CN101805764A

CN101805764A - 一种肝素钠的高效提取工艺

Info

Publication number: CN101805764A
Application number: CN 201010137850
Authority: CN
Inventors: 汪志君; 葛庆丰; 于海; 方维明; 金昌海
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2010-04-02
Filing date: 2010-04-02
Publication date: 2010-08-18
Anticipated expiration: 2030-04-02
Also published as: CN101805764B

Abstract

本发明主要公开了一种肝素钠的高效提取工艺，所述肝素钠的提取工艺步骤为：先对新鲜肠衣粘膜进行酶解，然后进行吸附、脱附处理，最后沉淀、烘干获得肝素钠，其创新点在于：所述对新鲜肠衣的酶解工艺为超声波酶解工艺，所述超声波酶解工艺为将pH值为8-9的料液与单根小肠混合水在45℃的温度下与3％体积比的蛋白酶在以超声为介质的条件下酶解，将肝素钠与蛋白的结合部位快速切断，获得肝素钠。本发明的优点在于：将超声波酶解法应用于肝素钠提取，确定最佳工艺条件，市场需求量大，该工艺大大缩短生产周期，且产品得率高，纯度高，经济效益十分显著。

Description

一种肝素钠的高效提取工艺

技术领域

本发明涉及一种动物肠衣的肝素钠的提取工艺，具体涉及一种利用蛋白酶将肝素钠与动物肠衣中的蛋白进行分离，从而有效获得肝素钠的提取工艺。

背景技术

目前全球肝素钠制剂总销售额已超过40亿美元，肝素钠已成为全球第一大生化药物，我国是肝素钠原料的主要出口国，目前国内粗品肝素钠生产企业有500多家，大多数企业规模较小，所得产品收率低，纯度低，且在生产过程中树脂再生困难，产生的废水污染环境严重。

本发明所对应的现有技术中的动物肠衣肝素钠的提取工艺有以下两种：盐解法提取、酶解法提取和酶解加盐解法提取。

盐解法工艺概述：

上述步骤中主要盐解法提取法为将5％NaCL或盐水混匀后波美氏表大约4.5度作为盐解液，对动物小肠进行盐解，分离出肝素。该工艺的缺点在于：分解不完全，残留量比较大。

酶解法工艺概述：

上述步骤中，主要酶解法提取法为将4.5％NaCl或盐水混匀后波美氏表大约4.5度；在盐水4.3度时加10万单位蛋白酶3-4KG作为酶解液，对动物小肠进行酶解，该工艺的缺点在于：分解后的杂质比较多，纯度低。

发明内容

本发明的主要任务在于提供一种肝素钠的高效提取工艺，具体是一种采用蛋白酶提取肝素钠时采用超声作介质，利用超声波的机械振动作用和空化作用，加速肝素与蛋白的结合部位切断，有利于肝素在溶剂中的溶解和下一步的分离纯化。

为了解决以上技术问题，本发明的一种肝素钠的高效提取工艺，所述肝素钠的提取工艺步骤为：先对新鲜肠衣粘膜进行酶解，然后进行吸附、脱附处理，最后沉淀、烘干获得肝素钠，其创新点在于：所述对新鲜肠衣的酶解工艺为超声波酶解工艺，所述超声波酶解工艺为将pH值为8-9的料液与单根小肠混合水在45℃的温度下与3％体积比的蛋白酶在以超声为介质的条件下酶解，将肝素钠与蛋白的结合部位快速切断，获得肝素钠；所述介质超声的超声时间为10-60min，超声功率为240-440W，单次超声时间为1-5S，超声时间与间歇时间的比值为1∶1-5∶1。

进一步地，所述工艺中料液与单根小肠混合水的体积比为1.2-6∶1。

进一步地，所述超声时间优选值为30-40min。

进一步地，所述超声功率优选320W。

进一步地，所述单次超声时间优选值为3S。

进一步地，所述超时间与间歇时间的优选比值为3∶1。

本发明的优点在于：超声波提取以其提取温度低、提取率高、提取时间短的独特优势被广泛应用于中药材和各种动、植物有效含量的提取，是替代传统剪切工艺方法实现高效、节能、环保式提取的现代高新技术手段。将超声波酶解法应用于肝素钠提取，确定最佳工艺条件，市场需求量大，该工艺大大缩短生产周期，且产品得率高，纯度高，经济效益十分显著。

该提取工艺包括以下步骤：首先对新鲜肠衣粘膜进行超声波酶解，然后进行吸附、脱附处理，最后沉淀、烘干获得肝素钠。在上述工艺中酶解过程利用超声波的机械振动作用和空化作用，加速肝素与蛋白的结合部位切断，有利于肝素在溶剂中的溶解和下一步的分离纯化。采用该提取工艺提取肝素钠，单根小肠可提取肝素钠0.53g，产品效价为106U，比单独的酶法提取量提高15.2％，比单独的超声波法提取量提高35.07％，提取时间节省了2.5小时。该工艺简单，生产周期短，得率高，质量稳定，蛋白质残留量小，肝素钠纯度高。

