CN116036262A - 一种人参酸性多糖疫苗佐剂、疫苗组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种疫苗佐剂，包括人参酸性多糖(GAPS)，其能显著地提高抗原免疫后的特异性抗体(或中和抗体)滴度，可以有效地增强狂犬疫苗、流感疫苗、乙肝疫苗甲肝疫苗、丙肝疫苗、手足口疫苗、HPV疫苗、新型冠状病毒疫苗的免疫应答活性，且来自于天然植物，来源明确，资源丰富，且成分具有较好的安全性和稳定性。
Description
技术领域
本申请涉及医药技术领域，具体涉及一种人参酸性多糖(GAPS)疫苗佐剂、疫苗组合物及其应用。
背景技术
疫苗可以在生物体中启动体液性免疫反应而产生抗体，或者透过细胞性免疫反应而活化毒杀性T细胞等淋巴细胞，以抵抗入侵的外来病原菌，并预防疾病发生(Cavallo Fetal.,Vaccination for treatment and prevention of cancerin animal models.AdvImmunol.2006.90:175-213.Review)。虽然疫苗具有活化免疫系统的效果，但在临床使用上常发现其对特定自身免疫系统太弱的族群，例如老人与小孩无法发挥其应有的效能，因此适量疫苗佐剂的添加有其必要性。
疫苗佐剂是指能够非特异性改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答的物质，要求无毒性、纯度高、有一定的吸附能力性质稳定。疫苗佐剂的作用机理主要是可以增加抗原表面积，提高免疫原性；对抗原起缓释作用，延长抗原在组织中的滞留时间；促进炎症反应，刺激主动免疫应答。
佐剂的功能，通常可区分为两大类。第一种为吸附抗原，协助抗原被细胞吞噬，如铝盐及M59乳化剂等(O'Hagan D T,Wack A,Podda A.MF59is a safeand potent vaccineadjuvant for flu vaccines in humans:what did we learn duringits development？Clin Pharmacol Ther.2007Dec；82(6):740-4；4.Clapp T,Siebert P，Chen D,JonesBraun L.Vaccines with aluminum-containing adjuvants:optimizing vaccineefficacy and thermal stability.J Pharm Sci.2011Feb；100(2):388-401)；另一种则是免疫调节因子，如弗氏佐剂含结合分枝杆菌(CFA-mycobacteria)等(Hoft DF，Blazevic A,Abate G，Hanekom WA,KaplanG，Soler JH,Weichold F,Geiter L,Sadoff JC,HorwitzMA.A new recombinantbacille Calmette-Guérin vaccine safely inducessignificantly enhancedtuberculosis-specific immunity in human volunteers.JInfect Dis.2008Nov15；198(10):1491-501)。目前市售疫苗佐剂多为铝盐佐剂，但是铝盐可引起注射部位的炎症并刺激局部红斑、肉芽肿和皮下结节，同时，铝盐佐剂可能会延缓部分疫苗的中和抗体的产生，在应用时受到多种限制，因此亟需开发新颖的佐剂以提升疫苗的抗原专一性或抗肿瘤抗感染的能力。
发明内容
本申请提供了一种新的疫苗佐剂，人参酸性多糖(GAPS)，具有良好的活性，可以提高机体对于狂犬疫苗、流感疫苗、乙肝疫苗甲肝疫苗、丙肝疫苗、手足口疫苗、HPV疫苗、新型冠状病毒疫苗的特异性抗体(或中和抗体)滴度水平。
具体的，本申请采用如下技术方案
1、一种疫苗佐剂，包括人参酸性多糖(GAPS)。
2、根据项1所述的疫苗佐剂，还包括生理盐水或疫苗注射用水或药用辅料。进一步优选，所述疫苗佐剂由人参酸性多糖(GAPS)和生理盐水或疫苗注射用水或药用辅料组成，如，所述疫苗佐剂由人参酸性多糖(GAPS)和生理盐水组成，如，所述疫苗佐剂由人参酸性多糖(GAPS)和疫苗注射用水组成，如，所述疫苗佐剂由人参酸性多糖(GAPS)和药用辅料组成。
3、根据项1或2所述的疫苗佐剂，所述人参酸性多糖是由人参提取得到的。
4、根据项3所述的疫苗佐剂，所述提取过程包括，
取人参，提取人参总多糖，
将提取的人参总多糖，溶于去离子水，
进行柱层析后用洗脱液进行洗脱，
将洗脱液用蒸馏水透析，
冷冻干燥，获得到人参酸性多糖。
5、根据项4所述的疫苗佐剂，所述柱层析的柱为DEAE纤维素柱或大孔树脂柱，优选为DEAE纤维素柱，进一步优选所述柱层析以2～8mL/min上样。
6、根据项4或5所述的疫苗佐剂，所述洗脱液为水和碱溶液、硼砂溶液或盐溶液，所述盐溶液优选为NaCl溶液，进一步优选所述洗脱液的浓度为0.3～0.7mol/L的，进一步优选所述洗脱流速为0.5～2mL/min。
7、根据项4-6中任一项所述的疫苗佐剂，所述将洗脱液用蒸馏水透析之前还包括将洗脱液以苯酚硫酸法检测A490，收集吸收峰，然后进行透析，优选，所述透析时间为24～72小时。
8、一种疫苗组合物，包括项1-7中任一项所述的疫苗佐剂和抗原或编码所述抗原的DNA。
9、根据项8所述的疫苗组合物，所述GAPS与抗原的用量比为：
优选地，所述用量比为：
优选地，所述用量比为：
优选地，所述用量比为：
优选地，所述用量比为：
优选地，所述用量比为：
优选地，所述用量比为：
优选地，所述用量比为：
10、根据项8或9所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物还包括药用辅料和第二疫苗佐剂。
11、根据项8-10中任一项所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物为狂犬疫苗、流感疫苗、乙肝疫苗、甲肝疫苗、丙肝疫苗、手足口疫苗、HPV疫苗或新型冠状病毒疫苗。
12、根据项8-11中任一项所述的疫苗组合物，所述疫苗类型为灭活病毒疫苗、减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、DNA疫苗或多肽疫苗。
13、项1-7中任一项所述的疫苗佐剂在制备疫苗制剂、疫苗组合物或抗体中的用途。
发明效果
(1)本申请公开的活性成分人参酸性多糖GAPS作为疫苗佐剂使用，其具有很高的佐剂活性。酸性多糖由于其高含量的硫酸根例子及羧酸根例子，具有较高的负电荷密度，因此可能参与体内的多种酶促反应及免疫活动(例如动物体内广泛具有的肝素即为小分子酸性多糖)，酸性多糖广泛来源于动物、植物和微生物，其单糖组成、糖链上酸性基团的种类和多少随来源种属不同而各有差异。但植物来源的酸性多糖为大分子结构，其多作为水溶性膳食纤维使用，佐剂活性方面的研究非常有限。本申请经过大量筛选试验，在活性筛选过程中发现人参酸性多糖具有很高的佐剂活性，可以有效地增强多种疫苗的免疫应答活性，尤其是人参酸性多糖来自于天然植物，来源明确，资源丰富，且成分具有较好的安全性和稳定性。
(2)本申请的人参酸性多糖GAPS能显著地提高抗原免疫后的特异性抗体(或中和抗体)滴度，可以有效地增强狂犬疫苗、流感疫苗、乙肝疫苗甲肝疫苗、丙肝疫苗、手足口疫苗、HPV疫苗、新型冠状病毒疫苗的免疫应答活性。且其活性显著高于现有常用的疫苗佐剂。
(3)本申请的人参酸性多糖GAPS疫苗佐剂，具有免疫效果好、使用方便等优点，为疫苗提供了新的佐剂选择。
附图说明
附图用于更好地理解本申请，不构成对本申请的不当限定。其中：
图1为人参多糖洗脱-吸光度曲线；
图2为吸光度-葡萄糖含量标准曲线；
图3为吸光度-蛋白质含量标准曲线；
图4为GAPS及GPS对狂犬疫苗免疫小鼠IgG抗体水平的影响；
图5为GAPS及GPS对狂犬疫苗免疫小鼠中和抗体效价的影响；
图6为GAPS及GPS对流感疫苗免疫小鼠中和抗体水平的影响；
图7为不同剂量的GAPS对流感疫苗免疫小鼠中和抗体水平的影响；
图8为GAPS及GPS对乙肝疫苗免疫小鼠IgG抗体效价的影响；
图9为GAPS及GPS对甲肝疫苗免疫小鼠中和抗体水平的影响；
图10为不同剂量的GAPS对甲肝疫苗免疫小鼠中和抗体水平的影响；
图11为GAPS及GPS对丙肝疫苗免疫小鼠IgG抗体水平的影响；
图12为GAPS及GPS对手足口疫苗免疫小鼠中和抗体水平的影响；
图13为GAPS及GPS对手足口疫苗免疫小鼠IgG抗体水平的影响；
图14为不同剂量的GAPS对手足口疫苗免疫小鼠中和抗体水平的影响；
图15为GAPS及GPS对HPV疫苗免疫小鼠IgG抗体效价的影响；
图16为不同剂量的GAPS对HPV疫苗免疫小鼠IgG抗体效价的影响；
图17为GAPS及GPS对新型冠状病毒疫苗免疫小鼠IgG抗体水平的影响；
图18不同剂量的GAPS对新型冠状病毒疫苗免疫小鼠IgG抗体水平的影响。
具体实施方式
以下对本申请的示范性实施例做出说明，其中包括本申请实施例的各种细节以助于理解，应当将它们认为仅仅是示范性的。因此，本领域普通技术人员应当认识到，可以对这里描述的实施例做出各种改变和修改，而不会背离本申请的范围和精神。同样，为了清楚和简明，以下的描述中省略了对公知功能和结构的描述。
本申请公开了一种疫苗佐剂，包括人参酸性多糖(GAPS)。
一种优选的实施方式，所述疫苗佐剂还包括生理盐水或疫苗注射用水或药用辅料。
