CN103467624A - 一种肝素钠粗品的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种肝素钠粗品的提取方法，原料来源于新鲜的猪肺或解冻的猪肺，绞成糊状料，加入细胞活化剂催化，再经生物酶酶解、除杂分离过滤得到含有肝素钠的溶液，再经树脂吸附、洗脱及有机溶剂沉淀、干燥得到肝素钠粗品。本发明肝素钠粗品的提取方法能够提高产品品质及有效收得率、降低生产成本，适用于工业化生产，减少废弃物排放，具有社会、环保、经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种肝素钠粗品的提取方法，属于生物制药制作技术领域。
背景技术
肝素是一种天然抗凝血药物，具有溶解血栓和阻止血液凝固的功能，也是世界上迄今为止已知的分子结构最复杂的化合物，广泛分布于哺乳动物组织中，如肠粘膜、肺、肝中，目前只有来源于猪小肠粘膜、猪肺所提取的肝素能够用于临床治疗。
中国生猪屠宰量占全球50%以上，拥有全球最丰富的肝素原料资源。我国是全球肝素粗品和肝素原料药的主要生产国，也是全球最大的肝素原料药出口国，成为全球下游生产企业青睐的重要资源。但由于竞争激烈，导致猪小肠成本价位居高不下，而利用猪肺提取工艺由于传统、落后的盐解、沉淀技术使其纯度无法提升，使其无法快速发展，也造成了大量的资源浪费。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种肝素钠粗品的提取方法，本发明利用高速离心分离技术有效提取肝素钠，从而大力提高生产效率，降低生产成本、提高产品品质和收得率的方法，有利于工业化生产。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种肝素钠粗品的提取方法，包括：
1）将新鲜猪肺或解冻的猪肺经剥离去除气管、脂肪后绞成糊状料，得猪肺浆料，向猪肺浆料中加入0.4～0.6倍猪肺浆料重量的去离子水，再分别加入占猪肺浆料重量0.1%～0.3%的防腐剂及细胞活化剂，在20～30℃间歇搅拌反应2～4小时后，得第一猪肺浆料液，向第一猪肺浆料液中加入1～3倍第一猪肺浆料液重量的去离子水，得第二猪肺浆料液，再加入占第二猪肺浆料液重量2%～6%的氯化钠（加入氯化钠量过多会增加树脂吸附压力，过少则会使得肝素和蛋白质分离不完全），用氢氧化钠溶液调pH至8～9（碱性过强会造成肝素降解破坏，不足则猪肺浆料液易酸化，导致后续升温时肝素易破坏），在25℃下间歇搅拌反应3～4小时，得猪肺碱解液；
2）将1）得到的猪肺碱解液缓慢加热至40℃，加氢氧化钠溶液调pH值至8～9，加入占猪肺碱解液重量0.01%～0.2%的蛋白复合酶，再加入氯化钠使猪肺碱解液中氯化钠的浓度为10%～13%，搅拌2～3小时后再缓缓升温至60℃（升温过急会使蛋白质过早凝固而影响肝素的分解和溶出），保温、搅拌反应4～6小时，得到猪肺酶解液；
3）将2）得到的猪肺酶解液10～20分钟快速升温至90℃，保温0.5～1h后加入占猪肺酶解液重量0.1%～2%的蛋白沉淀剂，搅拌0.5～1小时，静止沉淀，用100目尼龙袋过滤，收集清液；
4）将3）得到的清液降温至60～70℃，采用管式离心机液液蛋白分离设备处理，得到肝素钠纯浆液；
5）向4）得到的肝素钠纯浆液中加入0.1～2倍体积的去离子水并升温至50℃，再加入2%～8%的树脂（树脂的加入量占肝素钠纯浆液与去离子水总质量的2%～8%），用氢氧化钠溶液调pH值至8～9，搅拌4～6小时使得树脂充分吸附，静置0.5～1小时后用80目尼龙袋过滤收集所吸附的树脂；
6）向5）得到的树脂中加入2～4倍树脂重量的去离子水及与树脂等重量的3.5mol/L的氯化钠溶液，调pH至9～10，搅拌洗脱树脂，用80目尼龙袋过滤收集滤液作为为第一次滤液，向过滤出的树脂中再加入2倍树脂重量的去离子水及0.5倍树脂重量的3.5mol/L的氯化钠溶液，再洗脱一次，得到第二次滤液，合并两次滤液；
7）向6）得到的滤液中加入1～2倍体积的95%预冷乙醇，搅拌20～24分钟，静置12～15小时后吸除乙醇，收集下层沉淀物，滤干，用无水乙醇冲洗脱水，再用丙酮脱水，在60℃下真空干燥得到肝素钠粗品。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，在1）中，所述防腐剂为苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、脱氢乙酸钠中一种或任意几种的混合物；
