CN106798920A - 一种复合免疫佐剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种复合免疫佐剂，由以下重量百分含量的组分组成：鱼腥草多糖1.5‑3.5%，丙氨酸0.2%‑0.55%，银杏叶黄酮0.8‑2.2%，聚乙烯蓖麻油5‑8%，Span80 5‑8%，聚乙二醇2.5‑5%，角鲨烯6‑10%，注射用大豆油30‑35%，注射用水35‑50%，以上各组分的重量百分含量之和为100%。所述复合免疫佐剂安全有效，能有效地增强PRRSV疫苗的免疫刺激能力，适用于猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的免疫预防。

Description

一种复合免疫佐剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，涉及一种复合疫苗佐剂，特别是能特异性增强猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）灭活疫苗免疫刺激能力的复合疫苗佐剂。

背景技术

猪繁 殖与 呼吸 综合 征 ( Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的以母猪流产和仔猪呼吸障碍为主要特征的病毒性传染病, 并可引起严重的免疫抑制。 自从20世纪90年代以来，该病毒在全球范围内广泛传播，给世界养猪业造成了巨大的经济损失，成为全球规模化猪场的主要疫病之一 , 也是全球猪病控制上的一大难题。PRRSV是单股正链有囊膜的RNA病毒，属动脉炎病毒属。病毒基因组大约有15 Kb，编码9个开放阅读框，命名为 ORF1a、1b、2a、2b和3-7。 目前，PRRS在我国广泛流行, 由于缺乏有效的防治手段, 该病在国内愈演愈烈。2006年夏季, 我国十多个省市的一些猪场暴发一种以高热、高发病率和高死亡率为特 征的传染病, 已经证实其主要病原为在 Nsp2上存在30个氨基酸不连续缺失的 PRRSV变异株。经典的病毒疫苗是分离病毒并通过致弱研制弱毒疫苗，或者通过病毒灭活并加入适当佐剂研制灭活疫苗。但对 PRRS来说，传统的弱毒疫苗和灭活疫苗均不能产生很好的免疫保护。为了研制更安全、高效的疫苗，中外学者开展了DNA、 重组多肽和合成肽疫苗等一系列研究。DNA疫苗免疫后能够产生抗体和细胞免疫应答，在减轻病毒血症和呼吸道症状方面有一定作用，而重组多肽和合成肽疫苗效果较差。

佐剂是疫苗的一种添加剂，当它先于抗原或与抗原混合注入机体后，能够增强机体对抗原的免疫应答或者改变免疫反应的类型，属于非特异性的免疫增强剂，而其本身无抗原性。理想的佐剂不仅能够增强免疫反应，而且能使机体获得最佳的保护性，免疫。经研究认为，佐剂主要包括免疫调节、细胞毒性T淋巴细胞诱导、抗原递呈、抗原靶向和储存等几种作用方式。通过以上几种方式，达到的使用目的有:（1）增强抗原的呈递，诱导细胞因子的释放；（2）通过抗原递送体系促进胃肠黏膜对疫苗的吸收，使疫苗能够黏膜接种；（3）阴性免疫调节，使机体持续产生抗体，从而降低抗原剂量，减少接种次数；（4）增强抗原的免疫原性，提高免疫应答的速度以及耐受性；（5）提高疫苗在免疫应答较弱者和免疫缺损者的免疫效力。国际上对于佐剂的分类尚无统一标准，根据化学成分的不同可以分为铝盐佐剂、蛋白类佐剂、核酸类佐剂、含脂类佐剂和混合佐剂等几类。