如本文所用，术语“疫苗“是指任何适于刺激动物或人类中的活性免疫性的抗原或致免疫性物质的制剂。
如本文所用，术语“佐剂＂，是指提高、增加、向上调节、改变或以其它方式促进动物中对抗原的免疫反应(例如，体液或细胞免疫反应)的任何物质或物质的混合物。
如本文所用，术语“抗原”是指当被引入至免疫活性的人或动物中时，刺激体液及/或细胞介导的免疫反应的任何物质。该抗原可为纯物质、物质的混合物或微粒物质(包括细胞、细胞片段或细胞衍生片段)或活的(通常经减毒)的生物或病毒。适当抗原的实例包括但不限于：蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、肤、碳水化合物/多糖、脂多糖、毒素、病毒、细菌、真菌及寄生物。其它适当抗原包括抗原的最小组分，例如(但不限于)，抗原决定簇、表位或肤。仍然适当的其它抗原包括那些描述于美国专利笫5,855,894号中的抗原。抗原可以为天然(自然表达或制得)的、合成的，或由那些本领域的技术人员熟悉的重组DNA方法学所衍生的。
如本文所用，术语“药用辅料”指生产药品和调配处方时，为解决制剂的成型性、有效性、稳定性、安全性加入处方中除主药以外的一切药用物料的统称，在安全性方面已进行了合理的评估，且包含在药物制剂中的物质。药用辅料除了赋形、充当载体、提高稳定性外，还具有增溶、助溶、缓控释等重要功能，是可能会影响到药品的质量、安全性和有效性的重要成分。本申请所述药用辅料可以是适当的载体或赋形剂、乳化剂、润湿剂、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂、佐剂(例如氢氧化铝佐剂、油剂佐剂、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)等。
如本文所用，术语“人参酸性多糖”是指从五加科植物人参中提取的酸性多糖。所述从五加科植物人参中提取可以是从原始人参中提取，也可以从如从经过加工后的人参提取，如从人参的二次开发制品中提取，如从人参中提取的人参总多糖中提取，如从人参中提取的人参总多糖后剩余的其他部分提取，如从人参提取废料中提取，如从含有人参的药渣中提取等等，只要含有人参酸性多糖的成分的人参任何制品中提取的人参酸性多糖都可以作为本申请疫苗佐剂使用。
在一种优选的实施方式中，所述人参酸性多糖是购买所得，在一种优选的实施方式中，所述人参酸性多糖是从人参中提取，在一种优选的实施方式中，所述人参酸性多糖是从人参多糖中提取，在一种优选的实施方式中，所述人参酸性多糖是通过如下方式进行提取：
取人参，提取人参总多糖，
将提取的人参总多糖，溶于去离子水，
进行柱层析后用洗脱液进行洗脱，
将洗脱液用蒸馏水透析，
冷冻干燥，获得到人参酸性多糖。
如本文所用，术语“人参多糖”是指从五加科植物人参中提取的总多糖。在本申请中，与术语“人参总多糖”的含义相同，可以互换使用，所述从人参中提取人参总多糖的方法可以是本领域内任何能够从人参中提取到人参总多糖的方法，也可以通过如下方法进行提取：
将人参用水提取，得到第一提取物，
向第一提取物中加入蛋白酶培养后提取，得到第二提取物，
将第二提取物通过乙醇和水提取，得到人参粗多糖，
将人参粗多糖溶解后透析，并去除截留液中的蛋白质，
将去除蛋白质后的截留液使用乙醇提取，得到人参总多糖。
在一个具体的实施方式中，得到第一提取物的步骤包括：
干燥的人参根1kg粉碎至10-20目，加入8倍量水(g:mL)，沸水浴煮8h，过滤并收集滤液；向滤渣中继续加入10倍量水(g:mL)，沸水浴加热8h。合并两次滤液，6000rpm离心10min。取上清蒸干，得到第一提取物。
在一个具体的实施方式中，得到第二提取物的步骤中，蛋白酶培养温度为30℃～40℃，培养时间为1～3h。
在一个具体的实施方式中，得到第二提取物的步骤包括：
向第一提取物加入中性蛋白酶，40℃培养3h，后以100℃灭活30min，将混合溶液以10000rpm离心，得到上清液，蒸干，得到第二提取物。
在一个具体的实施方式中，得到人参粗多糖的步骤包括：
将第二提取物使用10倍体积的95％的乙醇低温浸泡2.0h。过滤，取滤渣，加2倍体积的蒸馏水溶解，沸水回流提取3次，每次1.0h，120目尼龙布过滤，合并提取液，浓缩至500mL，离心20分钟(5000rpm)，弃去沉淀。向上清液加入95％的乙醇至乙醇终浓度为90％，静置1h。离心20分钟(5000转/分钟)，收集沉淀，再向沉淀中加入400mL蒸馏水，再向上清液加入95％的乙醇至终浓度为80％，静置1h，离心20分钟(5000转/分钟)，室温静置过夜，收集沉淀。次日，将沉淀依次用无水乙醇、95％乙醇洗涤两次。并冷冻干燥得人参粗多糖，
在一个具体的实施方式中，所述透析时的截取分子量为800～2500kDa，例如可以为900kDa、1000kDa、1100kDa、1200kDa、1300kDa、1400kDa、1500kDa、1600kDa、1700kDa、1800kDa、1900kDa、2000kDa、2100kDa、2200kDa、2300kDa、2400kDa，优选为1000～1500kDa。
在一个具体的实施方式中，使用Sevag试剂去除截留液中的蛋白质。
在一个具体的实施方式中，将人参粗多糖溶解后透析，并去除截留液中的蛋白质的步骤包括：
将人参粗多糖配制备成30％的水溶液，加入1000kDa透析袋进行透析，静置过夜。取透析袋内液体，向其中加入1/4体积的Sevag试剂，静置离心后除去凝胶状沉淀。重复上述操作5次。
在一个具体的实施方式中，将去除蛋白质后的截留液使用乙醇提取，得到人参总多糖的步骤包括：
合并去除蛋白质的截留液上清液，减压浓缩除去有机试剂。加入95％的乙醇至终浓度为80％，4℃静置过夜，离心，除上清。沉淀依次用95％乙醇、无水乙醇洗涤两次。冷冻干燥得人参总多糖。
本申请的人参酸性多糖提取过程中，在进行柱层析后用洗脱液进行洗脱时，所述柱可以是本领域内任何能够实现柱层析的柱，一种优选的实施方式，所述柱层析的柱为DEAE纤维素柱或大孔树脂柱，优选为DEAE纤维素柱，进一步优选所述柱层析以2～8mL/min上样，例如可以为3mL/min、4mL/min、5mL/min、6mL/min、7mL/min。
所述洗脱液可以是本领域内任何一种能够达到洗脱目的的一种或两种以上的溶液，一种优选的实施方式，所述洗脱液为水和碱溶液，或者水和硼砂溶液，或者水和盐溶液，进一步优选的实施方法，所述洗脱液为水和盐溶液，进一步优选的实施方法，所述洗脱液为水和NaCl溶液。
所述洗脱液的浓度可以是本领域内任何一种能够达到洗脱目的的浓度，一种优选的实施方式，所述洗脱液的浓度为0.3～0.7mol/L的，例如可以为0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L。
所述洗脱流速可以是本领域内任何一种能够达到洗脱目的的流速，一种优选的实施方式，所述洗脱流速为0.5～2mL/min，例如可以为0.6mL/min、0.7mL/min、0.8mL/min、0.9mL/min、1.0mL/min、1.1mL/min、1.2mL/min、1.3mL/min、1.4mL/min、1.5mL/min、1.6mL/min、1.7mL/min、1.8mL/min、1.9mL/min。
一种优选的实施方式，所述将洗脱液用蒸馏水透析之前还包括将洗脱液以苯酚硫酸法检测A490，收集吸收峰，然后进行透析，优选，所述透析时间为24～72小时，例如可以为25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、35小时、40小时、45小时、50小时、55小时、60小时、65小时、70小时。
本申请进一步提供了一种疫苗组合物，包括本申请中含有人参酸性多糖的任一种的疫苗佐剂和抗原或编码所述抗原的DNA。
所述疫苗组合物中疫苗佐剂的用量为以起到治疗效果的有效量，所述有效量是提高、增加、向上调节、改变或以其它方式促进对抗原的免疫反应的量。具体地说，治疗有效量是诱导易感于由病原体、癌细胞或过敏原引起的疾病的动物中的免疫性的量。如本领域的技术人员将了解，治疗有效量将有所不同且在个案的基础上进行判定，在本申请中，不特别限制疫苗佐剂和疫苗抗原的剂量，并且根据给药方法、受试者、受试者的年龄、剂型、给药路线等适当地选择。一种优选的实施方式中，所述的人参酸性多糖与疫苗抗原的用量比为：
例如，所述用量比可以为0.005、0.05、0.5、1、1.25、、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、160、166.7、170、180、200、500、1000、10000(μg/IU或μg:μg)，优选地，所述用量比为：
