CN111000990A - 一种鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及灭活疫苗领域，针对产生的抗体不足的问题，提供了一种鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗及其制备方法，该技术方案如下：包括以下步骤：S1.用LMH传代细胞分别接种鸭坦布苏病毒毒株和鸭腺病毒毒株；S2.分别收获鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒，在‑20℃条件下，将病变细胞反复冻融2次，保存备用；S3.分别灭活鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒；S4.将灭活后的鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒混合加入含有尿素的稳定剂以形成混合病毒溶液，配制疫苗制剂；运用特殊的低温乳化技术，使得疫苗制剂具有较好的免疫原性，进而使得生产出的疫苗制剂进入鸭体后能较快的诱导抗体，增强表达。

Description

一种鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及灭活疫苗领域，尤其是涉及一种鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
疫苗通过训练免疫系统识别和破坏有害物质与病变细胞来帮助身体对抗疾病，疫苗一般可分为两种类型，预防性疫苗和治疗性疫苗。向健康人群注射预防性疫苗，可预防特定疾病，向患有疾病的人群注射治疗性疫苗，可以帮助终止疾病的生长和扩散，作为规避措施。
近年来，在我国江浙地区的蛋鸭和种鸭养殖场爆发了一种以高热，食欲不振，产蛋量严重下降为主要临床特征的疾病，部分病鸭还表现出神经症状，该病发病率80％以上，死亡率在2％-10％，其病理特征为卵巢的充血、出血、变形和淋巴细胞浸润，肝门管区间隙炎症，经过病原分离和系统的实验室诊断，该病主要是由黄病毒属中的鸭坦布苏病毒引起的一种疾病，爆发以来，迅速传播各地，给我国养鸭业带来极大的危害。
I群2型腺病毒病主要是由鸭腺病毒引起的一类疾病，主要临床症状是心包积液和肝坏死，鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒往往混合感染番鸭，使得番鸭需要注射不同疫苗抵抗不同疾病，但是病毒变异性能较强，可能导致机体产生的抗体不足，且不能持续表达，因此，还有改善的空间。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的第一目的在于提供一种鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗的方法，具有产生较多的抗体的优点。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1.用LMH传代细胞分别接种鸭坦布苏病毒毒株和鸭腺病毒毒株；
S2.在鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒的含量均大于108.0TCID50/mL时，分别收获鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒，在-20℃条件下，将病变细胞反复冻融2次，离心10min-20min，保存备用；
S3.分别灭活鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒；
S4.将灭活后的鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒混合加入含有浓度为0.15％-0.25％(v/v)尿素的稳定剂以形成混合病毒溶液，配制疫苗制剂。
