CN107141372A - 复合酶提取肝素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了复合酶提取肝素的方法。本发明方法中，通过使用碱性蛋白酶和胰蛋白酶的复合酶进行酶解提取肝素，并将提取液浓缩过滤后，使用树脂吸进行附，然后洗脱沉淀，干燥得到肝素钠粗品，从而在能够以高产率得到肝素钠产品的同时，还能够有效保证所得肝素钠粗品的质量。同时，还可以将所制得的肝素钠粗品经进一步精制后，得到高纯度的肝素钠产品。

Description

复合酶提取肝素的方法
技术领域
本发明涉及肝素钠提取领域，具体而言，涉及复合酶提取肝素的方法。
背景技术
肝素(heparin)是重要的生物药品，具有很重要的生物功能，产品形式通常是肝素钠盐。据IMS统计，2008年肝素市场的全球销售额已突破50亿美元。
我国是肝素钠主要出口国家之一，但出口产品以低价的粗品肝素为主。我国现行的肝素提取和纯化工艺比较落后，产品杂质含量较高。为了满足医学临床及生化研究，每年要从国外大量进口精品肝素及低分子肝素。目前临床上用于抗血栓的药剂主要是低分子肝素制剂。
肝素是一种高度硫酸化、复杂、多分散的线形糖胺聚糖(glycosaminoglycans,简称GAGs)，是具有不同链长即不同分子量的各种大小分子所组成的混合物，因此其分子量具有多分散性，一般其分子量在3000-30000道尔顿之间，平均分子量约为15000道尔顿。最早的肝素提取方法介绍见于Howell在美国生理杂志上发表的文章，肝素提取需要去除杂质后再精制，因此在处理原料时要通过酶水解、盐析等方法去除蛋白质，得到肝素粗品。粗品肝素中含有其它黏多糖，也含有一些残余的蛋白质和核酸类物质，从而使粗品肝素的效价过低。现有的工艺对酸碱性杂质，是通过等电点沉淀及热变性作用、盐析作用等办法去除；对低抗凝活性的水溶杂质，通过控制产品溶液浓度特别是酒精沉淀浓度来加以去除；对热原杂质，通过超滤氧化及离子交换方法加以去除。
国内常用的猪小肠肝素提取方法是盐析法；60、70年代美国专利技术-氧化法纯化技术在国外曾经广泛采用；国内90年代以前基本采用组合氧化法纯化技术是肝素的主要纯化方法，因此对氧化法纯化技术研究的比较多。
例如，现有技术(CN102746421A)公开了一种粗品肝素钠提纯的方法，主要时对粗品肝素钠进行溶解、吸附、洗脱、沉淀和干燥处理，最终得到肝素钠产品。同时，现有技术(CN103588902A)公开了一种采用吸附、醇沉以及两步氧化法对粗品肝素钠进行提纯的方法。同样的，现有技术(CN10299336A)公开了一种采用加入硅藻土、聚合氯化铝后经离心除杂，再经醇沉、双氧水氧化、醇沉以及过滤、冷冻干燥后得到肝素钠产品。
然而，这些传统方法工艺较为复杂，产品的生产周期长，并且在提纯过程中需要加入化学试剂，处理成本较高，精制的过程也较为复杂，产品纯度也难以保证。
近几年，随着生物技术的进展，以及新型高分子材料的不断出现，又有新成果出现。酶解辅助提取肝素，离子交换层析分离肝素技术是现在企业主要使用的技术。
加入蛋白水解酶，可以减少水解时间和减少微生物的污染。但酶解技术受限于温度、pH的控制，提取肝素后还要灭酶、并将其除去，同时采用离子交换法从酶解液中吸附肝素时，由于吸附不完全，所以会导致残留液中仍含有较高量的肝素，从而影响肝素得率。
虽然肝素提取纯化技术的研究已有众多报道，专家们在各种提取、分离纯化肝素的技术研究方面也做了大量工作，但综合而言，提取技术水平较高的仍然是发达国家，他们不仅开创和掌握了扎实的提取技术，并具有专用的高分子材料和装备。国内目前这方面欠缺的是先进的工艺和配套的装备。为此，进一步深入探索粗肝素的酶解、提取和分离纯化技术，选择适合我国中小企业的粗品肝素生产模式及研究适合的技术装备，将具有重要的实用价值。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种复合酶提取肝素的方法，所述方法中，通过使用碱性蛋白酶和胰蛋白酶的复合酶进行酶解，从而能够有效的将肝素钠从原材料中分离得到，进而提高肝素钠粗品的提取率。
本发明的第二目的在于提供一种由本发明方法提取得到的肝素钠粗品。
本发明的第三个目的在于提供一种肝素钠的制备方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种复合酶提取肝素的方法，所述方法包括如下步骤：
收集猪小肠新鲜粘膜，并粉碎，加水搅拌，然后加盐搅拌均匀，加入碱性蛋白酶和胰蛋白酶进行酶解；
将所得酶解液浓缩后过滤，然后向滤液中加入树脂进行吸附；