优选地，所述用量比为1.25～125(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为1.25～50(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为1.25～25(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为1.25～12.5(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为1.25～10(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为1.25～5(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为5～166.7(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为5～125(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为5～50(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为5～25(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为5～12.5(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为5～10(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为10～166.7(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为10～125(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为10～50(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为10～25(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为10～12.5(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为12.5～166.7(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为12.5～125(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为12.5～50(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为12.5～25(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为25～166.7(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为25～125(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为25～50(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为12.5～25(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为50～166.7(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为50～125(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为125～166.7(μg/IU或μg:μg)。
一种优选的实施方式，本申请提供的疫苗组合物用于流感疫苗时，所述人参酸性多糖与疫苗抗原的用量比为：
例如可以为17(μg:μg)、20(μg:μg)、25(μg:μg)、30(μg:μg)、35(μg:μg)、40(μg:μg)、45(μg:μg)、50(μg:μg)、55(μg:μg)、60(μg:μg)、65(μg:μg)、70(μg:μg)、75(μg:μg)、80(μg:μg)、90(μg:μg)、100(μg:μg)、110(μg:μg)、120(μg:μg)、130(μg:μg)、140(μg:μg)、150(μg:μg)、160(μg:μg)，具有更佳的效果。
一种优选的实施方式，本申请提供的疫苗组合物用于甲肝疫苗时，所述人参酸性多糖与疫苗抗原的用量比为：
例如可以为6(μg:IU)、7(μg:IU)、8(μg:IU)、9(μg:IU)、10(μg:IU)、15(μg:IU)、20(μg:IU)、25(μg:IU)、30(μg:IU)、35(μg:IU)、40(μg:IU)、45(μg:IU)、49(μg:IU)，具有更佳的效果。
一种优选的实施方式，本申请提供的疫苗组合物用于手足口疫苗时，所述人参酸性多糖与疫苗抗原的用量比为：
例如可以为1.5(μg:IU)、2(μg:IU)、2.5(μg:IU)、3(μg:IU)、4(μg:IU)、5(μg:IU)、6(μg:IU)、7(μg:IU)、8(μg:IU)、9(μg:IU)、10(μg:IU)、15(μg:IU)、16(μg:IU)、17(μg:IU)、18(μg:IU)、19(μg:IU)、20(μg:IU)、21(μg:IU)、22(μg:IU)、23(μg:IU)、24(μg:IU)，具有更佳的效果。
一种优选的实施方式，本申请提供的疫苗组合物用于HPV疫苗时，所述人参酸性多糖与疫苗抗原的用量比为：
例如可以为13(μg:μg)、14(μg:μg)、15(μg:μg)、16(μg:μg)、17(μg:μg)、18(μg:μg)、19(μg:μg)、20(μg:μg)、25(μg:μg)、30(μg:μg)、35(μg:μg)、40(μg:μg)、50(μg:μg)、60(μg:μg)、70(μg:μg)、80(μg:μg)、90(μg:μg)、100(μg:μg)、110(μg:μg)、120(μg:μg)、121(μg:μg)、124(μg:μg)，具有更佳的效果。
一种优选的实施方式，本申请提供的疫苗组合物用于新型冠状病毒疫苗，所述人参酸性多糖与疫苗抗原的用量比为：
例如可以为11(μg:μg)、12(μg:μg)、13(μg:μg)、14(μg:μg)、15(μg:μg)、16(μg:μg)、17(μg:μg)、18(μg:μg)、19(μg:μg)、20(μg:μg)、25(μg:μg)、30(μg:μg)、35(μg:μg)、40(μg:μg)、45(μg:μg)、46(μg:μg)、47(μg:μg)、48(μg:μg)、49(μg:μg)，具有更佳的效果。
本领域的技术人员将易于认识到，治疗剂量及治疗长度可依待治疗患者的种类、重量及病症、其对疫苗组合物的个体反应及所选择的特定给药途径的不同而发生改变。在一些情况下，低于前述范围的下限的剂量水平可以是治疗有效的，而在其它情形下，可采用仍然较大的剂量而不引起任何有害副作用，其条件为，将此等较大剂量首先分为数个小剂量以在一天内给药。无论何时可能发生继发应激或曝露，认为激发剂量是理想的。
本申请的疫苗组合中的疫苗佐剂和抗原或编码所述抗原的DNA可以共同包含在一个组合物中并且可以在单独的组合物中配制，在单独的组合物中配制时，疫苗佐剂和抗原或编码所述抗原的DNA的给药路线可以相同或不同。在本申请中，疫苗佐剂和抗原或编码所述抗原的DNA可以同时给予或有时间差异地给予，即，疫苗佐剂和抗原或编码所述抗原的DNA可以同时或分开给予(例如，疫苗佐剂在给予疫苗抗原之前或之后给予)。疫苗佐剂和抗原或编码所述抗原的DNA可以作为包含它们的试剂盒提供。但是从降低患者负担的角度，优选疫苗佐剂和抗原或编码所述抗原的DNA包含在一个组合物中，使得在给药时可以同时给予。无论是共给药或同时给药，所述疫苗组合物的给药模式均可为任何适当途径，该途径无论是在共给药或同时给药情况下，均将所述疫苗组合物输送至宿主。
一种优选的实施方式中，本申请的疫苗佐剂或者疫苗组合物还包括药用辅料和第二疫苗佐剂。
所述药用辅料如前所述。
本申请的疫苗佐剂可作为疫苗制剂的一部份给药，其任选含有额外的第二疫苗佐剂。所述第二疫苗佐剂是不同于本申请的人参酸性多糖佐剂的其他佐剂，可以是一种或者两种以上，适当的第二疫苗佐剂的实施例包括那些本领域中已知的佐剂，
本申请的疫苗佐剂或者疫苗组合物可进一步包含一种或多种抗氧化剂，所述一种或多种抗氧化剂选自由以下各物组成的组：亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、偏亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、次硫酸甲酪钠、L-抗坏血酸、异抗坏血酸、乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、单硫代丙三醇、琉基乙酸、硫代乳酸、硫脉、二硫苏糖醇、二硫赤鲜醇、谷胱甘肤、抗坏血酸棕桐酸酣、丁基化胫基苗香醒、丁基化轻基甲苯、去甲二氢愈创木酸、没食子酸丙酣、a-生育酚，以及其混合物。
本申请的疫苗佐剂或者疫苗组合物可进一步包含一种或多种防腐剂，适当防腐剂的实例包括(但不限于)：苯扎氯绥、爷索氯绥、苯甲酸、爷醇、对轻基苯甲酸甲酣、对轻基苯甲酸乙酣、对轻基苯甲酸丙酣、对轻基苯甲酸丁酣、苯甲酸钠、苯酚，以及其混合物。如本领域的技术人员将了解，防腐剂的存在与否将依抗原而定。举例来说，若抗原是活细菌抗原，则无需添加防腐剂。
本申请的疫苗佐剂或者疫苗组合物可用于预防或治疗人类或动物中由病原体、癌细胞或过敏原引起的疾病，其通过对易感于该疾病的人或动物给予治疗有效量的佐剂组合物或疫苗。
根据本申请，该病原体可为任何病原体，其包括(但不限于)：细茵、原生动物、蠕虫、病毒及真菌。通过所述病原体引起的动物中的疾病包括(但不限于)：牛呼吸道疾病、猪呼吸道疾病、肺炎、巴斯德菌病、球虫病、无形体病、及感染性角膜炎。