通过采用上述技术方案，通过灭活疫苗包括鸭坦布苏病毒、鸭腺病毒和稳定剂，使得注射了灭活疫苗的鸭体能够诱导更多产生中和的抗体，发明人意外的发现在稳定剂中加入尿素，使得培养出来的病毒抗原效价较高，使得灭活疫苗进入鸭体内所诱导出来的抗体能够持续表达，进而使得番鸭能同时抵抗鸭坦布苏病毒病、I群2型腺病毒病两种疾病。
通过鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒的含量均大于108.0TCID50/mL，减少鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒相互干扰，使得灭活疫苗具有较好的质量，进而使得注射了该灭活疫苗的番鸭能产生更多的抗体，提高番鸭的免疫能力。
通过将病变细胞在-20℃条件下，反复冻融2次，使得从细胞或者组织中提取病毒效果较佳，同时保证了病毒的活性。
本发明进一步设置为：所述步骤S1具体步骤如下：LMH细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，用含5～10％新生牛血清的DMEM/F12培养液继续传代培养LMH细胞，获取LMH传代细胞，LMH传代细胞形成良好单层时，用于接种病毒；利用所述LMH传代细胞分别接种鸭坦布苏病毒毒株和鸭腺病毒毒株，吸附培养后吸弃病毒液，再用含1～2％新生牛血清的DMEM/F12培养液培养至细胞出现80％病变时收获。
通过采用上述技术方案，通过选择LMH细胞作为宿主细胞，使得病毒抗原的滴度是常规鸭胚法及原代细胞法的10倍以上，使得制备的疫苗制剂具有较高的质量。
本发明进一步设置为：所述步骤S4中添加的稳定剂还包括1％-2％(v/v)海藻糖、1％-2％(v/v)葡萄糖、1％-2％(v/v)果糖、1％-2％(v/v)甘露糖的一种或多种。
通过采用上述技术方案，通过稳定剂包括海藻糖，使得注射该制备的疫苗制剂的鸭体具有较佳的特异性和非特异性的保护，防止病毒抗原中的蛋白质变性，意外发现病毒抗原的毒性下降，减少灭活后残留病毒量的情况。
通过稳定剂包括葡萄糖、果糖，提供病毒抗原生长必要的有机养分，使得病毒抗原的活性较佳。
通过稳定剂包括甘露糖，减少培养病毒抗原过程中杂菌的产生，使得制备的灭活疫苗较为稳定，进而减少副作用的产生。
本发明进一步设置为：所述步骤S4中添加的稳定剂稳定剂还包括浓度为0.1％-0.2％(v/v)的有机蒙脱土。
通过采用上述技术方案，通过稳定剂包括有机蒙脱土，利用有机蒙脱土具有较强的分散性，使得制备的灭活疫苗较为均匀，质量较佳。
本发明进一步设置为：所述步骤S4中添加的稳定剂还包括浓度为4％-6％(v/v)三羟甲基氨基甲烷。
通过采用上述技术方案，通过使用三羟甲基氨基甲烷作为缓冲液，使得病毒抗原生长处于碱性的状态下，减少病毒抗原的不适性，进而提高病毒抗原的免疫原性。
本发明进一步设置为：所述步骤S1中，LMH细胞在转瓶内或在微载体反应器中培养。
通过采用上述技术方案，通过LMH细胞在转瓶内或在微载体反应器中培养，使得病毒滴度可达到100倍的水平，进而使得灭活疫苗的品质较为稳定，使得注射该疫苗的鸭体能够产生高水平血清中和抗体。
本发明进一步设置为：所述步骤S4中配制疫苗制剂包括以下步骤：
a.在搅拌装置中加入检验合格的疫苗抗原和表面活性剂，搅拌均匀使得表面活性剂完全溶解以形成预混物；
b.将步骤a得到的预混物与步骤S4中添加的稳定剂混合，充分搅拌，使得步骤S4中添加的稳定剂充分溶解；
c.在搅拌装置中加入矿物油，搅拌均匀，温度为零下20℃至零下30℃保温溶解，零下20℃至零下30℃条件下恒温，保温30-40min，开始均质，直至矿物油被分散，持续搅拌并降温为零下35℃至零下45℃后加入乳化剂，直至充分溶解，高温灭菌备用；
d.分装。
通过采用上述技术方案，通过运用特殊的低温乳化技术，进行完步骤a后，加入矿物油，使得预混物与矿物油在零下20℃至零下30℃条件下保温溶解，直至矿物油被分散，然后再在35℃至零下45℃后加入乳化剂，配合稳定剂中的各项成分，使得制备的疫苗制剂颗粒分散较为均匀，且疫苗制剂具有较好的免疫原性，进而使得生产出的疫苗制剂进入鸭体后能较快的诱导抗体，产生较多的抗体，使得能够持续表达，同时免疫鸭坦布苏病毒病和I群2型腺病毒病两种疾病。
