CN103641935B - 硫酸软骨素的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生化药剂技术领域，具体涉及一种的硫酸软骨素的提取方法。硫酸软骨素的提取方法，包括下述的步骤：（1）软骨和纯水混合；（2）加入碱性蛋白酶酶解反应；（3）加入角蛋白酶酶解反应；（4）过滤，取滤液，向滤液中加入乙醇溶液，沉降；（5）将沉降液离心，取沉淀烘干，得到硫酸软骨素。本发明的有益效果在于，采用本发明的方法对硫酸软骨素进行提取，相对于盐法提取、碱法提取，简化了生产的工艺流程，相对于当前酶法提取多采用胰蛋白酶，大大缩短了工艺周期，提高了提取收率，简化了生产的工艺流程。
Description
技术领域
本发明属于生化药剂技术领域，具体涉及硫酸软骨素的提取方法。
背景技术
硫酸软骨素是软骨素的硫酸酯，是一种酸性粘多糖，广泛存在于动物的器官软骨中，通常由哺乳动物的软骨、脐带、血管壁等组织中提取得到，易溶于水，不溶于乙醇和丙酮等有机溶剂。它可以清除体内血液中的脂质和脂蛋白，用于防治冠心病、心绞痛、心肌梗死、动脉粥样硬化等，能有效促进细胞代谢，还具有缓和的抗凝血作用、抗炎效果，加速伤口愈合及抗肿瘤等。目前酸性硫酸软骨素的提取方法主要有降解法和非降解法，非降解法仅用于非蛋白多糖的黏多糖——透明质酸，而降解法适用于包括透明质酸在内的所有酸性黏多糖，硫酸软骨素的提取采用降解法，降解法又包括碱提取法和蛋白酶提取法两种，根据这些性质，硫酸软骨素的提取方法有很多，归纳起来，主要有以下几种：
（1）中性盐法
先用10%的氯化钙提取，氯仿-戊醇（1：4）除去蛋白质，2倍量乙醇沉淀，最后以L1O试剂精制，而以透析法除杂质、氯化六氨合钴纯化，或一磷钨酸纯化，均可使工艺简化，以30%氯化钾或30%氯化钾加1%碳酸钾提取，高岭土吸附除去杂蛋白，可提高产品收率。
该方法提取的产品颜色较白，各项指标符合国家标准，也不会造成环境污染，但是产率较低，造成原材料的大量浪费，对经济效益有一定的影响。
（2）碱提取法
浓碱提取工艺：将粉碎好的软骨碎片称重后，加入骨质量1.5倍左右的15%的氢氧化钠溶液，室温下浸提12-16h，然后用盐酸调节pH至2-5，双层纱布过滤，留下滤液，将滤液调节pH到8左右，按骨质量的4%加入胰蛋白酶，于50℃左右的水解水解6h，用盐酸调节pH至6，升高温度到90℃左右，加入活性炭进行脱色反应，然后过滤，在滤液中加入1.5倍体积的无水乙醇进行沉淀分层4h，所得沉淀为硫酸软骨素，在60℃下干燥即得最终产品。
稀碱提取工艺：将粉碎好的软骨碎片称重后，加入骨质量6倍左右的2%的氢氧化钠溶液，60℃下浸提24h，分两次进行，然后用盐酸调节pH至2-5，双层纱布过滤，留下滤液，将滤液调节pH到8左右，按骨质量的4%加入胰蛋白酶，于50℃左右的水解7h，用盐酸调节pH至5-7，升高温度到80-90℃，加入活性炭进行脱色反应，然后过滤，在滤液中加入1.5倍体积的无水乙醇和1.4%的氯化钠溶液进行沉淀分层6h，所得沉淀再次加入1.5%的氯化钠溶液和3倍体积的无水乙醇进行沉淀，所得即为硫酸软骨素，然后在60℃左右的温度下干燥即得最终产品。
稀碱稀盐提取工艺：将粉碎好的软骨碎片称重后，加入均为骨质量6倍的0.5%的氢氧化钠和2%的氯化钠混合溶液，室温下进行浸提30h，分两次进行，然后用盐酸调节pH至8左右，加入骨质量4%的胰蛋白酶进行水解，水解后升温90℃左右，加入骨质量1%的滑石粉，过滤，加入1.5倍体积的无水乙醇进行沉淀，过滤后再加入1.5%的氯化钠溶液进行沉淀过滤，加入1.5倍体积的无水乙醇再次进行沉淀过滤，所得沉淀物于60℃下干燥得最终产品。