根据本申请，该癌细胞可为本领域中任何类型的癌细胞。根据本申请，该过敏原可为本领域中已知的任何过敏原。
例如，本申请的疫苗组合物可以是狂犬疫苗、流感疫苗、乙肝疫苗、甲肝疫苗、丙肝疫苗、手足口疫苗、HPV疫苗或新型冠状病毒疫苗等。
例如，本申请的疫苗组合物的疫苗类型可以为灭活病毒疫苗、减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、DNA疫苗或多肽疫苗等。
本申请的疫苗佐剂或者疫苗组合物可用于保护或治疗人类和诸如牲畜及家畜动物的非人类动物，包括(但不限于)牛、马、绵羊、猪、山羊、兔、猫、狗及需要治疗的其它哺乳动物。优选的，本申请的疫苗佐剂或者疫苗组合物用于保护或治疗人类。如本领域的技术人员所了解，可基于待保护或治疗的患者来选择待给药的本申请的疫苗佐剂或者疫苗组合物。
本申请的组合物可以通过通用方法来制备，其中加入一种或多种药学上可接受的稀释剂或载体，例如，呈口服药物形式，例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、锭剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂等，或肠胃外药物，例如外用药物、栓剂、注射剂、滴眼剂、鼻内剂、经肺剂等。制剂的优选的实例包括可注射的或鼻内溶液剂，或通过冻干所述溶液剂而制备的冻干的制剂。
可注射的溶液剂的实例包括包含水性溶液和油质组合物的乳剂和脂质体，例如疫苗佐剂和抗原或编码所述抗原的DNA溶解或分散在水中的水性溶液剂制剂或水性混悬剂制剂，或疫苗佐剂和抗原或编码所述抗原的DNA溶解或分散在油中的油质溶液剂制剂或油质混悬剂制剂。
水性溶液剂、水性溶液剂制剂或水性混悬剂制剂的实例包括包含用于注射的蒸馏水并任选包含缓冲液、pH调节剂、稳定剂、等渗剂和/或乳化剂的水性溶液剂或水性混悬剂等。
本申请的疫苗佐剂或者疫苗组合物可通过经口、肌肉内、静脉内、皮下、眼内、肠胃外、局部、阴道内或直肠途径给予本申请的疫苗佐剂或者疫苗组合物。对于对牛、猪或其它家畜的给药，可以饲料或作为灌服组合物经口给药所述佐剂组合物或疫苗佐剂。一种优选的实施方式中，以经肌肉内、静脉内或皮下注射本申请的疫苗佐剂或者疫苗组合物。
本申请提供的人参酸性多糖疫苗佐剂，能显著地提高抗原免疫后的特异性抗体(或中和抗体)滴度，用于狂犬疫苗、流感疫苗、乙肝疫苗甲肝疫苗、丙肝疫苗、手足口疫苗、HPV疫苗、新型冠状病毒疫苗等疫苗中，可以有效地增强免疫应答活性，如本申请的实验结果显示，相对于现有技术中常用的疫苗佐剂，如铝盐疫苗佐剂，在同等实验条件下，人参酸性多糖佐剂对狂犬疫苗、流感疫苗、乙肝疫苗甲肝疫苗、丙肝疫苗、手足口疫苗、HPV疫苗、新型冠状病毒疫苗均能显著提升接种小鼠血液的中和抗体水平(P＜0.01)；对于有些疫苗，如乙肝疫苗等，实验小鼠体内的抗体水平具有更加显著的提高(P＜0.001)。
同时，本申请经过大量的试验，探索了使用不同剂量的人参多糖疫苗佐剂对疫苗的佐剂活性的影响，发现不同的剂量对于对佐剂活性的有一定影响，对于不同种类的疫苗也具有不一样的效果，经过多次尝试，也优化出了效果更好的人参多糖疫苗佐剂用量，以及，本申请对不同的疫苗进一步优化了其特定的更加优异的效果的疫苗佐剂用量，如本申请中实施例结果显示，对于流感疫苗，所述人参酸性多糖与疫苗抗原的用量比为：
时具有更佳的效果；对于甲肝疫苗时，所述人参酸性多糖与疫苗抗原的用量比为：
时具有更佳的效果；用于手足口疫苗时，所述人参酸性多糖与疫苗抗原的用量比为：
时具有更佳的效果；用于HPV疫苗时，所述人参酸性多糖与疫苗抗原的用量比为：
时具有更佳的效果；用于新型冠状病毒疫苗，所述人参酸性多糖与疫苗抗原的用量比为：
时具有更佳的效果。
实施例
实验材料
铝盐佐剂：禾大Croda公司生产
人参多糖的制备：
取干燥的人参根1kg粉碎至10-20目，加入8倍量水(g:mL)，沸水浴煮8h，过滤并收集滤液；向滤渣中继续加入10倍量水(g:mL)，沸水浴加热8h。合并两次滤液，6000rpm离心10min。取上清蒸干，向提取物加入中性蛋白酶(Neutrase，酶浓度800U/g提取物)，40℃培养3h，后以100℃灭活30min，将混合溶液以10000rpm离心，得到上清液，蒸干。
10倍体积的95％的乙醇低温浸泡2.0h。过滤，取滤渣，加2倍体积的蒸馏水溶解，沸水回流提取3次，每次1h，120目尼龙布过滤，合并提取液，浓缩至500mL，离心20分钟(5000rpm)，弃去沉淀。向上清液加入95％的乙醇至乙醇终浓度为90％，静置1h。离心20分钟(5000转/分钟)，收集沉淀，再向沉淀中加入400mL蒸馏水，再向上清液加入95％的乙醇至终浓度为80％，静置1h，离心20分钟(5000转/分钟)，室温静置过夜，收集沉淀。
次日，将沉淀依次用无水乙醇、95％乙醇洗涤两次。并冷冻干燥得人参粗多糖，将其配置成30％的水溶液，加入1000kDa透析袋进行透析，静置过夜。取透析袋内液体，向其中加入1/4体积的Sevag试剂，静置离心后除去凝胶状沉淀。重复上述操作5次，合并上清液，减压浓缩除去有机试剂，加入95％的乙醇至终浓度为80％，4℃静置过夜，离心，除上清。沉淀依次用95％乙醇、无水乙醇洗涤两次。冷冻干燥得人参多糖。
人参酸性多糖的制备：
称取50g上述制备的人参多糖，溶于500mL去离子水进行DEAE纤维素柱层析，具体步骤如下：
预处理：向柱管中加入用于防止气泡的蒸馏水，将DEAE填料加入柱管中，静置24小时；用0.5M的盐酸冲洗1个柱体积；再用超纯水平衡4个柱体积；
取人参总多糖，溶于蒸馏水中，以速度4mL/min上样，分别用水及0.3mol/L的NaCl溶液洗脱，流速设置为0.5mL/min。将洗脱液以苯酚硫酸法检测A490，收集吸收峰，蒸馏水透析72h，冷冻干燥。得到人参酸性多糖，洗脱曲线见图1。
人参酸性多糖的含量测定
应用苯酚-硫酸法测定人参酸性多糖的含量。以不同浓度的葡萄糖为横坐标，以在OD490nm的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，如图2所示，根据葡萄糖标准曲线和样品吸光度计算多糖含量。人参酸性多糖的含量为97.3％。
人参酸性多糖中蛋白质含量测定
人参酸性多糖中蛋白质含量的测定采用Bradford法。以牛血清白蛋白为横坐标，以在OD595nm为纵坐标，绘制标准曲线，如图3所示，根据牛血清白蛋白标准曲线和样品吸光度计算蛋白质含量。人参酸性多糖的蛋白质含量为0.3％。
实施例1：人参酸性多糖(GAPS)对狂犬疫苗的免疫佐剂活性
二倍体灭活狂犬疫苗：辽宁成大生物股份有限公司生产。
动物：雌性C57BL/6小鼠，6-8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
1、制备疫苗组合物：
高剂量GPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参多糖(GPS)和二倍体灭活狂犬疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有2500μg的GPS及2.5IU的狂犬疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
高剂量GAPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参酸性多糖(GAPS)和二倍体灭活狂犬疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有2500μg的GAPS及2.5IU的狂犬疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
低剂量GPS佐剂疫苗组合物：分别量取GPS和二倍体灭活狂犬疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的GPS及2.5IU的狂犬疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
低剂量GAPS佐剂疫苗组合物：分别量取GAPS和二倍体灭活狂犬疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的GAPS及2.5IU的狂犬疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
阳性对照组-铝盐佐剂疫苗组合物：分别量取铝盐和二倍体灭活狂犬疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的铝盐及2.5IU的狂犬疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
阴性对照组-不含佐剂的疫苗：二倍体灭活狂犬疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含2.5IU的狂犬疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
2、免疫方案：
小鼠随机分成6组，每组10只。肌肉注射上述制备的疫苗组合物0.1ml/只，初次免疫一周后，进行第二次免疫。第二次免疫后14天采集各组小鼠血清，每份血清分别通过RFFIT、ELISA法检测其中的中和抗体及IgG特异性抗体效价。