利用佐剂提高PRRS疫苗免疫效果是目前的研究热点。徐磊等人开展了短肽佐剂增强PRRSV弱毒疫苗免疫保护力的研究，结果表面，短肽佐剂配合CH-1R弱毒疫苗免疫可增强IFN-γ、IL-18介导的细胞免疫及IL-4介导的体液免疫、减轻攻毒后IFN-γ、IL-18介导的炎症反应和组织损伤,提高免疫保护力；在抵抗HP-PRRSV TJ-F5攻毒时,共同免疫组的免疫保护力明显高于单独免疫组。谢印乾等人开展了PRRS蜂胶佐剂灭活疫苗的免疫效力研究，研究表面，蜂胶佐剂可以更有效地刺激机体产生T淋巴细胞,提高细胞免疫水平，免疫后IFN-γ含量明显增多进一步证明了其对机体非特异性免疫能力的增强作用，蜂胶佐剂灭活疫苗是一种值得普及推广的新型疫苗，这为PRRS疫苗的研究提供了新的思路。朱善元等人（CN101940787A）将仙台病毒囊膜（HVJ-E）与PRRSV灭活苗共同免疫PRRSV阴性猪，同时设PBS对照组及PRRSV灭活苗组，与对照组相比，HVJ-E与PRRSV灭活苗免疫组能显著提高免疫猪的体液免疫和细胞免疫应答水平。免疫后，用PRRSV强毒株(JXA1)进行攻毒，结果表明，与对照组相比，HVJ-E与PRRSV灭活苗免疫组的临床表现及体重增加均优于对照组，且产生的病毒血症率、排毒率及病毒分布率均明显下降。目前, 这些佐剂仅部分用于商用的弱毒疫苗、自家灭活疫苗、DNA疫苗合成肽和重组肽疫苗研究 , 但是只有一少部分佐剂能提高疫苗的保护效应，目前在PRRSV疫苗免疫佐剂方面还有很大的发展空间。

发明内容

为解决现有专用于猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的免疫佐剂种类少/效果不一的技术问题，本发明旨在提供一种复合免疫佐剂，所述复合免疫佐剂安全有效，能有效地增强PRRSV疫苗的免疫刺激能力，适用于猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的免疫预防。同时本发明还提供所述复合免疫佐剂的制备方法。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种复合免疫佐剂，其特征在于，所述复合免疫佐剂由以下重量百分含量的组分组成：鱼腥草多糖 1.5-3.5%，丙氨酸0.2%-0.55%，银杏叶黄酮0.8-2.2%，聚乙烯蓖麻油 5-8%，Span80 5-8%，聚乙二醇 2.5-5%，角鲨烯6-10%，注射用大豆油 30-35%，注射用水35-50%，以上各组分的重量百分含量之和为100%。

所述复合免疫佐剂的制备方法包括如下步骤：

步骤一，按重量百分含量配比称取各原料；

步骤二，将称取的鱼腥草多糖和丙氨酸与注射用水混合，搅拌至其充分溶剂，得到水相；

步骤三，将称取的银杏叶黄酮与角鲨烯、注射用大豆油混合，搅拌均匀，得到油相；

步骤四，将称取的聚乙烯蓖麻油、Span80与聚乙二醇混合，然后加入步骤三所制得的油相，在650-700rpm的转速下搅拌3-5min，得到均匀的油相混合物；

步骤五，将步骤四制得的油相混合物在580-600rpm的转速下搅拌，边搅拌边以每分钟150-180微升的速度的速度滴加步骤二所制得的水相，待形成澄清透明的纳米乳后，改为每分钟600-800微升继续添加步骤二所制得的水相，直至水相全部滴加完成，即得到所述的复合免疫佐剂。

所述鱼腥草多糖是以干鱼腥草为原料，采用如下工艺制备得到：干鱼腥草原料→粉碎机粉碎→热水浸提→离心、抽滤→滤液→真空浓缩至原有体积的1/8醇沉过夜→离心分离、洗涤→真空干燥→鱼腥草多糖，具体工艺包括如下步骤：

步骤一，取干鱼腥草为原料，采用粉碎机将其粉碎至100-120目，得到鱼腥草粉末；

步骤二，将鱼腥草粉末与65-70℃的温水按照15：1-25：1的比例混合进行热水浸提，并保持提取温度在65-70℃，以30-50rpm的速度搅拌提取2-2.5小时，得到鱼腥草热水浸提物；

步骤三，将步骤二制得的鱼腥草浸提物在3000-4500rpm的转速下离心10min，去上清液进行抽滤得到滤液，将滤液真空浓缩至原有体积的1/8，并加入浓缩液体积4倍的无水乙醇，置于0-4℃条件下静置过夜，弃去漂浮物，而后在4000-5000rpm的转速下离心分离10min，得到沉淀，而后采用95%的乙醇洗涤沉淀2次，真空干燥，即得到鱼腥草多糖。

