味。应用于化妆品中，可调节皮肤的细胞代谢，促进营养的吸收，保持皮肤的水分和改善发质。目前，国内外普遍采用碱与酶解相结合的方法来提取硫酸软骨素，还有报道用稀碱稀盐综合提取法、酶解—树脂提取法、酶解—膜提取法、超声波提取法、乙酸抽提法。硫酸软骨素的分离纯化有乙醇沉淀法、离子交换色谱法、吸附法和纤维素分离法等。现行工艺中一般采用碱解—胰酶酶解结合的生产工艺。但在碱处理时，能使硫酸软骨素上的巯基脱落，而造成硫酸软骨素降解，使硫酸软骨素收率降低，成本较高。已公开的专利《硫酸软骨素及其提取方法》(专利申请号：96116057.8)采用稀盐稀碱法，其不足是盐碱用量较大，提取时间较长，提取不充分，收率较低(15～20％)；专利《双酶法生产硫酸软骨素》(公开申请号：200310115383.9)采用碱性复合酶联合胰酶酶解法，其不足是提取时间较长，生产成本较高，收率低(16～22％)。

发明内容

本发明的目的是提供一种硫酸软骨素的制备方法，该方法生产工艺时间短，易于工业化生产。

在软骨中，硫酸软骨素通常与蛋白质结合，以糖蛋白形式存在。通过分子结构上的糖醛酸，半乳糖-半乳糖-木糖-，与蛋白质的丝氨酸残基以共价键形式连接，并以氢键及非共价键等形成具有螺旋、折叠、盘绕、卷曲等空间构象的大分子聚集体，形成一种硫酸软骨素蛋白多糖。在碱性条件下，以2709碱性蛋白酶为催化剂，硫酸软骨素可以从软骨组织中的蛋白中离解释放出来。本发明是根据这个原理来实现的，其具体制备方法如下：

(1)将洁净的软骨碎块放入反应釜内，并加入适量水，加入软骨碎块重量的0.6～1.5％的2709碱性蛋白酶，调节pH在8.0～9.0之间，控制温度在45～55℃之间，搅拌5～8小时；

(2)当软骨碎块反应完全后，过滤或离心除渣，滤液用盐酸或乙酸调节pH3～6，每100L滤液中加入0.2～2.0kg的活性炭，搅拌20～60分钟，过滤或离心除渣或脱色；

(3)向上步得到的澄清酶解液按每100L加入氯化十六烷基吡啶0.05～0.1kg，搅拌静置2～5小时，过滤或离心得到沉淀物；

(4)向上步沉淀物中加入浓度为1～3％乙酸钠或氯化钠溶液解离，再加入解离液体积的2～5倍的95％乙醇，使乙醇的最终浓度达到60～80％，沉淀；

(5)将上步沉淀物用95％以上的乙醇洗涤2至3遍，真空干燥，粉碎后即得所述硫酸软骨素成品。

本发明直接加入2709碱性蛋白酶，调节反应的pH，温度等条件，生产硫酸软骨素，缩短了工艺流程，反应时间只需要5～8小时，用碱量节省80％以上，收率高达37％以上。

氯化十六烷基吡啶(CPC)是一种季铵盐化合物，其季铵基的阳离子能与硫酸软骨素上的阴离子形成不溶性的季铵络合物(聚阴离子盐)，但当溶液中的离子强度增大到临界点时，可发生解离，从而可以进一步纯化硫酸软骨素。本发明在乙醇沉淀前采用氯化十六烷基吡啶纯化硫酸软骨素，通过调节溶液硫酸软骨素浓度、氯化十六烷基吡啶浓度等条件，提纯硫酸软骨素，进一步提高了硫酸软骨素纯度，节省了乙醇用量，降低了生产成本。

本发明的优点是：通过正交试验，筛选优化出硫酸软骨素最佳的提取条件为：水解温度为45～55℃，水解时间为5～8h，2709碱性蛋白酶用量为0.6～1.5％倍干软骨重，这三种因素对水解影响程度主要为水解温度，其次为酶用量和水解时间。整个反应过程pH值在8.0～9.0之间。通过单因素实验，氯化十六烷基吡啶沉淀提纯硫酸软骨素的最佳条件为：溶液中硫酸软骨素浓度为10～15％，氯化十六烷基吡啶浓度为0.05～0.1％。采用该方法，硫酸软骨素纯度达到96％以上，总收率超过35％，可简化制备工艺流程，大大缩短生产时间，节省了酸碱、乙醇用量，减轻对环境的污染，而且设备简单，易于工业化生产。