进一步，所述细胞活化剂为十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲溴化铵、硫代硫酸钠中一种或任意几种的混合物。
进一步，在1）中，所述间歇搅拌为搅拌速度小于50转/分，每小时搅拌一次，每次搅拌30分钟，停止30分钟。
进一步，在2）中，所述蛋白复合酶为胰蛋白酶、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中任意几种的混合物。
进一步，在3）中，所述蛋白沉淀剂为硫酸铵、硫酸亚铁、硫酸铝、三氯化铁、氯化钙中的一种或几种的混合物。
进一步，在5）和6）中，所述树脂是指强碱性阴离子交换树脂，如美国RohmHass公司生产的Amberjet系列（AMBERJET4200Cl）、德国拜耳公司生产的Lewatit系列树脂（1704强碱性阴离子树脂）。
预冷乙醇为乙醇提前两小时存放于冰箱中，温度0～4℃，因利用乙醇作肝素钠沉淀剂会部分影响其活性，而使用预冷乙醇损失较少。
本发明所采用的管式离心机为辽阳鑫达制药机械有限公司生产市售的GF105A管式离心机，工作原理为：溶液中所存在的小分子肝素钠与大分子蛋白质、脂类、菌体、鞣质等杂质因密度不同而实现有效分离，达到有效收集肝素钠纯浆液的目的。
本发明使用的地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶购自邢台万达生物工程有限公司，酶活力为每克50万单位以上。
本发明使用的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶，购自邢台万达生物工程有限公司，酶活力为每克20万单位以上。
本发明所使用的树脂是经过预处理后的，处理步骤为：
1、使用饱和盐水（工业用氯化钠）,用量为被处理树脂的2～3倍；
2、将树脂置于盐水中浸泡18～20h,然后放尽盐水,用去离子水漂洗干净,使排出的水不显黄色；
3、再用2%～4%氢氧化钠(或5%盐酸)溶液(其量与上同)浸泡2～4h(或小流量清洗)；
4、放尽碱或酸液后用去离子水冲洗树脂直至接近中性待用。
本发明的有益效果是：
本发明方法在提取肝素钠时，以细胞活化剂及酶解剂对猪肺原料进行处理，使其细胞迅速降解、肝素从肺组织的肥大细胞中与纤维蛋白组织分离而获得释放，添加蛋白沉淀剂使其蛋白沉淀避免了强酸、强碱法除蛋白而损害肝素钠活性，采用管式离心机技术，利用不同分子密度的沉降差异,有效分离去除大分子如：蛋白质、脂类、菌体、鞣质等杂质，解决了长期以来肝素钠与杂质难以分离的困扰，降低了杂质对树脂吸附过程中的干扰，相对传统工艺减少了树脂用量，更便于后续树脂的有效吸附、洗脱及有机溶剂沉淀、真空烘干的工艺处理，有效地提高了产品的质量、产品效价和收得率，同时，分离出的蛋白可作为化妆品或饲料的理想原料，分离出的气管可作为软骨素的生产原料，废水可回收再利用，故无废渣、废水排放，有利于规模化生产，社会、环保、经济效益显著。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例中使用的地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶购自邢台万达生物工程有限公司，酶活力为每克50万单位以上。
实施例中使用的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶，购自邢台万达生物工程有限公司，酶活力为每克20万单位以上。
实施例所采用的管式离心机为辽阳鑫达制药机械有限公司生产市售的GF105A管式离心机。
实施例所使用的树脂是经过预处理后的，处理步骤为：
1、使用饱和盐水（工业用氯化钠）,用量为120ml；
2、将树脂置于盐水中浸泡20h,然后放尽盐水,用去离子水漂洗干净,使排出的水不显黄色；
3、再用4%氢氧化钠溶液120ml浸泡4h；
4、放尽碱液后用去离子水冲洗树脂直至接近中性待用。
实施例1