将吸附后的树脂以盐水洗脱，然后将洗脱液以酒精沉淀，固液分离后，将固形物干燥得到肝素钠粗品。
可选的，本发明中，盐浓度为0.60～0.70mol/L；优选的，盐浓度为0.65～0.68mol/L。
可选的，本发明中，所述方法还进一步包括在酶解前将体系的pH调节至8.5～9的步骤；优选的，是将体系的pH调节至8.6～8.8。
可选的，本发明中，所述碱性蛋白酶和胰蛋白酶的总量为0.3～0.5g/L。
可选的，本发明中，所述碱性蛋白酶和胰蛋白酶的用量比为(2～4)：(1～2)；优选的，所述碱性蛋白酶和胰蛋白酶的用量比为(2～3)：(1～1.5)；更优选的，所述碱性蛋白酶和胰蛋白酶的用量比为(2～2.5)：1。
可选的，本发明中，所述酶解的温度为55～65℃，酶解的时间为2～4h；优选的，酶解的温度为60～62℃，酶解的时间为3～4h。
可选的，本发明中，所述树脂为大孔树脂；优选的，所述树脂为D208树脂。
可选的，本发明中，所述干燥的温度为80～85℃，干燥的时间为10～15h。
同时，本发明还提供了由本发明所述方法提取得到肝素钠粗品。
进一步的，本发明也提供了一种肝素钠的制备方法，所述方法中首先按照本发明所述方法提取得到肝素钠粗品，再由肝素钠粗品精制得到肝素钠。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)相较于使用单一种类的酶进行酶解而言，本发明采用复合酶进行酶解的方法，能够有效提高酶解效率，同时提高肝素钠粗品的产率；
(2)本发明中，通过对酶解条件的选择和调整，能够进一步优化酶解反应流程，进一步提高肝素钠粗品的产率。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
鉴于目前现有技术中对肝素提取所存在的肝素得率低等问题，本发明特采用一种复合酶酶解提取-提取液浓缩-过滤-树脂吸附-洗脱-沉淀-干燥的方法进行肝素提取，从而有效提高了肝素的得率，具体的：
本发明中，所用原材料为猪小肠粘膜，其可以由新鲜猪小肠经刮肠机处理后得到；
然后，将所得到的猪小肠新鲜粘膜粉碎，然后加入适量的水进行搅拌，并搅拌均匀；接着，加入适量的盐，并优选的使得体系中盐浓度能够达到0.65～0.68mol/L，继续搅拌均匀；
然后，将体系的pH调节至8.5～9，优选的调节至8.6、8.7，或者8.8；同时，将体系温度调整至55～65℃，优选的调整至60～62℃；
在经过如上的调整后，体系已经适于进行酶解反应，然后，按照(2～4)：(1～2)的质量比，分别加入适量碱性蛋白酶和胰蛋白酶，并使得体系中酶的总浓度能够达到0.3～0.5g/L；其中，优选的，可以将两种酶的质量比调整为(2～3)：(1～1.5)；更优选的，两种酶的质量比为(2～2.5)：1；
酶解的时间控制在2～4h，更优选的，酶解时间控制在3～4h；
然后，将所得酶解液浓缩，并在浓缩后过滤，然后向滤液中加入大孔树脂进行吸附，优选的，所述大孔树脂为D208树脂；
进一步优选的，在使用之前需要对大孔树脂进行预处理，预处理的步骤可参考如下：将原料干树脂在蒸馏水中充分浸泡，然后在溶胀后滤干，加等体积乙醇搅拌1h,用蒸馏水洗净滤干,加4倍量的2mol/L的盐酸溶液搅拌2h,用蒸馏水洗至中性,滤干；加2倍量2mol/L的氢氧化钠溶液搅拌2h,蒸馏水洗至中性,滤干；最后用2倍量2mol/L的盐酸溶液搅拌2h,水洗至中性,滤干后备用；
加入大孔树脂进行吸附的步骤可优选的参考如下：将浓缩过滤后所得滤液加入吸附罐中，然后加入离子交换水，并调整其盐浓度为1～6mol/L；然后加入树脂进行离子交换，并吸附肝素钠；此步骤的时间控制在0.5～8h；离子交换后的树脂以清水清洗后，进行洗脱；
将吸附后的树脂以盐水洗脱，得到洗脱液；
然后将洗脱液以酒精沉淀，沉淀的时间控制在10～12h；然后，将体系进行固液分离，将固形物在80～85℃条件下干燥10～15h后，即得到肝素钠粗品。
进一步的，还可以以本发明肝素钠粗品为原料，并进一步精制得到高纯度的肝素钠，从而进一步提高产品的价值。
实施例1
新鲜猪小肠经刮肠机处理得到新鲜粘膜，将粘膜粉碎后加水搅拌，然后加盐搅拌均匀，使得体系中盐浓度达到0.68mol/L；
将体系pH调节至8.7，温度调整至62℃，然后，按照2.5:1的比例加入碱性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得体系中两种酶的浓度达到0.4g/L,并进行酶解，酶解的时间控制在3h；
将所得酶解液浓缩后过滤，然后向滤液中加入树脂进行吸附；