本发明进一步设置为：所述步骤c中的矿物油为白油。
通过采用上述技术方案，通过加入白油，使得制备的疫苗制剂具有较好的稳定性，使得疫苗制剂不易被破坏。
本发明进一步设置为：所述步骤c中的乳化剂为硬脂酸铝、司班-80、卡波姆和乙二胺四乙酸二钠中的一种或多种。
通过采用上述技术方案，通过加入硬脂酸铝、司班-80、卡波姆和乙二胺四乙酸二钠中的一种或多种，在疫苗抗原的表面能够产生保护层，保护疫苗抗原不被其他杂质所破坏，进而使得制备的疫苗制剂的质量较为优良。
针对现有技术存在的不足，本发明的第二目的在于提供一种上述方法制备的鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒的灭活疫苗。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1.本发明通过提供一种鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗，使得鸭体诱导更多产生中和的抗体持续表达，提高了鸭坦布苏病毒、鸭腺病毒的活性，提高了病毒的效价，且同时免疫鸭坦布苏病毒病、I群2型腺病毒病两种疾病；
2.本发明通过提供一种鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗，发明人意外发现在稳定剂中加入尿素，提高了灭活疫苗的质量；
3.本发明通过提供一种鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，运用特殊的低温乳化技术，使得疫苗制剂具有较好的免疫原性，进而使得生产出的疫苗制剂进入鸭体后能较快的诱导抗体，产生较多的抗体。
具体实施方式
以下实施例，对本发明作进一步详细说明。
以下实施例中，使用鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒均为自行分离鉴定：采用RT-PCR扩增，测序进行序列比，同时进行动物回归和鸭胚适应性试验进行进一步确定为鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒。
以下实施例中，尿素采用上海源叶生物科技有限公司出售的尿素，CAS号为57-13-6。
以下实施例中，5～10％新生牛血清的DMEM/F12培养液采用东莞市润孚医药科技有限公司出售的5～10％新生牛血清的DMEM/F12培养液。
以下实施例中，1～2％新生牛血清的DMEM/F12培养液采用东莞市润孚医药科技有限公司出售的1～2％新生牛血清的DMEM/F12培养液。
以下实施例中，有机蒙脱土采用山东泗水圣锋膨润土有限公司出售的有机蒙脱土。
以下实施例中，三羟甲基氨基甲烷采用上海源叶生物科技有限公司出售的三羟甲基氨基甲烷，CAS号为77-86-1。
以下实施例中，海藻糖采用上海源叶生物科技有限公司出售的尿素，CAS号为99-20-7。
以下实施例中，葡萄糖采用上海源叶生物科技有限公司出售的葡萄糖。
以下实施例中，果糖采用上海源叶生物科技有限公司出售的葡萄糖。
以下实施例中，甘露糖采用上海源叶生物科技有限公司出售的尿素，CAS号为3458-28-4。
实施例1
一种鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1.LMH细胞传代培养和接种：
S11.LMH细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，用含5％新生牛血清的DMEM/F12培养液继续传代培养LMH细胞，获取LMH传代细胞，将LMH传代细胞的细胞密度调整为1×105个/ml，接种至转瓶或者在微载体反应器中，在37℃条件下，对LMH传代细胞进行培养，当LMH传代细胞形成良好单层时，用于接种病毒；
S12.将鸭坦布苏病毒毒株和鸭腺病毒毒株按体积比为1:2接种至S11所制备的LMH传代细胞中，在37℃吸附30min后吸弃病毒液，再用含1％新生牛血清的DMEM/F12培养液培养至细胞出现80％病变时收获病毒液，收获的鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒的效价均大于108.0TCID50/mL。