实验分组及剂量：
3、结果：
如图4、图5所示，与阴性对照组相比，铝盐及高、低剂量GAPS均能提升狂犬疫苗接种小鼠体内的IgG抗体水平及中和抗体水平。与铝盐阳性对照组相比，高、低剂量的GAPS(250μg、25μg)均能显著提升狂犬疫苗小鼠的IgG抗体水平及中和抗体水平(P<0.01)。
实施例2：人参酸性多糖(GAPS)对流感疫苗的免疫佐剂活性
流感疫苗：辽宁成大生物股份有限公司生产。
动物：雌性C57BL/6小鼠，6-8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
1、制备疫苗组合物：
高剂量GPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参多糖(GPS)和流感疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有2500μg的GPS及15μg的流感疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
高剂量GAPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参酸性多糖(GAPS)和流感疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有2500μg的GPS及15μg的流感疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
低剂量GPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参多糖(GPS)和流感疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的GPS及15μg的流感疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
低剂量GAPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参酸性多糖(GAPS)和流感疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的GPS及15μg的流感疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
阳性对照组-铝盐佐剂疫苗组合物：分别量取铝盐和流感疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的铝盐及15μg的流感疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
阴性对照组-不含佐剂的疫苗：流感疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含15μg的流感疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
2、免疫方案：
小鼠随机分成6组，每组10只。肌肉注射上述组合物0.1ml/只，初次免疫1周后，进行第2次免疫。第2次免疫后的第14天，采集每只小鼠的血液，并通过血凝抑制实验检测小鼠血清流感疫苗的中和抗体水平。
实验分组与剂量：
3、结果：
如图6所示，与阴性对照组相比，低、高剂量的GAPS均能显著提高流感疫苗接种小鼠体内的抗体水平(P<0.01)；与阳性对照组(铝盐佐剂)相比，低、高剂量GAPS均能显著提升流感疫苗接种小鼠血液的中和抗体水平(P＜0.01)。
实施例3：不同剂量的人参酸性多糖(GAPS)对流感疫苗的免疫佐剂活性1、制备疫苗组合物：分别量取GAPS和流感疫苗适量，以生理盐水溶解，配制为五份组合物溶液分别为GAPS佐剂组1、GAPS佐剂组2、GAPS佐剂组3、GAPS佐剂组4、GAPS佐剂组5，使每组中每毫升溶液中分别含有50、250、1250、2500、5000μg的GAPS及15μg的流感疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
此时，每组疫苗组合物中GAPS佐剂与流感疫苗之比分别为3.3、16.7、83.3、166.7、333.3(μg:μg)。
阳性对照组-铝盐佐剂疫苗组合物：分别量取铝盐和流感疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的铝盐及15μg的流感疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
阴性对照组-不含佐剂的疫苗：流感疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含15μg的流感疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
2、免疫方案：
小鼠随机分成7组，每组10只。肌肉注射上述组合物0.1ml/只，初次免疫1周后，进行第2次免疫。第2次免疫后的第14天，采集每只小鼠的血液，并通过血凝抑制实验检测小鼠血清流感疫苗的中和抗体水平。
实验分组与剂量：
3、结果：
如图7所示，使用不同剂量的GAPS作为佐剂给药，可发现，对于流感疫苗，GAPS佐剂组2、3、4、5小鼠体内抗体水平显著高于阴性对照组及阳性对照组。但GAPS佐剂组5小鼠体内抗体水平显著低于佐剂组4，且对于多糖的用量更大。GAPS佐剂组1小鼠体内抗体水平与阳性对照组及阴性对照组无显著差异。
实施例4：人参酸性多糖(GAPS)对乙肝疫苗的免疫佐剂活性
乙肝疫苗：辽宁成大生物股份有限公司生产。
动物：雌性C57BL/6小鼠，6-8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
1、制备疫苗组合物：
高剂量GPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参多糖(GPS)和乙肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有2500μg的GPS及25μg的乙肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
高剂量GAPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参酸性多糖(GAPS)和乙肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有2500μg的GPS及25g的乙肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
低剂量GPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参多糖(GPS)和乙肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的GPS及25μg的乙肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
低剂量GAPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参酸性多糖(GAPS)和乙肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的GPS及25μg的乙肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
阳性对照组-铝盐佐剂疫苗组合物：分别量取铝盐和乙肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的铝盐及25μg的乙肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
阴性对照组-不含佐剂的疫苗：乙肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含25μg的乙肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
2、免疫方案：
小鼠随机分成6组，每组10只。肌肉注射上述组合物0.1ml/只，初次免疫2周后，进行第2次免疫。第2次免疫后第14天，采集小鼠血液，并通过ELISA实验检测小鼠血清乙肝抗体水平。
实验分组及剂量：
GPS高剂量佐剂组：2.5μg乙肝疫苗+250μg GPS/只；
GAPS高剂量佐剂组：2.5μg乙肝疫苗+250μg GAPS/只；
GPS低剂量佐剂组：2.5μg乙肝疫苗+25μg GPS/只；
GAPS低剂量佐剂组：2.5μg乙肝疫苗+25μg GAPS/只；
阳性对照组：2.5μg乙肝疫苗+25μg铝盐佐剂/只；
阴性对照组：2.5μg乙肝疫苗/只。
3、结果：
如图8所示，与阴性对照组相比，铝盐及高、低剂量GAPS均能显著提高乙肝疫苗免疫小鼠体内的抗体水平(P<0.001)；与阳性对照组(铝盐佐剂)相比，高剂量GAPS(250μg/只)能显著提升乙肝疫苗免疫小鼠体内的抗体水平(P＜0.001)，低剂量GAPS(25μg/只)对乙肝疫苗的佐剂活性与铝盐的效果相似。