所述银杏叶黄酮可以购买市售的银杏叶黄酮产品，也可采用如下方法制备得到：银杏叶片粉末→以质量体积比1：25加60%乙醇水溶液→摇匀后微波(中高火，680 W)处理120s→60℃水浴浸提2小时→4000 r/min离心15 min→取上清液即得银杏叶黄酮。

优选地，所述复合免疫佐剂由以下重量百分含量的组分组成：鱼腥草多糖 2.5%，丙氨酸0.2%，银杏叶黄酮1.4%，聚乙烯蓖麻油 7%，Span80 7%，聚乙二醇 3.4%，角鲨烯8%，注射用大豆油 32%，注射用水38.5%。

优选地，所述复合免疫佐剂由以下重量百分含量的组分组成：鱼腥草多糖 1.5%，丙氨酸0.55%，银杏叶黄酮2.2%，聚乙烯蓖麻油 5%，Span80 8%，聚乙二醇5%，角鲨烯6%，注射用大豆油 34%，注射用水37.75%。

优选地，所述复合免疫佐剂由以下重量百分含量的组分组成：鱼腥草多糖 3.5%，丙氨酸0.25%，银杏叶黄酮1.2%，聚乙烯蓖麻油 8%，Span80 5%，聚乙二醇 3%，角鲨烯10%，注射用大豆油 30%，注射用水39.05%。

本发明还请求保护本发明所述的复合免疫佐剂在制备猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）疫苗中的应用，优选地，所述疫苗为PRRSV病毒灭活疫苗或者PRRSV减毒活疫苗。

本发明还请求保护一种猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）疫苗，其是由本发明所述的复合免疫佐剂与PRRSV灭活病毒组成。

基于以上技术方案，本发明具备如下有益效果：

本发明选取鱼腥草多糖、丙氨酸和银杏叶黄酮作为复合免疫佐剂的主要活性成分，且通过有效的提取方式获得了纯度较高的鱼腥草多糖，其中鱼腥草多糖获取自鱼腥草，鱼腥草具有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋的功效，鱼腥草粗多糖具有强的抗补体活性，能够有效地增强机体的免疫应答，在本发明中，其与银杏叶黄酮和丙氨酸联合使用，三者相辅相成，协同增效，有效地提高了机体的免疫应答水平，提高了免疫保护效果。

本发明中通过大量的试验对于复合佐剂的制备工艺进行了大量的优化，最终确定出合适的制备工艺参数，通过本发明的方法能够获得粒径均一性好、粒度分布集中的纳米乳，其在肌肉注射过程中能够有效地扩散，降低肌肉注射带来的不利影响。

总而言之，本发明提供的复合免疫佐剂能够显著地提高动物的免疫应答水平，增强动物的免疫保护效果，特别是有效提高PRRSV疫苗的免疫效果，其在猪相关疾病控制中具有重要的意义。

说明书附图说明

图1：鱼腥草多糖凝胶色谱图，峰1为鱼腥草多糖凝胶色谱图的主峰；峰2为溶液中存在的少量单糖成分形成的峰；峰3为溶剂峰。

图2：透射电镜观察结果：（A）实施例2复合佐剂透射电镜观察结果；（B）实施例5所记载的对照用复合佐剂A透射电镜观察结果。

图3：实施例2所制得的复合佐剂。

图4：复合佐剂肌肉注射局部解剖图：（A）实施例2的复合佐剂注射2天；（B）实施例2的复合佐剂注射10天；（C）实施例5对照用的复合佐剂A注射2天；（D）实施例5对照用的复合佐剂A注射10天。

具体实施方式：

实施例1：（1）鱼腥草多糖的制备

鱼腥草多糖是以干鱼腥草为原料，采用如下工艺制备得到：干鱼腥草原料→粉碎机粉碎→热水浸提→离心、抽滤→滤液→真空浓缩至原有体积的1/8醇沉过夜→离心分离、洗涤→真空干燥→鱼腥草多糖，具体工艺包括如下步骤：