附图说明

图为本发明的工艺流程图。

具体实施方式

本发明的肝素钠提取的整个工艺流程如附图所示，首先进行小肠粘膜溶液的ph值调试1，然后进行超声酶解2、以及过滤3、树脂吸附4、树脂吸附饱后进行洗涤5、洗脱6、冷冻离心7、过滤取上清液8、乙醇沉淀9、冷冻干燥10、包装11、保藏12。

具体操作步骤如下：

首先进行小肠粘膜溶液的ph值调试1的步骤：将小肠粘膜溶液和料液进行配比，将单根小肠与料液按体积比作单根小肠加水2.4L的比例进行混合，选其混合后的ph值为8-9。

然后将配比后的混合溶液进行超声酶解2的步骤：在该步骤中，所用的超声机为功率在240-440W、可间息性进行超声的普通超声机，超声机的工作温度设在45℃。

本步骤中混合液与蛋白酶的配比按体积比为为3％。

具体工作时，为了更快速、有效地将蛋白与肝素分解，将混合液与蛋白酶在超声波为介质的条件下酶解，即将超声波导入溶液中。酶解原理与一般酶解相同，在此不再累述。但酶解时采用的超声波介质的要求具体如下：超声时间为10-60min，超声功率为240-440W，单次超声时间为1-5S，超声时间与间歇时间的比值为1-5∶1。

通过上述超声酶解后，肝素与蛋白分离，肝素保留于溶液中形成母液，蛋白成为固体杂渣，通过过滤3的步骤，用100目的滤布将母液中的固体杂渣过滤，然后将过滤后的母液输至吸附池。

在吸附池中，将上述过滤后的母液进行树脂吸附4步骤的处理：将母液的温度调节至45℃，用D208树脂与母液按质量比例为4-5％的比例配置利用树脂的物理性能进行搅拌吸附8小时

接下来是树脂吸附饱和后进行洗涤5的步骤：将吸附后的溶液用100目的滤布过滤取出树脂，先将树脂用清水洗净，然后加2波美度，ph值为2的盐水，盐水的加入量与树脂的重量比例为1∶1，加入后，搅拌半小时后放出，用清水将树脂清洗干净。

第6个步骤是洗脱：配置20波美度左右的盐水，升温至60℃，按重量比1∶1的比例加到已经洗净的树脂中，加盐控制放出的盐度为18波美度并搅拌，进行一次洗脱，搅拌洗脱3小时。取出洗脱液，按重量比1∶1比树脂加清水到经2次洗脱的树脂，加盐控制放出盐度为20波美度进行3次洗脱，洗脱时间为2小时。

第7个步骤是冷冻离心：将待冷冻产品放入冷冻离心机，在冷冻离心温度为4℃，离心转速为14000r/min的环境下离心15min后停止离心，完成冷冻过程。

第8个步骤即过滤：采用100-120目多层布筛进行过滤取离心管中的上清液。

第9个步骤乙醇沉淀：加入等体积的100％冷乙醇，加入1/10体积的NaAC(3M，pH5.2)后上下颠倒混匀，-20度30分钟，12000转4℃离心10分钟。倒掉上清，加入70％的冷乙醇，轻轻混匀，12000转4℃离心10分钟；倒掉上清，放在室温中干燥，标准是闻不到乙醇的味道。加入适当体积水或者TE缓冲液溶解即可。

第10个步骤冷冻干燥：先将准备干燥的物品置于低温冰箱或液氮中，使物品完全冰冻结实，然后将已准备好的待干燥物品置于干燥盘中，密封罩上有机玻璃筒，然后置于冷冻机中抽真空至-20Pa以下，进行冷冻干燥12-24小时完成该步骤。

完成上述步骤后，就进行包装11、保藏12，该两步骤为常规步骤，在此不再累述。

实施例：

1、超声功率对提取肝素钠的影响

取单根小肠小肠粘膜配成等体积溶液，pH为8.5，提取时间40min，超声单次发生时间3s，发生时间与间歇时间的比值为3∶1，超声强度分别为240W、280W、320W、360W、400W、440W，反应结束后测试溶液中肝素钠的浓度，平行三次取平均值，在320W超声条件下，溶液中肝素钠的产量最大。

超声功率(W)	240W	280W	320W	360W	400W	440W
超声功率(W)	240W	280W	320W	360W	400W	440W	肝素产量(g)	0.73	0.84	1.05	0.89	0.86	0.82

2、超声时间对提取肝素钠的影响

取单根小肠小肠粘膜配成等体积溶液，pH为8.5，超声单次发生时间3s，超声强度320W，发生时间与间歇时间的比值为3∶1，提取时间分别为10min、20min、30min、40min、50min、60min，反应结束后测试溶液中肝素钠的浓度，平行三次取平均值，在反应40min后，溶液中肝素钠的含量达到最大值，反应时间延长，溶液中肝素钠的含量保持不变。

超声时间(min)	10min	20min	30min	40min	50min	60min
超声时间(min)	10min	20min	30min	40min	50min	60min	肝素产量(g)	0.79	0.83	0.95	1.04	1.04	1.04