S2.病毒液的浓缩和纯化：
将收集的细胞病毒液于-20℃反复冻融两次后，于4℃、5000rpm离心10min，取离心后上清液用于超滤浓缩，将上述离心后的上清液用30K中空纤维柱将其浓缩10倍后，取浓缩后的病毒液用DMEM/F12细胞培养液做10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-95个稀释度接种48孔铺满单层LMH细胞培养板，每个稀释度重复5孔，每孔0.2mL，5％CO2、37℃培养120小时，观察细胞病变(CPE)，计算TCID50；
S3.病毒液的灭活：
将步骤S2经过浓缩纯化得到的病毒液采用0.1％福尔马林溶液灭活病毒，边滴加边在转瓶或者在微载体反应器中充分搅拌，在37℃条件下灭活24h，即得疫苗抗原；
S4.配制疫苗制剂：包括以下步骤：
a.在搅拌釜中加入步骤S3检验合格的96份疫苗抗原和4份灭菌后的吐温-80，搅拌均匀使得吐温-80完全溶解以形成预混物；
b.将步骤a中得到的预混物与含有浓度为0.15％(v/v)尿素、0.1％(v/v)有机蒙脱土、4％(v/v)三羟甲基氨基甲烷、1％(v/v)海藻糖、1％(v/v)葡萄糖、1％(v/v)果糖及1％(v/v)甘露糖组成的稳定剂混合搅拌，充分溶解；
c.在搅拌釜中加入92份优质注射用白油，搅拌均匀，温度至-20℃保温溶解，恒温-20℃，保温30min，开始均质，直至白油被分散，持续搅拌并降温至-35℃后加入4份司盘-80、2份硬脂酸铝、1份卡波姆和1份乙二胺四乙酸二钠，直至充分溶解，高温灭菌备用，利用IKA乳化机进行乳化，16000rpm，乳化5min；
d.将制备的疫苗按照每瓶250mL进行分装。
实施例2
一种鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1.LMH细胞传代培养和接种：
S11.LMH细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，用含7.5％新生牛血清的DMEM/F12培养液继续传代培养LMH细胞，获取LMH传代细胞，将LMH传代细胞的细胞密度调整为1×105个/ml，接种至转瓶或者在微载体反应器中，在37℃条件下，对LMH传代细胞进行培养，当LMH传代细胞形成良好单层时，用于接种病毒；
S12.将鸭坦布苏病毒毒株和鸭腺病毒毒株按体积比为3:5接种至S11所制备的LMH传代细胞中，在37℃吸附35min后吸弃病毒液，再用含1.5％新生牛血清的DMEM/F12培养液培养至细胞出现80％病变时收获病毒液，收获的鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒的效价均大于108.0TCID50/mL。
S2.病毒液的浓缩和纯化：
将收集的细胞病毒液于-20℃反复冻融两次后，于4℃、5000rpm离心15min，取离心后上清液用于超滤浓缩，将上述离心后的上清液用30K中空纤维柱将其浓缩10倍后，取浓缩后的病毒液用DMEM/F12细胞培养液做10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-95个稀释度接种48孔铺满单层LMH细胞培养板，每个稀释度重复5孔，每孔0.2mL，5％CO2、37℃培养120小时，观察细胞病变(CPE)，计算TCID50；
S3.病毒液的灭活：
将步骤S2经过浓缩纯化得到的病毒液采用0.1％福尔马林溶液灭活病毒，边滴加边在转瓶或者在微载体反应器中充分搅拌，在37℃条件下灭活24h，即得疫苗抗原；
S4.配制疫苗制剂：包括以下步骤：
a.在搅拌釜中加入步骤S3检验合格的96份疫苗抗原和4份灭菌后的吐温-80，搅拌均匀使得吐温-80完全溶解以形成预混物；
b.将步骤a中得到的预混物与含有浓度为0.2％(v/v)尿素、0.15％(v/v)有机蒙脱土、5％(v/v)三羟甲基氨基甲烷、1.5％(v/v)海藻糖、1.5％(v/v)葡萄糖、1.5％(v/v)果糖及1.5％(v/v)甘露糖组成的稳定剂混合搅拌，充分溶解；