稀碱浓盐提取工艺：将粉碎好的软骨碎片称重后，加入骨质量5倍左右的0.2%的氢氧化钠溶液和20%的氯化钠溶液，pH为13，室温下浸提30h，分两次进行，然后用盐酸调节pH至7，升温80-90℃，加入骨质量4%的滑石粉，将盐解液调节pH至2-3，过滤1h，将滤液加入1.5倍体积的水进行稀释，同时调节pH到6，加入1.5倍体积的无水乙醇沉淀12h，将沉淀物加入1.5%的氯化钠溶液中进行沉淀过滤，加入1.5倍体积的无水乙醇再次沉淀8h，所得沉淀物于60℃下干燥即得最终产品。
以上四种工艺路线，制得的硫酸软骨素含量和氨含量都符合原料药的要求，但是这4种路线都存在如下的缺陷：采用稀碱温和条件下制备的样品溶液混浊，且时间长，污染严重基原因在于该条件下软骨的胶原蛋白、黏蛋白等不能完全水解，且它在中性盐和弱酸溶液中是可溶的，在溶液中不易被除去，最主要的是这些工艺的生产周期都太长，极大的限制了工厂的生产效益和经济效益。
（3）酶提取法
稀碱-酶解提取法，邹开朗等提出稀碱与酶解相结合法生产硫酸软骨素，先将软骨在80℃水煮4-6h，然后按原料（干质量）与2%氢氧化钠的比例为1：6的量加入氢氧化钠溶液，室温提取1.5h然后用盐酸调节pH到6左右，双层纱布过滤，取滤液，合并2次滤液，并测量体积待用，滤液调节pH到8，按滤液与胰酶100：0.4的比例加入胰酶，于50℃左右水解1h后，再按100：0.4的质量比加入胃蛋白酶，45℃下水解1.5h后过滤后加入高岭土和活性炭吸附，该工艺用氯仿反萃取的方法纯化硫酸软骨素，与其它的方法相比较，缩短了一半工艺流程，同时提高了纯度和提取率，又减轻了碱法提取所带来的环境污染。
还有采用浓碱-复合酸酶解提取的方法，该方法的实验流程与稀碱酶解法基本相同，只是在碱解这一步增加了碱的尝试，该方法提高了产品的纯度和收率，降低了生产成本。
复合酶解提取法，该方法质量稳定，产品颜色洁白，生产周期短。上述的方法其缺点是，在生产过程中引用了浓碱，酸，该方法中酸碱醇的消耗量都较大，反应条件比较强烈，而且成本也较高。
酶解-树脂提取法，该方法的优点是酶水解或稀碱水解与树脂交换技术相结合，保证了硫酸软骨素分子不降解，解决了成品纯度的问题，该方法简便，收率高，但是该方法的成本也较高，而且耗时较长。
从上述的方法来看，目前国内外常用碱提与胰酶酶解相结合的方法来提取硫酸软骨素，但此提取工艺中，胰蛋白酶的酶解反应至少需要5h，这是主要的限速环节，将该工艺用于规模化生产，不仅生产周期长，而且产品成本高。
因此需要针对上述的方法进行改进，寻找一种不仅易于规模化生产，而且生产周期短，产品成本低的硫酸软骨素的提取方法。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种易于规模化生产、生产周期短、产品成本低的硫酸软骨素的提取方法。
本发明的硫酸软骨素的提取方法是通过下述的技术方案来实现的：
硫酸软骨素的提取方法，包括下述的步骤：
（1）软骨和纯水以1:0.5-1:2的比例混合；
（2）按照占软骨重量0.40-0.60%的比例加入碱性蛋白酶，于50-60℃，pH9.0-10.0条件下酶解反应1.5-2.5h；
（3）按照占软骨重量0.40-0.60%的比例加入角蛋白酶，50-60℃，pH10.0-11.0条件下酶解反应2.5-3.5h；