步骤一，取干鱼腥草为原料，采用粉碎机将其粉碎至120目，得到鱼腥草粉末；

步骤二，将鱼腥草粉末与68℃的温水按照20：1的比例混合进行热水浸提，并保持提取温度在68℃，以40rpm的速度搅拌提取2.5小时，得到鱼腥草热水浸提物；

步骤三，将步骤二制得的鱼腥草浸提物在4000rpm的转速下离心10min，去上清液进行抽滤得到滤液，将滤液真空浓缩至原有体积的1/8，并加入浓缩液体积4倍的无水乙醇，置于0℃条件下静置过夜，弃去漂浮物，而后在4500rpm的转速下离心分离10min，得到沉淀，而后采用95%的乙醇洗涤沉淀2次，真空干燥，即得到鱼腥草多糖。

取鱼腥草多糖溶解，配制成2mg/mL的多糖溶液，采用高效凝胶渗透色谱法对鱼腥草多糖的均一性进行鉴定，结果参见说明书附图图1，由图1可知，该法获得多糖分子质量分布较为集中，有1个较大主峰。

（2）银杏叶黄酮的制备：银杏叶片粉末→以质量体积比1：25加60%乙醇水溶液→摇匀后微波(中高火，680 W)处理120s→60℃水浴浸提2小时→4000 r/min离心15 min→取上清液即得银杏叶黄酮。

实施例2：一种复合免疫佐剂，由以下重量百分含量的组分组成：鱼腥草多糖2.5%，丙氨酸0.2%，银杏叶黄酮1.4%，聚乙烯蓖麻油 7%，Span80 7%，聚乙二醇 3.4%，角鲨烯8%，注射用大豆油 32%，注射用水38.5%。

所述复合免疫佐剂的制备方法包括如下步骤：

步骤一，按重量百分含量配比称取各原料；

步骤二，将称取的鱼腥草多糖和丙氨酸与注射用水混合，搅拌至其充分溶剂，得到水相；

步骤三，将称取的银杏叶黄酮与角鲨烯、注射用大豆油混合，搅拌均匀，得到油相；

步骤四，将称取的聚乙烯蓖麻油、Span80与聚乙二醇混合，然后加入步骤三所制得的油相，在680rpm的转速下搅拌4min，得到均匀的油相混合物；

步骤五，将步骤四制得的油相混合物在590rpm的转速下搅拌，边搅拌边以每分钟165微升的速度的速度滴加步骤二所制得的水相，待形成澄清透明的纳米乳后，改为每分钟700微升继续添加步骤二所制得的水相，直至水相全部滴加完成，即得到所述的复合免疫佐剂。

实施例3：一种复合免疫佐剂，由以下重量百分含量的组分组成：鱼腥草多糖1.5%，丙氨酸0.55%，银杏叶黄酮2.2%，聚乙烯蓖麻油 5%，Span80 8%，聚乙二醇5%，角鲨烯6%，注射用大豆油 34%，注射用水37.75%。

所述复合免疫佐剂的制备方法包括如下步骤：

步骤一，按重量百分含量配比称取各原料；

步骤二，将称取的鱼腥草多糖和丙氨酸与注射用水混合，搅拌至其充分溶剂，得到水相；

步骤三，将称取的银杏叶黄酮与角鲨烯、注射用大豆油混合，搅拌均匀，得到油相；

步骤四，将称取的聚乙烯蓖麻油、Span80与聚乙二醇混合，然后加入步骤三所制得的油相，在650rpm的转速下搅拌5min，得到均匀的油相混合物；

步骤五，将步骤四制得的油相混合物在580rpm的转速下搅拌，边搅拌边以每分钟150微升的速度的速度滴加步骤二所制得的水相，待形成澄清透明的纳米乳后，改为每分钟800微升继续添加步骤二所制得的水相，直至水相全部滴加完成，即得到所述的复合免疫佐剂。

实施例4：一种复合免疫佐剂，由以下重量百分含量的组分组成：鱼腥草多糖3.5%，丙氨酸0.25%，银杏叶黄酮1.2%，聚乙烯蓖麻油 8%，Span80 5%，聚乙二醇 3%，角鲨烯10%，注射用大豆油 30%，注射用水39.05%。