实施例5：人参酸性多糖(GAPS)对甲肝疫苗的佐剂活性
二倍体甲肝疫苗：辽宁成大生物股份有限公司生产。
动物：雌性C57BL/6小鼠，6-8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
1、制备疫苗组合物：
高剂量GPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参多糖(GPS)和甲肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有2500μg的GPS及50IU的甲肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
高剂量GAPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参酸性多糖(GAPS)和甲肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有2500μg的GPS及50IU的甲肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
低剂量GPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参多糖(GPS)和甲肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的GPS及50IU的甲肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
低剂量GAPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参酸性多糖(GAPS)和甲肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的GPS及50IU的甲肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
阳性对照组-铝盐佐剂疫苗组合物：分别量取铝盐和甲肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的铝盐及50IU的甲肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
阴性对照组-不含佐剂的疫苗：流感疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含50IU的甲肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
2、免疫方案：
小鼠随机分成4组，每组10只。肌肉注射上述组合物0.1ml/只，初次免疫2周后，进行第二次免疫，第二次免疫后的第14天采集各个小鼠的血液，并检测血清中中和抗体水平。
实验分组及剂量：
3、结果：
如图9所示，与阴性对照组相比，铝盐及高、低剂量GAPS均能显著提高甲肝疫苗免疫小鼠体内的抗体水平(P<0.05)；与阳性对照组(铝盐佐剂)相比，低、高剂量GAPS均能显著提升甲肝疫苗免疫小鼠体内的抗体水平(P＜0.05)；。
实施例6：不同剂量的人参酸性多糖(GAPS)对甲肝疫苗的佐剂活性
1、制备疫苗组合物：
分别量取GAPS和甲肝疫苗适量，以生理盐水溶解，配制为五份组合物溶液分别为GAPS佐剂组1、GAPS佐剂组2、GAPS佐剂组3、GAPS佐剂组4、GAPS佐剂组5，使每组每毫升溶液中分别含有125、250、1250、2500、5000μg的GAPS及50IU的甲肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。此时，每组疫苗组合物中GAPS佐剂与甲肝疫苗之比分别为2.5、5、25、50、100(μg:IU)。
阳性对照组-铝盐佐剂疫苗组合物：分别量取铝盐和甲肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的铝盐及50IU的甲肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
阴性对照组-不含佐剂的疫苗：流感疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含50IU的甲肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
2、免疫方案：
小鼠随机分成7组，每组10只。肌肉注射上述组合物0.1ml/只，初次免疫1周后，进行第2次免疫。第2次免疫后的第14天，采集每只小鼠的血液，并通过血凝抑制实验检测小鼠血清流感疫苗的中和抗体水平。
实验分组及剂量：
3、结果：
如图10所示，使用不同剂量的GAPS作为佐剂给药，可发现，对于甲肝疫苗，GAPS佐剂组2、3、4小鼠体内抗体水平显著高于阴性对照组及阳性对照组。与阳性对照组相比，GAPS佐剂组5小鼠体内抗体水平虽有一定提升，但其效果弱于佐剂组4，且对于多糖的用量更大。
实施例7：人参酸性多糖(GAPS)对丙肝疫苗的佐剂活性
丙肝疫苗：辽宁成大生物股份有限公司生产。
动物：雌性C57BL/6小鼠，6-8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
1、制备疫苗组合物：
高剂量GPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参多糖(GPS)和丙肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有2500μg的GPS及50μg的丙肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
高剂量GAPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参酸性多糖(GAPS)和丙肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有2500μg的GPS及50μg的丙肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
低剂量GPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参多糖(GPS)和丙肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的GPS及50μg的丙肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
低剂量GAPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参酸性多糖(GAPS)和丙肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的GPS及50μg的丙肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
阳性对照组-铝盐佐剂疫苗组合物：分别量取铝盐和丙肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的铝盐及50μg的丙肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
阴性对照组-不含佐剂的疫苗：丙肝疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含50μg的丙肝疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
2、免疫方案：
小鼠随机分成6组，每组10只。肌肉注射上述组合物0.1ml/只，初次免疫2周后，进行第二次免疫，第二次免疫后的第14天采集各个小鼠的血液，并检测血清中特异性抗体IgG的水平。
实验分组：
3、结果：
如图11所示，与阴性对照组相比，铝盐及高、低剂量GAPS均能显著提高丙肝疫苗免疫小鼠体内的抗体水平(P<0.001)；与阳性对照组(铝盐佐剂)相比，高、低剂量GAPS均能显著提升丙肝疫苗免疫小鼠体内的抗体水平(P＜0.01)。
实施例8：人参酸性多糖(GAPS)对手足口疫苗的佐剂活性
手足口疫苗：辽宁成大生物股份有限公司生产。
动物：雌性C57BL/6小鼠，6-8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
1、制备疫苗组合物：
高剂量GPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参多糖(GPS)和手足口疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有2500μg的GPS及200IU的手足口疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
高剂量GAPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参酸性多糖(GAPS)和手足口疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有2500μg的GPS及200IU的手足口疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