（4）过滤，取滤液，向滤液中加入乙醇溶液，使得乙醇终浓度达到60-70%，沉降1h；
（5）将沉降液离心，取沉淀，60℃烘干，得到硫酸软骨素。
优选的，上述的步骤（1）中，软骨与纯水的比例为：1：1。
上述的步骤（2）中，碱性蛋白酶占软骨的重的0.5%，酶解反应的条件是：于55℃，pH9.5的条件下酶解反应2h。
上述的步骤（3）中，角蛋白酶占软骨重的0.5%，于55℃，pH10.5的条件下酶解反应3h。
上述的步骤（5）中，将沉降液离心的条件是，在6000rpm的转速下，离心5min。
传统酶提取方法是采用碱性蛋白酶和胰蛋白酶相结合，共同作用于软骨，提取硫酸软骨素；本发明所提供的一种硫酸软骨素提取方法，用角蛋白酶取代胰蛋白酶进行酶解，对比结果显示在达到相同效果的前提下，角蛋白酶所需的酶解时间更短，该新提取方法不但能够明显缩短提取时间，还可以简化提取工艺，降低生产成本，更适合工业规模化生产，具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。
实施例1
（1）软骨和纯水以1:1的比例混合；
（2）按照与软骨0.5%的比例加入碱性蛋白酶，55℃，pH9.5条件下酶解反应2h；
（3）按照与软骨0.5%的比例加入角蛋白酶，55℃，pH10.5条件下酶解反应3h；
（4）过滤，取滤液，向滤液中加入乙醇溶液，使得乙醇终浓度达到66%，沉降1h；
（5）将沉降液离心，离心的条件是6000rpm、5min，取沉淀，60℃烘干，得到硫酸软骨素。
实施例1中，得到的硫酸软骨素分析结果如下：
得到的硫酸软骨素0.665mg/ml，收率13.3%，白色絮状，易从容器壁刮下；
对比例1
（1）软骨和纯水以1:1的比例混合；
（2）按照与软骨1%的比例加入碱性蛋白酶，55℃，pH9.5条件下酶解反应3h；
（3）过滤，取滤液，向滤液中加入乙醇溶液，使得乙醇终浓度达到66%，沉降1h；
（4）将沉降液离心，离心的条件是6000rpm、5min，取沉淀，60℃烘干，得到硫酸软骨素。
对比例2
（1）软骨和纯水以1:1的比例混合；
（2）按照与软骨1%的比例加入角蛋白酶，55℃，pH10.5条件下酶解反应3h；
（3）过滤，取滤液，向滤液中加入乙醇溶液，使得乙醇终浓度达到66%，沉降1h；
（4）将沉降液离心，离心的条件是6000rpm、5min，取沉淀，60℃烘干，得到硫酸软骨素。
对比例1中，产品的纯度为0.273mg/ml，收率为5.5%；
对比例2中，产品的纯度为0.308mg/ml，粗品收率为6.2%。
对比例3
（1）软骨和纯水以1:1的比例混合；
（2）按照与软骨0.5%的比例加入碱性蛋白酶，55℃，pH9.5条件下酶解反应2h；
（3）按照与软骨0.5%的比例加入胰蛋白酶，55℃，pH7.0条件下酶解反应3h；
（4）过滤，取滤液，向滤液中加入乙醇溶液，使得乙醇终浓度达到66%，沉降1h；
（5）将沉降液离心，离心的条件是6000rpm、5min，取沉淀，60℃烘干，得到硫酸软骨素。
对比例3中，产品的纯度为0.417mg/ml，粗品收率为8.3%。
对比例4
A：软骨和纯水以1:1的比例混合；
按照与软骨0.45%的比例加入碱性蛋白酶，55℃，pH9.2条件下酶解反应2h；
按照与软骨0.45%的比例加入胰蛋白酶，55℃，pH7.0条件下酶解反应3h；
过滤，取滤液，向滤液中加入乙醇溶液，使得乙醇终浓度达到66%，沉降1h；
将沉降液离心，离心的条件是6000rpm、5min，取沉淀，60℃烘干，得到硫酸软骨素。