将吸附后的树脂以盐水洗脱，然后将洗脱液以酒精沉淀，固液分离后，将固形物干燥得到实施例1的肝素钠粗品。
实施例2
新鲜猪小肠经刮肠机处理得到新鲜粘膜，将粘膜粉碎后加水搅拌，然后加盐搅拌均匀，使得体系中盐浓度达到0.60mol/L；
将体系pH调节至8.7，温度调整至62℃，然后，按照2.5:1的比例加入碱性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得体系中两种酶的浓度达到0.4g/L,并进行酶解，酶解的时间控制在3h；
将所得酶解液浓缩后过滤，然后向滤液中加入树脂进行吸附；
将吸附后的树脂以盐水洗脱，然后将洗脱液以酒精沉淀，固液分离后，将固形物干燥得到实施例2的肝素钠粗品。
实施例3
新鲜猪小肠经刮肠机处理得到新鲜粘膜，将粘膜粉碎后加水搅拌，然后加盐搅拌均匀，使得体系中盐浓度达到0.70mol/L；
将体系pH调节至8.7，温度调整至62℃，然后，按照2.5:1的比例加入碱性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得体系中两种酶的浓度达到0.4g/L,并进行酶解，酶解的时间控制在3h；
将所得酶解液浓缩后过滤，然后向滤液中加入树脂进行吸附；
将吸附后的树脂以盐水洗脱，然后将洗脱液以酒精沉淀，固液分离后，将固形物干燥得到实施例3的肝素钠粗品。
实施例4
新鲜猪小肠经刮肠机处理得到新鲜粘膜，将粘膜粉碎后加水搅拌，然后加盐搅拌均匀，使得体系中盐浓度达到0.68mol/L；
将体系pH调节至8.5，温度调整至62℃，然后，按照2.5:1的比例加入碱性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得体系中两种酶的浓度达到0.4g/L,并进行酶解，酶解的时间控制在3h；
将所得酶解液浓缩后过滤，然后向滤液中加入树脂进行吸附；
将吸附后的树脂以盐水洗脱，然后将洗脱液以酒精沉淀，固液分离后，将固形物干燥得到实施例4的肝素钠粗品。
实施例5
新鲜猪小肠经刮肠机处理得到新鲜粘膜，将粘膜粉碎后加水搅拌，然后加盐搅拌均匀，使得体系中盐浓度达到0.68mol/L；
将体系pH调节至9.0，温度调整至62℃，然后，按照2.5:1的比例加入碱性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得体系中两种酶的浓度达到0.4g/L,并进行酶解，酶解的时间控制在3h；
将所得酶解液浓缩后过滤，然后向滤液中加入树脂进行吸附；
将吸附后的树脂以盐水洗脱，然后将洗脱液以酒精沉淀，固液分离后，将固形物干燥得到实施例5的肝素钠粗品。
实施例6
新鲜猪小肠经刮肠机处理得到新鲜粘膜，将粘膜粉碎后加水搅拌，然后加盐搅拌均匀，使得体系中盐浓度达到0.68mol/L；
将体系pH调节至8.7，温度调整至62℃，然后，按照2.5:1的比例加入碱性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得体系中两种酶的浓度达到0.5g/L,并进行酶解，酶解的时间控制在3h；
将所得酶解液浓缩后过滤，然后向滤液中加入树脂进行吸附；
将吸附后的树脂以盐水洗脱，然后将洗脱液以酒精沉淀，固液分离后，将固形物干燥得到实施例6的肝素钠粗品。
实施例7
新鲜猪小肠经刮肠机处理得到新鲜粘膜，将粘膜粉碎后加水搅拌，然后加盐搅拌均匀，使得体系中盐浓度达到0.68mol/L；
将体系pH调节至8.7，温度调整至62℃，然后，按照4:1的比例加入碱性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得体系中两种酶的浓度达到0.4g/L,并进行酶解，酶解的时间控制在3h；
将所得酶解液浓缩后过滤，然后向滤液中加入树脂进行吸附；
将吸附后的树脂以盐水洗脱，然后将洗脱液以酒精沉淀，固液分离后，将固形物干燥得到实施例7的肝素钠粗品。
实施例8
新鲜猪小肠经刮肠机处理得到新鲜粘膜，将粘膜粉碎后加水搅拌，然后加盐搅拌均匀，使得体系中盐浓度达到0.68mol/L；
将体系pH调节至8.7，温度调整至62℃，然后，按照1:1的比例加入碱性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得体系中两种酶的浓度达到0.4g/L,并进行酶解，酶解的时间控制在3h；
将所得酶解液浓缩后过滤，然后向滤液中加入树脂进行吸附；
将吸附后的树脂以盐水洗脱，然后将洗脱液以酒精沉淀，固液分离后，将固形物干燥得到实施例8的肝素钠粗品。
对比例1