低剂量GPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参多糖(GPS)和手足口疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的GPS及200IU的手足口疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
低剂量GAPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参酸性多糖(GAPS)和手足口疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的GPS及200IU的手足口疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
阳性对照组-铝盐佐剂疫苗组合物：分别量取铝盐和手足口疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的铝盐及200IU的手足口疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
阴性对照组-不含佐剂的疫苗：手足口疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含200IU的手足口疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
2、免疫方案：小鼠随机分成6组，每组10只。肌肉注射上述组合物0.1ml/只，初次免疫2周后，进行第二次免疫，第二次免疫后的第14天采集各个小鼠的血液，并检测血清中和抗体及特异性抗体IgG的水平。
实验分组：
3、结果：
如图12、图13所示，与阴性对照组相比，铝盐及高、低剂量GAPS均能显著提高手足口疫苗免疫小鼠体内的抗体水平(P<0.05)；与铝盐阳性对照组相比，高、低剂量GAPS均能显著提升手足口疫苗接种小鼠体内中和抗体、IgG抗体水平(P＜0.01)。
实施例9：不同剂量的人参酸性多糖(GAPS)对手足口疫苗的佐剂活性
1、制备疫苗组合物：分别量取GPS和手足口疫苗适量，以生理盐水溶解，配制为五份组合物溶液分别为GAPS佐剂组1、GAPS佐剂组2、GAPS佐剂组3、GAPS佐剂组4、GAPS佐剂组5，使每组每毫升溶液中分别含有125、250、1250、2500、5000μg的GPS及200IU的手足口疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。此时，组合物中GPS佐剂与手足口疫苗之比分别为0.625、1.25、6.25、12.5、25(μg:IU)。
阳性对照组-铝盐佐剂疫苗组合物：分别量取铝盐和手足口疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的铝盐及200IU的手足口疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
阴性对照组-不含佐剂的疫苗：手足口疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含200IU的手足口疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
2、免疫方案：小鼠随机分成7组，每组10只。肌肉注射上述组合物0.1ml/只，初次免疫2周后，进行第二次免疫，第二次免疫后的第14天采集各个小鼠的血液，并检测血清中和抗体水平。
实验分组及剂量：
3、结果：
如图14所示，使用不同剂量的GAPS作为佐剂给药，可发现，对于手足口疫苗，GAPS佐剂组2、3、4、5小鼠体内抗体水平显著高于阴性对照组及阳性对照组。与阴性对照组相比，GAPS佐剂组1小鼠体内抗体水平虽有一定提升，但显著低于佐剂组2～5。
实施例10:人参酸性多糖(GAPS)对HPV疫苗的佐剂活性
HPV疫苗：辽宁成大生物股份有限公司生产。
动物：雌性C57BL/6小鼠，6-8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
1、制备疫苗组合物：
高剂量GPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参多糖(GPS)和HPV疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有2500μg的GPS及20μg的HPV疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
高剂量GAPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参酸性多糖(GAPS)和HPV疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有2500μg的GPS及20μg的HPV疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
低剂量GPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参多糖(GPS)和HPV疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的GPS及20μg的HPV疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
低剂量GAPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参酸性多糖(GAPS)和HPV疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的GPS及20μg的HPV疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
阳性对照组-铝盐佐剂疫苗组合物：分别量取铝盐和HPV疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的铝盐及20μg的HPV疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
阴性对照组-不含佐剂的疫苗：HPV疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含20μg的HPV疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
2、免疫方案：小鼠随机分成6组，每组10只。肌肉注射上述组合物0.1ml/只，初次免疫2周后，进行第二次免疫，第二次免疫后的第14天采集各个小鼠的血液，并检测血清中特异性抗体IgG的水平。
实验分组及剂量：
3、结果：
如图15所示，与阴性对照组相比，铝盐及高、低剂量GAPS均能显著提高HPV疫苗免疫小鼠体内的抗体水平(P<0.001)；与铝盐阳性对照组相比，高、低剂量GAPS能显著提升HPV疫苗接种小鼠体内IgG抗体水平(P＜0.05)。
实施例11：不同剂量的人参酸性多糖(GAPS)对HPV疫苗的佐剂活性
1、制备疫苗组合物：分别量取GAPS和HPV疫苗适量，以生理盐水溶解，配制为五份组合物溶液分别为GAPS佐剂组1、GAPS佐剂组2、GAPS佐剂组3、GAPS佐剂组4、GAPS佐剂组5，使每组每毫升溶液中分别含有125、250、1250、2500、5000μg的GAPS及20μg的HPV疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。此时，每组疫苗组合物中GAPS佐剂与HPV疫苗之比分别为6.25、12.5、62.5、125、250(μg:μg)。
阳性对照组-铝盐佐剂疫苗组合物：分别量取铝盐和HPV疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的铝盐及20μg的HPV疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
阴性对照组-不含佐剂的疫苗：HPV疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含20μg的HPV疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
2、免疫方案：小鼠随机分成7组，每组10只。肌肉注射上述组合物0.1ml/只，初次免疫2周后，进行第二次免疫，第二次免疫后的第14天采集各个小鼠的血液，并检测血清中特异性抗体IgG的水平。
实验分组及剂量：
结果：
如图16所示，使用不同剂量的GAPS作为佐剂给药，可发现，对于HPV疫苗，GAPS佐剂组2、3、4小鼠体内抗体水平显著高于阴性对照组及阳性对照组。GAPS佐剂组1、5小鼠体内抗体水平虽有一定提升，但显著低于佐剂组2～4，且与阳性对照组无显著差异。
实施例12:人参酸性多糖(GAPS)对新型冠状病毒疫苗(新冠疫苗)的佐剂活性