1）取新鲜的猪肺或冷冻猪肺自然解冻之后剥离气管、脂肪后，绞成糊状料，得猪肺浆料，取10kg猪肺浆料，加入5000ml去离子水，再加入15g山梨酸钾及15g十六烷基三甲溴化铵，在25℃下搅拌，搅拌速度小于50转/分，每小时搅拌一次，每次搅拌30分钟，停止30分钟，搅拌反应4小时，得第一猪肺浆料液，向第一猪肺浆料液中加入30000ml的去离子水，得第二猪肺浆料液，再加入1.8kg氯化钠，用氢氧化钠溶液调pH至9，在25℃下搅拌，搅拌速度小于50转/分，每小时搅拌一次，每次搅拌30分钟，停止30分钟，搅拌反应4小时，得猪肺碱解液；
2）将1）得到的猪肺碱解液缓慢加热至40℃，加氢氧化钠溶液调pH至9，加入20g蛋白复合酶（胰蛋白酶10g和地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶10g），再加入3.5kg氯化钠，搅拌3小时后再缓缓升温至60℃，保温、搅拌反应5小时，得到猪肺酶解液；
3）将2）得到的猪肺酶解液20分钟快速升温至90℃，保温1h后加入230g硫酸铵，搅拌1小时，静止沉淀，用100目尼龙袋过滤，收集清液40000ml；
4）将3）得到的清液降温至65℃，采用管式离心机液液蛋白分离设备处理，根据清液中不同组分的密度差而分层获得肝素钠纯浆液（低分子料液）850ml；
5）向4）得到的肝素钠纯浆液中加入150ml去离子水，并升温至50℃，加入50g已处理好的德国拜耳1704强碱性阴离子树脂，用氢氧化钠溶液调pH至9，慢速搅拌6小时使得树脂上下翻动充分吸附，静置1小时后用80目尼龙袋过滤收集所吸附的树脂；
6）向5）得到的树脂中加入200ml去离子水及50g3.5mol/L的氯化钠溶液，调pH至9～10，搅拌洗脱树脂，用80目尼龙袋过滤收集滤液，向过滤出的树脂中再加入200ml去离子水及25g3.5mol/L的氯化钠溶液，再洗脱一次，合并二次滤液；
7）向6）得到的滤液中加入500ml浓度为95%的预冷乙醇，搅拌20分钟，加盖静置12小时后吸除乙醇，收集下层沉淀物，并用绸布滤干，用无水乙醇三次冲洗脱水，再用丙酮脱水二次，在60℃下真空干燥得到5.2g肝素钠粗品，其有效价为123usp/mg。
实施例2
1）取新鲜的猪肺或冷冻猪肺自然解冻之后剥离气管、脂肪后，绞成糊状料，得猪肺浆料，取10kg猪肺浆料，加入5000ml去离子水，再加入15g苯甲酸及15g十二烷基磺酸钠，在25℃下搅拌，搅拌速度小于50转/分，每小时搅拌一次，每次搅拌30分钟，停止30分钟，搅拌反应4小时，得第一猪肺浆料液，向第一猪肺浆料液中加入30000ml的去离子水，得第二猪肺浆料液，再加入2.0kg氯化钠，用氢氧化钠溶液调pH至9，在25℃下搅拌，搅拌速度小于50转/分，每小时搅拌一次，每次搅拌30分钟，停止30分钟，搅拌反应4小时，得猪肺碱解液；
2）将1）得到的猪肺碱解液缓慢加热至40℃，加氢氧化钠溶液调pH至9，加入30g蛋白复合酶（地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶10g、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶10g和木瓜蛋白酶10g），再加入4kg氯化钠，搅拌3小时后再缓缓升温至60℃，保温、搅拌反应5小时，得到猪肺酶解液；
3）将2）得到的猪肺酶解液20分钟快速升温至90℃，保温1h后加入250g硫酸铵，搅拌1小时，静止沉淀，用100目尼龙袋过滤，收集清液40000ml；
4）将3）得到的清液降温至65℃，经过采用管式离心机液液蛋白分离设备处理，根据清液中不同组分的密度差而分层获得肝素钠纯浆液（低分子料液）900ml；
5）向4）得到的肝素钠纯浆液中加入100ml去离子水，并升温至50℃，加入60g已处理好的德国拜耳1704强碱性阴离子树脂，用氢氧化钠溶液调pH至9，慢速搅拌6小时使得树脂上下翻动充分吸附，静置1小时后用80目尼龙袋过滤收集所吸附的树脂；
6）向5）得到的树脂中加入200ml去离子水及60g3.5mol/L的氯化钠溶液，调pH至9～10，搅拌洗脱树脂，用80目尼龙袋过滤收集滤液，向过滤出的树脂中再加入200ml去离子水及25g3.5mol/L的氯化钠溶液，再洗脱一次，合并二次滤液；
7）向6）得到的滤液中加入600ml浓度为95%的预冷乙醇，搅拌20分钟，加盖静置12小时后吸除乙醇，收集下层沉淀物，并用绸布滤干，用无水乙醇三次冲洗脱水，再用丙酮脱水二次，在60℃下真空干燥得到5.5g肝素钠粗品，效价为137usp/mg。
实验例