c.在搅拌釜中加入92份优质注射用白油，搅拌均匀，温度至-25℃保温溶解，恒温-25℃，保温35min，开始均质，直至白油被分散，持续搅拌并降温至-40℃后加入4份司盘-80、2份硬脂酸铝、1份卡波姆和1份乙二胺四乙酸二钠，直至充分溶解，高温灭菌备用，利用IKA乳化机进行乳化，16000rpm，乳化5min；
d.将制备的疫苗按照每瓶250mL进行分装。
实施例3
一种鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1.LMH细胞传代培养和接种：
S11.LMH细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，用含10％新生牛血清的DMEM/F12培养液继续传代培养LMH细胞，获取LMH传代细胞，将LMH传代细胞的细胞密度调整为1×105个/ml，接种至转瓶或者在微载体反应器中，在37℃条件下，对LMH传代细胞进行培养，当LMH传代细胞形成良好单层时，用于接种病毒；
S12.将鸭坦布苏病毒毒株和鸭腺病毒毒株按体积比为2:3接种至S11所制备的LMH传代细胞中，在37℃吸附40min后吸弃病毒液，再用含2％新生牛血清的DMEM/F12培养液培养至细胞出现80％病变时收获病毒液，收获的鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒的效价均大于108.0TCID50/mL。
S2.病毒液的浓缩和纯化：
将收集的细胞病毒液于-20℃反复冻融两次后，于4℃、5000rpm离心20min，取离心后上清液用于超滤浓缩，将上述离心后的上清液用30K中空纤维柱将其浓缩10倍后，取浓缩后的病毒液用DMEM/F12细胞培养液做10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-95个稀释度接种48孔铺满单层LMH细胞培养板，每个稀释度重复5孔，每孔0.2mL，5％CO2、37℃培养120小时，观察细胞病变(CPE)，计算TCID50；
S3.病毒液的灭活：
将步骤S2经过浓缩纯化得到的病毒液采用0.1％福尔马林溶液灭活病毒，边滴加边在转瓶或者在微载体反应器中充分搅拌，在37℃条件下灭活24h，即得疫苗抗原；
S4.配制疫苗制剂：包括以下步骤：
a.在搅拌釜中加入步骤S3检验合格的96份疫苗抗原和4份灭菌后的吐温-80，搅拌均匀使得吐温-80完全溶解以形成预混物；
b.将步骤a中得到的预混物与含有浓度为0.25％(v/v)尿素、0.2％(v/v)有机蒙脱土、6％(v/v)三羟甲基氨基甲烷、2％(v/v)海藻糖、2％(v/v)葡萄糖、2％(v/v)果糖及2％(v/v)甘露糖组成的稳定剂混合搅拌，充分溶解；
c.在搅拌釜中加入92份优质注射用白油，搅拌均匀，温度至-30℃保温溶解，恒温-30℃，保温40min，开始均质，直至白油被分散，持续搅拌并降温至-45℃后加入4份司盘-80、2份硬脂酸铝、1份卡波姆和1份乙二胺四乙酸二钠，直至充分溶解，高温灭菌备用，利用IKA乳化机进行乳化，16000rpm，乳化5min；
d.将制备的疫苗按照每瓶250mL进行分装。
实施例4
一种鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1.LMH细胞传代培养和接种：
S11.LMH细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，用含7％新生牛血清的DMEM/F12培养液继续传代培养LMH细胞，获取LMH传代细胞，将LMH传代细胞的细胞密度调整为1×105个/ml，接种至转瓶或者在微载体反应器中，在37℃条件下，对LMH传代细胞进行培养，当LMH传代细胞形成良好单层时，用于接种病毒；
S12.将鸭坦布苏病毒毒株和鸭腺病毒毒株按体积比为1:3接种至S11所制备的LMH传代细胞中，在37℃吸附35min后吸弃病毒液，再用含1％新生牛血清的DMEM/F12培养液培养至细胞出现80％病变时收获病毒液，收获的鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒的效价均大于108.0TCID50/mL。