所述复合免疫佐剂的制备方法包括如下步骤：

步骤一，按重量百分含量配比称取各原料；

步骤二，将称取的鱼腥草多糖和丙氨酸与注射用水混合，搅拌至其充分溶剂，得到水相；

步骤三，将称取的银杏叶黄酮与角鲨烯、注射用大豆油混合，搅拌均匀，得到油相；

步骤四，将称取的聚乙烯蓖麻油、Span80与聚乙二醇混合，然后加入步骤三所制得的油相，在700rpm的转速下搅拌3min，得到均匀的油相混合物；

步骤五，将步骤四制得的油相混合物在600rpm的转速下搅拌，边搅拌边以每分钟180微升的速度的速度滴加步骤二所制得的水相，待形成澄清透明的纳米乳后，改为每分钟600微升继续添加步骤二所制得的水相，直至水相全部滴加完成，即得到所述的复合免疫佐剂。

实施例5：以实施例2为比较对象，设计以下对照试验以验证组成及制备方法等对于复合佐剂的影响：

对照用复合免疫佐剂A，由以下重量百分含量的组分组成：鱼腥草多糖 2.5%，丙氨酸0.2%，银杏叶黄酮1.4%，聚乙烯蓖麻油 7%，Span80 7%，聚乙二醇 3.4%，角鲨烯5%，注射用大豆油 32%，注射用水41.5%。

所述复合免疫佐剂的制备方法包括如下步骤：

步骤一，按重量百分含量配比称取各原料；

步骤二，将称取的鱼腥草多糖和丙氨酸与注射用水混合，搅拌至其充分溶剂，得到水相；

步骤三，将称取的银杏叶黄酮与角鲨烯、注射用大豆油混合，搅拌均匀，得到油相；

步骤四，将称取的聚乙烯蓖麻油、Span80与聚乙二醇混合，然后加入步骤三所制得的油相，在680rpm的转速下搅拌4min，得到均匀的油相混合物；

步骤五，将步骤四制得的油相混合物在400rpm的转速下搅拌，边搅拌边以每分钟220微升的速度的速度滴加步骤二所制得的水相，待形成澄清透明的纳米乳后，继续以每分钟220微升继续添加步骤二所制得的水相，直至水相全部滴加完成，即得到所述的对照用复合免疫佐剂A。

透射电镜结果显示，实施例2所制得的复合佐剂为纳米乳液，其纳米乳的液滴呈球形，液滴大小均匀，分散性良好，见图2-A。粒度分析结果表明，复合蜂胶纳米乳平均粒径为13.25纳米；液滴大小均匀，PDI为0.176；粒径分布范围窄，基本呈正态分布。对照用复合免疫佐剂A所制得的复合佐剂也为纳米乳液，其纳米乳的液滴呈椭球形，液滴大小均匀性较差，分散性一般，见图2-B。粒度分析结果表明，复合蜂胶纳米乳平均粒径为14.52纳米；液滴大小均匀，PDI为0.325；粒径分布范围较宽，说明制备得到的粒子粒径存在一定的差异。由以上透射电镜结果可知，实施例2的方法所制得的复合佐剂的纳米乳粒子粒径更加均匀，且粒径分布更加集中。

另外，分别对实施例2的疫苗佐剂以及对照组复合佐剂A进行了肌肉刺激性试验，分别以家兔作为注射对象，分别采用实施例2、对照组复合佐剂A对家兔进行肌肉注射，观察2天和10天后注射部位的情况，具体结果参见图4。其中（A）和（B）分别为实施例2的复合佐剂注射2天和10天后的情况，注射部位未见肿胀、鼓包等炎症反应，肌肉颜色正常，无充血，水肿，变性坏死等现象；图（C）和（D）为对照组复合佐剂A注射2天和10天后的情况，在注射2天后，注射部位出现小范围肿胀，当其为10天时，注射部位出现较大的鼓包，采用针尖刺激鼓包部位，出现小范围的轻微出血斑，经多次充分试验，均表现出鼓包症状。可见，采用实施例2所述方法制备复合免疫佐剂明显优于对照用复合佐剂A，其对于肌肉基本无刺激，适合作为肌肉注射用免疫佐剂。