下面对比实施例1和2与传统工艺的有效收率，传统工艺是指不用离心机分离杂质，直接简单过滤去除蛋白质等杂质法，结果如下表。
本发明与传统工艺方法有效收率比较表
1、采用三氯乙酸法滴定肝素钠粗品溶液时，蛋白杂质会使溶液产生浑浊，浑浊度越高蛋白含量则越高；
2、肝素钠粗品溶液中所含的蛋白等杂质，许多会优先与树脂结合，造成树脂无效反应，同时还增加树脂用量，降低树脂使用寿命；
3、本发明肝素钠的提取方法有效分离开肝素钠与蛋白杂质，提高了效价，减少树脂用量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种肝素钠粗品的提取方法，其特征在于，包括：
1）将新鲜猪肺或解冻的猪肺经剥离去除气管、脂肪后绞成糊状料，得猪肺浆料，向猪肺浆料中加入0.4～0.6倍猪肺浆料重量的去离子水，再分别加入占猪肺浆料重量0.1%～0.3%的防腐剂及细胞活化剂，在20～30℃间歇搅拌反应2～4小时后，得第一猪肺浆料液，向第一猪肺浆料液中加入1～3倍第一猪肺浆料液重量的去离子水，得第二猪肺浆料液，再加入占第二猪肺浆料液重量2%～6%的氯化钠，用氢氧化钠溶液调pH至8～9，在25℃下间歇搅拌反应3～4小时，得猪肺碱解液；
2）将步骤1）得到的猪肺碱解液缓慢加热至40℃，加氢氧化钠溶液调pH值至8～9，加入占猪肺碱解液重量0.01%～0.2%的蛋白复合酶，再加入氯化钠使猪肺碱解液中氯化钠的浓度为10%～13%，搅拌2～3小时后再缓缓升温至60℃，保温、搅拌反应4～6小时，得到猪肺酶解液；
3）将步骤2）得到的猪肺酶解液10～20分钟快速升温至90℃，保温0.5～1h后加入占猪肺酶解液重量0.1%～2%的蛋白沉淀剂，搅拌0.5～1小时，静止沉淀，用100目尼龙袋过滤，收集清液；
4）将步骤3）得到的清液降温至60～70℃，采用管式离心机液液蛋白分离设备处理，得到肝素钠纯浆液；
5）向步骤4）得到的肝素钠纯浆液中加入0.1～2倍体积的去离子水并升温至50℃，再加入2～8%的树脂，用氢氧化钠溶液调pH值至8～9，搅拌4～6小时使树脂充分吸附，静置0.5～1小时后用80目尼龙袋过滤收集所吸附的树脂；
6）向步骤5）得到的树脂中加入2～4倍树脂重量的去离子水及与树脂等重量的3.5mol/L的氯化钠溶液，调pH至9～10，搅拌洗脱树脂，用80目尼龙袋过滤收集滤液作为为第一次滤液，向过滤出的树脂中再加入2倍树脂重量的去离子水及0.5倍树脂重量的3.5mol/L的氯化钠溶液，再洗脱一次，得到第二次滤液，合并两次滤液；
7）向步骤6）得到的滤液中加入1～2倍体积的95%预冷乙醇，搅拌20～24分钟，静置12～15小时后吸除乙醇，收集下层沉淀物，滤干，用无水乙醇冲洗脱水，再用丙酮脱水，在60℃下真空干燥得到肝素钠粗品。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在1）中，所述防腐剂为苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、脱氢乙酸钠中一种或任意几种的混合物；所述细胞活化剂为十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲溴化铵、硫代硫酸钠中一种或任意几种的混合物。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在1）中，所述间歇搅拌为搅拌速度小于50转/分，每小时搅拌一次，每次搅拌30分钟，停止30分钟。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在2）中，所述蛋白复合酶为胰蛋白酶、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中任意几种的混合物。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在3）中，所述蛋白沉淀剂为硫酸铵、硫酸亚铁、硫酸铝、三氯化铁、氯化钙中的一种或几种的混合物。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，在5）和6）中，所述树脂是指强碱性阴离子交换树脂。
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