新鲜猪小肠经刮肠机处理得到新鲜粘膜，将粘膜粉碎后加水搅拌，然后加盐搅拌均匀，使得体系中盐浓度达到0.68mol/L；
将体系pH调节至8.7，温度调整至62℃，然后，加入碱性蛋白酶，并使得体系中的酶浓度达到0.4g/L,并进行酶解，酶解的时间控制在3h；
将所得酶解液浓缩后过滤，然后向滤液中加入树脂进行吸附；
将吸附后的树脂以盐水洗脱，然后将洗脱液以酒精沉淀，固液分离后，将固形物干燥得到对比例1的肝素钠粗品。
对比例2
新鲜猪小肠经刮肠机处理得到新鲜粘膜，将粘膜粉碎后加水搅拌，然后加盐搅拌均匀，使得体系中盐浓度达到0.68mol/L；
将体系pH调节至8.7，温度调整至62℃，然后，加入胰蛋白酶，并使得体系中的酶浓度达到0.4g/L,并进行酶解，酶解的时间控制在3h；
将所得酶解液浓缩后过滤，然后向滤液中加入树脂进行吸附；
将吸附后的树脂以盐水洗脱，然后将洗脱液以酒精沉淀，固液分离后，将固形物干燥得到对比例2的肝素钠粗品。
实验例1
按照肝素钠得率＝肝素钠粗品质量/新鲜粘膜质量，分别计算各组实施例和对比例的肝素钠得率，结果如下：
实验组 肝素钠得率(×100％)
实施例1 0.034
实施例2 0.031
实施例3 0.029
实施例4 0.025
实施例5 0.027
实施例6 0.028
实施例7 0.022
实施例8 0.021
对比例1 0.016
对比例2 0.012
由如上的对比数据可以看出，以复合酶进行酶解能够有效提高肝素钠粗品的得率；同时，由各实施例组的得率数据对比也可以看出，酶解反应条件对于肝素钠粗品的得率也有着一定的影响。
然后，分别对各组所制得的肝素钠粗品进行吸光度测试，结果显示：实施例1的肝素钠粗品的吸光度明显低于对比例1、2的吸光度。由此可见，以复合酶进行酶解所得肝素钠粗品的纯度要优于采用单一酶进行酶解的产物；
同时，实施例2-8所得肝素钠粗品的吸光度基本相当，且稍高于实施例1产品。由此可见，相较于其他实验组而言，以实施例1条件进行酶解所得肝素钠的纯度最高。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种复合酶提取肝素的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
收集猪小肠新鲜粘膜，并粉碎，加水搅拌，然后加盐搅拌均匀，加入碱性蛋白酶和胰蛋白酶进行酶解；
将所得酶解液浓缩后过滤，然后向滤液中加入树脂进行吸附；
将吸附后的树脂以盐水洗脱，然后将洗脱液以酒精沉淀，固液分离后，将固形物干燥得到肝素钠粗品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，盐浓度为0.60～0.70mol/L；
优选的，盐浓度为0.65～0.68mol/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还进一步包括在酶解前将体系的pH调节至8.5～9的步骤；
优选的，是将体系的pH调节至8.6～8.8。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶和胰蛋白酶的总量为0.3～0.5g/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶和胰蛋白酶的用量比为(2～4)：(1～2)；
优选的，所述碱性蛋白酶和胰蛋白酶的用量比为(2～3)：(1～1.5)；
更优选的，所述碱性蛋白酶和胰蛋白酶的用量比为(2～2.5)：1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解的温度为55～65℃，酶解的时间为2～4h；
优选的，酶解的温度为60～62℃，酶解的时间为3～4h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述树脂为大孔树脂；优选的，所述树脂为D208树脂。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干燥的温度为80～85℃，干燥的时间为10～15h。
9.根据权利要求1-8中任一项所述方法提取得到肝素钠粗品。
10.一种肝素钠的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：首先按照权利要求1-8中任一项所述方法提取得到肝素钠粗品，再由肝素钠粗品精制得到肝素钠。
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