B:软骨和纯水以1:1的比例混合；
按照与软骨0.45%的比例加入碱性蛋白酶，55℃，pH9.2条件下酶解反应2h；
按照与软骨0.45%的比例加入角蛋白酶，55℃，pH9.2条件下酶解反应3h；
过滤，取滤液，向滤液中加入乙醇溶液，使得乙醇终浓度达到66%，沉降1h；
将沉降液离心，离心的条件是6000rpm、5min，取沉淀，60℃烘干，得到硫酸软骨素。
1.A、B两者的沉降效果对比：
2．含量检测：将以上的两种产品分别以5mg/ml的浓度溶于水，以间苯三酚法检测硫酸软骨素含量。
A：硫酸软骨素0.371mg/ml，粗品收率7.4%；
B：硫酸软骨素0.665mg/ml，粗品收率13.3%，比方法A收率提高79.7%。
从以上的对比中可以看出，采用角蛋白酶提取硫酸软骨素，其效果要远远优于采用胰蛋白酶水解提取硫酸软骨素。
实施例2
（1）软骨和纯水以1:2的比例混合；
（2）按照与软骨0.60%的比例加入碱性蛋白酶，50℃，pH9.6条件下酶解反应2.5h；
（3）按照与软骨0.45%的比例加入角蛋白酶，60℃，pH10.2条件下酶解反应2.5h；
（4）过滤，取滤液，向滤液中加入乙醇溶液，使得乙醇终浓度达到69%，沉降1h；
（5）将沉降液离心，离心的条件是，6000rpm、5min，取沉淀，60℃烘干，得到硫酸软骨素。
本发明的方法具有时间短、成本低的优点，其得到的硫酸软骨素含量可达0.645mg/ml，粗品收率12.9%。
实施例3
（1）软骨和纯水以1:0.5的比例混合；
（2）按照与软骨0.45%的比例加入碱性蛋白酶，60℃，pH9.5条件下酶解反应1.5h；
（3）按照与软骨0.55%的比例加入角蛋白酶，55℃，pH10.5条件下酶解反应3.5h；
（4）过滤，取滤液，向滤液中加入乙醇溶液，使得乙醇终浓度达到62%，沉降1h；
（5）将沉降液离心，离心的条件是，6000rpm、5min，取沉淀，60℃烘干，得到硫酸软骨素。
本发明的方法具有时间短、成本低的优点，其得到的硫酸软骨素含量可达0.618mg/ml，粗品收率12.4%。
Claims (5)
1.硫酸软骨素的提取方法，包括下述的步骤：
（1）软骨和纯水以1:0.5-1:2的重量比例混合；
（2）按照占软骨重量0.40-0.60%的比例加入碱性蛋白酶，于50-60℃，pH9.0-10.0条件下酶解反应1.5-2.5h；
（3）按照占软骨重量0.40-0.60%的比例加入角蛋白酶，50-60℃，pH10.0-11.0条件下酶解反应2.5-3.5h；
（4）过滤，取滤液，向滤液中加入乙醇溶液，使得乙醇终浓度达到60-70%，沉降1h；
（5）将步骤（4）中的沉降液离心，取沉淀，60℃烘干，得到硫酸软骨素。
2.如权利要求1所述的硫酸软骨素提取方法，其特征在于，所述的步骤（1）中，软骨与纯水的重量比例为：1：1。
3.如权利要求1所述的硫酸软骨素提取方法，其特征在于，所述的步骤（2）中，碱性蛋白酶占软骨的重量的0.5%，酶解反应的条件是：于55℃，pH9.5的条件下酶解反应2h。
4.如权利要求1所述的硫酸软骨素提取方法，其特征在于，所述的步骤（3）中，角蛋白酶占软骨重的0.5%，于55℃，pH10.5的条件下酶解反应3h。
5.如权利要求1所述的硫酸软骨素提取方法，其特征在于，所述的步骤（5）中，将沉降液离心的条件是，在6000rpm的转速下，离心5min。
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