实施例6：毒性试验：分别对实施例1-3的复合佐剂进行了以下安全性实验：

（1）急性毒性试验

按照最大注射剂量的2倍灌胃后28 d内，20只实验小鼠均正常存活，未出现死亡现象，也没有出现中毒现象。观察期间小鼠进食量、被毛、体重均正常，与空白对照小鼠无差异，表明该复方佐剂经口实际无毒。

（2）肌肉刺激性试验

剖检部位试验组与对照组无明显区别，局部无充血、水肿、变性或坏死等现象，表明本发明的复合佐剂无肌肉刺激性。

（3）细胞毒性实验

不同浓度的复合佐剂稀释液对培养的 ST猪睾丸细胞形态有不同程度的影响。当复合佐剂采用MEN培养液稀释500倍以上时，与正常组相比， ST猪睾丸细胞的形态、数目及生长状态，无明显变化，对细胞的生长无显著影响，以上结果表明本发明的佐剂无细胞毒性。

实施例7：PRRS疫苗的制备

（1）高致病性PRRSV-GD株病毒抗原的制备

高致病性PRRSV-GD株的制备：高致病性PRRSV-GD株由中国兽医药品监察所菌种保藏中心赠送，将毒种用MEM培养基(Invitrogen公司)作10倍稀释，按5％体积接种于MARC-145细胞培养，37℃吸附30分钟，加入含4％犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液，37℃培养4日，冻融2～3次，收获病毒，病毒滴度为10^7.2TCID₅₀/ml；而后将病毒液用孔径0.22μm的中空纤维滤柱过滤，除去细胞碎片。向滤过的病毒液中加入甲醛溶液，灭活，使甲醛溶液的终浓度为0.2％(V/V)，随即充分摇匀升温，当温度升至37℃时开始计时，保持18小时灭活完毕，加入0.2％(w/v)的焦亚硫酸钠终止灭活，置2～8℃保存，即得到高致病性PRRSV-GD株病毒抗原溶液。

（2）含本发明的复合疫苗佐剂的PRRS疫苗组合物的制备：将以上制备得到的高致病性PRRSV-GD株病毒抗原溶液与本发明的复合免疫佐剂按照1：1.25的比例混合，在120-150rpm的转速下搅拌均匀，即得到PRRS疫苗组合物。具体参加下表1：

表1 PRRS疫苗组合物组成

疫苗	PRRSV病毒抗原溶液	佐剂种类（用量均为12.5mL）
			疫苗1	10mL	生理盐水
疫苗2	10mL	实施例2复合免疫佐剂
			疫苗3	10mL	实施例3复合免疫佐剂
疫苗4	10mL	实施例4复合免疫佐剂
			疫苗5	10mL	对照复合佐剂B
疫苗6	10mL	对照复合佐剂C
			疫苗7	10mL	对照复合佐剂D
疫苗8	10mL	对照复合佐剂E
			疫苗9	10mL	对照复合佐剂F
疫苗10	10mL	对照复合佐剂G
			疫苗11	10mL	实施例5对照复合佐剂A

以上试验所涉及的对照复合佐剂B-G组成如下表2：

表2 复合免疫佐剂组成表

	实施例2	佐剂B	佐剂C	佐剂D	佐剂E	佐剂F	佐剂F
								鱼腥草多糖	2.5%	2.5%	-	-	2.5%	2.5%	-
丙氨酸	0.2%	-	0.2%	-	0.2%	-	0.2%
								银杏叶黄酮	1.4%	-	-	1.4%	-	1.4%	1.4%
聚乙烯蓖麻油	7%	7%	7%	7%	7%	7%	7%
								Span80	7%	7%	7%	7%	7%	7%	7%
聚乙二醇	3.4%	3.4%	3.4%	3.4%	3.4%	3.4%	3.4%
								角鲨烯	8%	8%	8%	8%	8%	8%	8%
注射用大豆油	32%	33.4%	33.4%	32%	33.4%	32%	32%
								注射用水	38.5%	38.7%	41%	41.2%	38.5%	38.7%	41%