具体实施方式

实施例1

(1)将洁净的猪鼻骨10kg放入反应釜内，并加入约40L水，加入0.08kg的2709碱性蛋白酶，调节pH在8.5，控制温度在48℃左右，搅拌6小时；

(2)当软骨碎块反应完全后，过滤或离心除渣，滤液用盐酸调节pH4.5，按每100L滤液加入活性炭1.0kg，搅拌30分钟，过滤或离心除渣、脱色；

(3)向上步得到的澄清酶解液中加入氯化十六烷基吡啶0.04kg，使溶液中氯化十六烷基吡啶浓度达到0.1％，搅拌静置3小时，过滤或离心得到沉淀物；

(4)上步沉淀物中加入浓度为2％的乙酸钠解离，再加入解离液体积的2.5倍的95％乙醇，使乙醇最终浓度为65～80％，沉淀；

(5)将沉淀物用95％以上的乙醇洗涤3遍，真空干燥，粉碎后即得3.6kg硫酸软骨素成品。

实施例2

(1)将洁净的猪鼻骨50kg放入反应釜内，并加入约200L水，加入0.3kg的2709碱性蛋白酶，调节pH在8.5，控制温度在45℃，搅拌6小时；

(2)当软骨碎块反应完全后，过滤或离心除渣，滤液用乙酸调节pH4.5，按每100L滤液加入活性炭0.2kg，搅拌20分钟，过滤或离心除渣、脱色；

(3)向上步得到的澄清酶解液中加入氯化十六烷基吡啶0.2kg，使溶液中氯化十六烷基吡啶浓度达到0.1％，搅拌静置3小时，过滤或离心得到沉淀物；

(4)上步沉淀物中加入浓度为1％的氯化钠解离，再加入解离液体积的2倍的95％乙醇，使乙醇最终浓度为65～80％，沉淀；

(5)将沉淀物用95％以上的乙醇洗涤3遍，真空干燥，粉碎后即得17.7kg硫酸软骨素成品。

实施例3

(1)将洁净的猪鼻骨120kg放入反应釜内，并加入约480L水，加入1.8kg的2709碱性蛋白酶，调节pH在8.5，控制温度在55℃左右，搅拌6小时；

(2)当软骨碎块反应完全后，过滤或离心除渣，滤液用盐酸调节pH4.5，按每100L滤液加入活性炭2.0kg，搅拌60分钟，过滤或离心除渣、脱色；

(3)向上步得到的澄清酶解液中加入氯化十六烷基吡啶0.24kg，使溶液中氯化十六烷基吡啶浓度达到0.05％，搅拌静置3小时，过滤或离心得到沉淀物；

(4)上步沉淀物中加入浓度为3％的乙酸钠解离，再加入解离液体积的5倍的95％乙醇，使乙醇最终浓度为65～80％，沉淀；

(5)将沉淀物用95％以上的乙醇洗涤3遍，真空干燥，粉碎后即得42.2kg硫酸软骨素成品。

Claims

1、一种硫酸软骨素的制备方法，其特征在于该方法依次包括如下步骤：

(1)将洁净的软骨碎块放入反应釜内，并加入水，加入软骨碎块重量的0.6～1.5％的2709碱性蛋白酶，调节pH在8.0～9.0之间，控制温度在45～55℃之间，搅拌5～8小时；

(2)当软骨碎块反应完全后，过滤或离心除渣，滤液用盐酸或乙酸调节pH3～6，每100L滤液中加入0.2～2.0kg的活性炭，搅拌20～60分钟，过滤或离心除渣；

(3)向上步得到的澄清酶解液中加入氯化十六烷基吡啶沉淀剂，使溶液中的氯化十六烷基吡啶的浓度达到0.05～0.1％，搅拌静置2～5小时，过滤或离心得到沉淀物；

(4)向上步沉淀物中加入浓度为1～3％的乙酸钠或氯化钠溶液解离，再加入解离液体积的2～5倍的95％乙醇，使乙醇的最终浓度达到60～80％，沉淀；

(5)将上步沉淀物用95％以上的乙醇洗涤2～3次，真空干燥，粉碎后即得所述硫酸软骨素成品。

2、根据权利要求1所述的硫酸软骨素的制备方法，其特征是加入氯化十六烷基吡啶的溶液中的硫酸软骨素浓度为10～15％。