3、超声频率对提取肝素钠的影响

取单根小肠小肠粘膜配成等体积溶液，pH为8.5，反应时间为60min，采用发散超声方式，发声频率分别为40KHZ与60KHZ，分别于10min、20min、30min、40min、50min、60min，采集溶液样品测肝素钠的浓度，平行三次取平均值，随着但应时间的增加，溶液中肝素钠的产量变化不大，因此采用发散超声作用方式不能运用于提取肝素钠。

超声时间	10min	20min	30min	40min	50min	60min
超声时间	10min	20min	30min	40min	50min	60min	40KHZ肝素产量(g)	0.76	0.764	0.75	0.752	0.753	0.76
60KHZ肝素产量(g)	0.76	0.78	0.77	0.78	0.78	0.78	40KHZ肝素产量(g)	0.76	0.764	0.75	0.752	0.753	0.76

4、发声时间与间歇时间的比值对提取肝素钠的影响

取单根小肠小肠粘膜配成等体积溶液，pH为8.5，超声单次发生时间3s，超声强度320W，发生时间与间歇时间的比值分别为5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1，提取时间为40min，反应结束后测试溶液中肝素钠的浓度，平行三次取平均值。发声时间与间歇时间的比值为3∶1时，溶液中肝素钠的产量最大。

发声方式(发声时间/间歇时间)	5∶1	4∶1	3∶1	2∶1	1∶1
发声方式(发声时间/间歇时间)	5∶1	4∶1	3∶1	2∶1	1∶1	肝素产量(g)	0.872	0.877	1.04	0.848	0.844

5、单次发生时间对对提取肝素钠的影响

取单根小肠小肠粘膜配成等体积溶液，pH为8.5，时间3s，超声强度320W，发生时间与间歇时间的比值为3∶1，提取时间为40min，超声单次发生时间分别为1s、2s、3s、4s、5s，反应结束后测试溶液中肝素钠的浓度，平行三次取平均值。超声单次发生时间3s时，溶液中肝素钠的产量最大。

单次发声时间(s)	1	2	3	4	5
单次发声时间(s)	1	2	3	4	5	肝素产量(g)	0.79	0.83	1.024	0.84	0.78

6、料液比对提取肝素钠的影响

取单根小肠小肠粘膜配成不同体积溶液，pH为8.5，时间3s，超声强度320W，发生时间与间歇时间的比值为3∶1，提取时间为40min，超声单次发生时间为3s，料液比分别设定为单根小肠加入1.2L、2.4L、3.6L、4.8L、6L。反应结束后测试溶液中肝素钠的浓度，平行三次取平均值。超声单次发生时间3s时，溶液中肝素钠的产量最大。

料液比(单根小肠加水)	1.2L	2.4L	3.6L	4.8L	6L
料液比(单根小肠加水)	1.2L	2.4L	3.6L	4.8L	6L	肝素产量(g)	0.8	0.86	1.03	0.94	0.88

以猪小肠粘膜为原料，在单因素数的基础上，选取超声功率、超声时间、超声温度、料液比四个因素，应用二次回归正交试验对超声波酶解提取肝素的工艺条件进行优化，优化结果为：料液比为单根小肠混合水2.4L，反应温度45℃，超声时间40min，超声功率320W，单次超声时间为3S，超时间与间歇时间的比值为3∶1，pH为8.5.。肝素的提取率为单根小肠提取肝素钠0.53g，产品效价为106U，比单独的酶法提取量提高15.2％，比单独的超声波法提取量提高35.07％，提取时间节省了2.5小时。

Claims

1.一种肝素钠的高效提取工艺，所述肝素钠的提取工艺步骤为：先对新鲜肠衣粘膜进行酶解，然后进行吸附、脱附处理，最后沉淀、烘干获得肝素钠，其特征在于：所述对新鲜肠衣的酶解工艺为超声波酶解工艺，所述超声波酶解工艺为将pH值为8-9的料液与单根小肠混合水在45℃的温度下与3％体积比的蛋白酶在以超声为介质的条件下酶解，将肝素钠与蛋白的结合部位快速切断，获得肝素钠；所述介质超声的超声时间为10-60min，超声功率为240-440W，单次超声时间为1-5S，超声时间与间歇时间的比值为1-5∶1。

2.根据权利要求1所述的一种肝素钠的高效提取工艺，其特征在于：所述工艺中料液与单根小肠混合水的体积比为1.2-6∶1。

3.根据权利要求1所述的一种肝素钠的高效提取工艺，其特征在于：所述超声时间优选值为30-40min。

4.根据权利要求1所述的一种肝素钠的高效提取工艺，其特征在于：所述超声功率优选320W。

5.根据权利要求1所述的一种肝素钠的高效提取工艺，其特征在于：所述单次超声时间优选值为3S。

6.根据权利要求1所述的一种肝素钠的高效提取工艺，其特征在于：所述超时间与间歇时间的优选比值为3∶1。