实施例8：免疫试验

14日龄仔猪220头随机分成1-11组,每组20头，分别采用实施例7表1中的疫苗1-11进行免疫处理，于14日龄和28日龄颈部肌肉注射疫苗1mL/头，第二次免疫接种14日后，分离血清用猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒(ELISA)检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体水平，检测所用试剂盒为美国IDEXX生产的猪繁殖与呼吸综合征抗体ELISA试剂盒，具体检测方法时，依据试剂盒产品说明书，采用猪蓝耳病病毒 N 蛋白的基因工程表达产物包被微孔板。在试验中，加入稀释的对照血清和待检血清，经温育后，若样品中含有猪蓝耳病 N蛋白的特异性抗体，则将与包被板上的抗原结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后；再加入酶标二抗，与包被板上抗原抗体复合物发生特异性结合： 再经洗涤除去未结合酶结合物，在孔中加入 TMB 底物液，与酶反应形成蓝色产物，加入 HF 溶液终止反应后，用酶标仪 630nm 波长测定各反应孔中的 OD 值。判定标准为：样品 OD₆₃₀nm 值＞ 0.42，判为阳性； 样品 OD₆₃₀nm 值介于 0.387 ～ 0.42 之间，判为可疑；样品OD₆₃₀nm 值＜ 0.38，判为阴性。具体检测结果见下表3：

表3 免疫试验结果

由以上试验结果可知，疫苗2（本发明实施例2）的疫苗组合物具有最佳的免疫效果，接种面以后，平均抗体效价达到1：1250，远远高于生理盐水组，也显著优于疫苗5-11；其次，疫苗3、4（本发明实施例3、4）的疫苗组合物的免疫效果也优于疫苗1、5-11的疫苗组合物接种后的免疫效果，且本发明实施例2-4的复合免疫佐剂与抗原结合后能够显著提高血清中的抗体水平，其OD₆₃₀nm值＞1.2的比例能够达到80-90%，即免疫接种后强阳性的水平较高，特别时OD₆₃₀nm值＞1.8的阳性比例明显高于其他组。

以上试验结果表明，本发明的组合物中，鱼腥草多糖、丙氨酸和银杏叶黄酮之间存在较强的协同增效作用，三者共同作用的效果明显好于单独运用或者两者组合，并且本发明的制备方法对于疫苗的免疫效果也具有较大的影响。

另外，为了进一步研究免疫佐剂的功效，本发明还对免疫后不同时期的抗体效价进行了动态检测，以下选取疫苗2、5、7、9、10的试验动物的血清学试验结果进行展示。具体结果见下表4：

表4 免疫后不同时期血清抗体效价

由以上表4的结果可以看出，本发明的复合免疫佐剂所制得的疫苗组合物具有免疫后抗体效价高，免疫反应快，抗体增长快的技术效果。

实施例9：攻毒保护

对于以上试验所用的动物，选取疫苗2、5、7、9、10的试验动物进行攻毒保护试验，采用高致病性PRRSV-GD感染猪的体液作为感染源，分别对试验动物进行注射，而后，观察试验动物的发病情况和死亡情况，具体结果见下表5：

表5 攻毒保护试验结果

组别	发病率	死亡率
			疫苗2	10%	0%
疫苗5	20%	5%
			疫苗7	30%	10%
疫苗9	30%	10%
			疫苗10	25%	10%

由于动物数量的局限，其不能很好地反应统计学意义上的攻毒保护试验数据，但是，通过本发明的试验结果可知，采用本发明实施例2佐剂所制备的疫苗组合物的发病率要低于其他对照组的疫苗组合物，且死亡率要低于其他组别，死亡动物数量为0，这也在一定程度上反应了本发明的疫苗组合物能够有效地提供免疫保护。

Claims (10)

1.一种复合免疫佐剂，其特征在于，所述复合免疫佐剂由以下重量百分含量的组分组成：鱼腥草多糖 1.5-3.5%，丙氨酸0.2%-0.55%，银杏叶黄酮0.8-2.2%，聚乙烯蓖麻油 5-8%，Span80 5-8%，聚乙二醇 2.5-5%，角鲨烯6-10%，注射用大豆油 30-35%，注射用水35-50%，以上各组分的重量百分含量之和为100%。