新冠疫苗：辽宁成大生物股份有限公司生产。
动物：雌性C57BL/6小鼠，6-8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
1、制备疫苗组合物：
高剂量GPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参多糖(GPS)和新型冠状病毒疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有5000μg的GPS及50μg的新冠疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
高剂量GAPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参酸性多糖(GAPS)和新型冠状病毒疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有5000μg的GPS及50μg的新冠疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
低剂量GPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参多糖(GPS)和新型冠状病毒疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有500μg的GPS及50μg的新冠疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
低剂量GAPS佐剂疫苗组合物：分别量取人参酸性多糖(GAPS)和新型冠状病毒疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有500μg的GPS及50μg的新冠疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
阳性对照组-铝盐佐剂疫苗组合物：分别量取铝盐和新型冠状病毒疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有500μg的铝盐及50μg的新冠疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
阴性对照组-不含佐剂的疫苗：新型冠状病毒疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含50μg的新冠疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
2、免疫方案：小鼠随机分成6组，每组10只。肌肉注射上述组合物0.1ml/只，初次免疫2周后，进行第二次免疫，第二次免疫后的第14天采集各个小鼠的血液，并检测血清中特异性抗体IgG的水平。
实验分组及剂量：
GPS高剂量组：5μg新冠疫苗+500μg GPS/只；
GAPS高剂量组：5μg新冠疫苗+500μg GAPS/只；
GPS低剂量组：5μg新冠疫苗+50μg GPS/只；
GAPS低剂量组：5μg新冠疫苗+50μg GAPS/只；
阳性对照组：5μg新冠疫苗+50μg铝盐佐剂/只；
阴性对照组：5μg新冠疫苗/只。
3、结果：
如图17所示，与阴性对照组相比，铝盐及高、低剂量GAPS均能显著提高新冠疫苗免疫小鼠体内的抗体水平(P<0.01)；与铝盐阳性对照组相比，高、低剂量GAPS能显著提升新冠疫苗接种小鼠体内IgG抗体水平(P＜0.05)；。
实施例13：不同剂量的人参酸性多糖(GAPS)对新型冠状病毒疫苗(新冠疫苗)的佐剂活性
1、制备疫苗组合物：分别量取GPS和新冠疫苗适量，以生理盐水溶解，配制为五份组合物溶液分别为GAPS佐剂组1、GAPS佐剂组2、GAPS佐剂组3、GAPS佐剂组4、GAPS佐剂组5，使每组每毫升溶液中分别含有250、500、2500、5000、10000μg的GPS及50μg的新冠疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。此时，每组疫苗组合物中GPS佐剂与新冠疫苗之比分别为6.25、12.5、62.5、125、250(μg:μg)。
阳性对照组-铝盐佐剂疫苗组合物：分别量取铝盐和新冠疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含有250μg的铝盐及50μg的新冠疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
阴性对照组-不含佐剂的疫苗：新型冠状病毒疫苗适量，以生理盐水溶解，使每毫升溶液中含50μg的新冠疫苗，以0.22μm微孔滤膜滤过，无菌分装。
2、免疫方案：小鼠随机分成7组，每组10只。肌肉注射上述组合物0.1ml/只，初次免疫2周后，进行第二次免疫，第二次免疫后的第14天采集各个小鼠的血液，并检测血清中特异性抗体IgG的水平。
实验分组及剂量：
3、结果：
如图18所示，使用不同剂量的GAPS作为佐剂给药，可发现，对于新冠疫苗，GAPS佐剂组2、3、4小鼠体内抗体水平显著高于阴性对照组及阳性对照组。与阴性对照组相比，GAPS佐剂组1、5小鼠体内抗体水平虽有一定提升，但与阳性对照组无显著差异。
尽管以上结合对本申请的实施方案进行了描述，但本申请并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本申请权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本申请保护之列。
Claims (13)
1.一种疫苗佐剂，其特征在于，包括人参酸性多糖(GAPS)。
2.根据权利要求1所述的疫苗佐剂，其特征在于，还包括生理盐水或疫苗注射用水或药用辅料。
3.根据权利要求1或2所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述人参酸性多糖是由人参提取得到的。
4.根据权利要求3所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述提取过程包括，
取人参，提取人参总多糖，
将提取的人参总多糖，溶于去离子水，
进行柱层析后用洗脱液进行洗脱，
将洗脱液用蒸馏水透析，
冷冻干燥，获得到人参酸性多糖。
5.根据权利要求4所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述柱层析的柱为DEAE纤维素柱或大孔树脂柱，优选为DEAE纤维素柱，进一步优选所述柱层析以2～8mL/min上样。
6.根据权利要求4或5所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述洗脱液为水和碱溶液、硼砂溶液或盐溶液，所述盐溶液优选为NaCl溶液，进一步优选所述洗脱液的浓度为0.3～0.7mol/L的，进一步优选所述洗脱流速为0.5～2mL/min。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述将洗脱液用蒸馏水透析之前还包括将洗脱液以苯酚硫酸法检测A490，收集吸收峰，然后进行透析，优选，所述透析时间为24～72小时。
8.一种疫苗组合物，其特征在于，包括权利要求1-7中任一项所述的疫苗佐剂和抗原或编码所述抗原的DNA。
9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，所述GAPS与抗原的用量比为：
(μg/IU或μg:μg)，优选地，所述用量比为：
(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为：
(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为：
(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为：
(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为：
(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为：
(μg/IU或μg:μg)；优选地，所述用量比为：
(μg/IU或μg:μg)。
10.根据权利要求8或9所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物还包括药用辅料和第二疫苗佐剂。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物为狂犬疫苗、流感疫苗、乙肝疫苗、甲肝疫苗、丙肝疫苗、手足口疫苗、HPV疫苗或新型冠状病毒疫苗。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗类型为灭活病毒疫苗、减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、DNA疫苗或多肽疫苗。
13.权利要求1-7中任一项所述的疫苗佐剂在制备疫苗制剂、疫苗组合物或抗体中的用途。
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