2.根据权利要求1所述的复合免疫佐剂，其特征在于，所述复合免疫佐剂由以下重量百分含量的组分组成：鱼腥草多糖 2.5%，丙氨酸0.2%，银杏叶黄酮1.4%，聚乙烯蓖麻油 7%，Span80 7%，聚乙二醇 3.4%，角鲨烯8%，注射用大豆油 32%，注射用水38.5%。

3.根据权利要求1所述的复合免疫佐剂，其特征在于，所述复合免疫佐剂由以下重量百分含量的组分组成：鱼腥草多糖 1.5%，丙氨酸0.55%，银杏叶黄酮2.2%，聚乙烯蓖麻油 5%，Span80 8%，聚乙二醇5%，角鲨烯6%，注射用大豆油 34%，注射用水37.75%。

4.根据权利要求1所述的复合免疫佐剂，其特征在于，所述复合免疫佐剂由以下重量百分含量的组分组成：鱼腥草多糖 3.5%，丙氨酸0.25%，银杏叶黄酮1.2%，聚乙烯蓖麻油 8%，Span80 5%，聚乙二醇 3%，角鲨烯10%，注射用大豆油 30%，注射用水39.05%。

5.根据权利要求1-4任一项所述的复合免疫佐剂的制备方法，其特征在于，所述复合免疫佐剂的制备方法包括如下步骤：

步骤一，按重量百分含量配比称取各原料；

步骤二，将称取的鱼腥草多糖和丙氨酸与注射用水混合，搅拌至其充分溶剂，得到水相；

步骤三，将称取的银杏叶黄酮与角鲨烯、注射用大豆油混合，搅拌均匀，得到油相；

步骤四，将称取的聚乙烯蓖麻油、Span80与聚乙二醇混合，然后加入步骤三所制得的油相，在650-700rpm的转速下搅拌3-5min，得到均匀的油相混合物；

步骤五，将步骤四制得的油相混合物在580-600rpm的转速下搅拌，边搅拌边以每分钟150-180微升的速度的速度滴加步骤二所制得的水相，待形成澄清透明的纳米乳后，改为每分钟600-800微升继续添加步骤二所制得的水相，直至水相全部滴加完成，即得到所述的复合免疫佐剂。

6.根据权利要求5所述的复合免疫佐剂的制备方法，其特征在于，所述鱼腥草多糖是以干鱼腥草为原料，采用如下工艺制备得到：干鱼腥草原料→粉碎机粉碎→热水浸提→离心、抽滤→滤液→真空浓缩至原有体积的1/8醇沉过夜→离心分离、洗涤→真空干燥→鱼腥草多糖，具体工艺包括如下步骤：

步骤一，取干鱼腥草为原料，采用粉碎机将其粉碎至100-120目，得到鱼腥草粉末；

步骤二，将鱼腥草粉末与65-70℃的温水按照15：1-25：1的比例混合进行热水浸提，并保持提取温度在65-70℃，以30-50rpm的速度搅拌提取2-2.5小时，得到鱼腥草热水浸提物；

步骤三，将步骤二制得的鱼腥草浸提物在3000-4500rpm的转速下离心10min，去上清液进行抽滤得到滤液，将滤液真空浓缩至原有体积的1/8，并加入浓缩液体积4倍的无水乙醇，置于0-4℃条件下静置过夜，弃去漂浮物，而后在4000-5000rpm的转速下离心分离10min，得到沉淀，而后采用95%的乙醇洗涤沉淀2次，真空干燥，即得到鱼腥草多糖。

7.根据权利要求1-4中任意一项所述的复合免疫佐剂在制备动物疫苗中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述动物为猪。

9.根据权利要求1-4中任意一项所述的复合免疫佐剂在制备猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）疫苗中的应用，优选地，所述疫苗为PRRSV病毒灭活疫苗或者PRRSV减毒活疫苗。

10.一种猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）疫苗，其是由权利要求1-4任一项所述的复合免疫佐剂与PRRSV灭活病毒组成。