S2.病毒液的浓缩和纯化：
将收集的细胞病毒液于-20℃反复冻融两次后，于4℃、5000rpm离心15min，取离心后上清液用于超滤浓缩，将上述离心后的上清液用30K中空纤维柱将其浓缩10倍后，取浓缩后的病毒液用DMEM/F12细胞培养液做10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-95个稀释度接种48孔铺满单层LMH细胞培养板，每个稀释度重复5孔，每孔0.2mL，5％CO2、37℃培养120小时，观察细胞病变(CPE)，计算TCID50；
S3.病毒液的灭活：
将步骤S2经过浓缩纯化得到的病毒液采用0.1％福尔马林溶液灭活病毒，边滴加边在转瓶或者在微载体反应器中充分搅拌，在37℃条件下灭活24h，即得疫苗抗原；
S4.配制疫苗制剂：包括以下步骤：
a.在搅拌釜中加入步骤S3检验合格的96份疫苗抗原和4份灭菌后的吐温-80，搅拌均匀使得吐温-80完全溶解以形成预混物；
b.将步骤a中得到的预混物与含有浓度为0.22％(v/v)尿素、0.13％(v/v)有机蒙脱土、4.5％(v/v)三羟甲基氨基甲烷、1.4％(v/v)海藻糖、1.4％(v/v)葡萄糖、1.4％(v/v)果糖及1.4％(v/v)甘露糖组成的稳定剂混合搅拌，充分溶解；
c.在搅拌釜中加入92份优质注射用白油，搅拌均匀，温度至-26℃保温溶解，恒温-26℃，保温35min，开始均质，直至白油被分散，持续搅拌并降温至-42℃后加入4份司盘-80、2份硬脂酸铝、1份卡波姆和1份乙二胺四乙酸二钠，直至充分溶解，高温灭菌备用，利用IKA乳化机进行乳化，16000rpm，乳化5min；
d.将制备的疫苗按照每瓶250mL进行分装。
对比例1
与实施例4的区别在于，稳定剂中不含有尿素，其余参数与操作实施例4一致。
对比例2
与实施例4的区别在于，稳定剂中含有10％(v/v)尿素，其余参数与操作实施例4一致。
对比例3
与实施例4的区别在于，稳定剂中不含有海藻糖，其余参数与操作实施例4一致。
对比例4
与实施例4的区别在于，S4.配制疫苗制剂步骤c为：在搅拌釜中加入92份优质注射用白油、4份司盘-80、2份硬脂酸铝、1份卡波姆和1份乙二胺四乙酸二钠，搅拌均匀，温度至-26℃保温溶解，恒温-26℃，保温35min，直至充分溶解，高温灭菌备用，利用IKA乳化机进行乳化，16000rpm，乳化5min，其余参数与操作实施例4一致。
实验1：鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗毒性实验。
将实施例1-4以及对比例1-4所述的方法制备得到的鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒病毒液在不同时间收获的TCID50/0.1ml，筛选出最佳的病毒收获时间，如表1所示。
36h 48h 72h 120h 144h
实施例1 1×10<sup>6.5</sup> 1×10<sup>6.7</sup> 1×10<sup>7.0</sup> 1×10<sup>7.5</sup> 1×10<sup>7.2</sup>
实施例2 1×10<sup>6.8</sup> 1×10<sup>7.2</sup> 1×10<sup>7.5</sup> 1×10<sup>7.6</sup> 1×10<sup>7.5</sup>
实施例3 1×10<sup>7.0</sup> 1×10<sup>7.5</sup> 1×10<sup>7.7</sup> 1×10<sup>8.2</sup> 1×10<sup>6.8</sup>
实施例4 1×10<sup>7.5</sup> 1×10<sup>8.2</sup> 1×10<sup>8.5</sup> 1×10<sup>9.0</sup> 1×10<sup>8.7</sup>
对比例1 3×10<sup>4.2</sup> 3×10<sup>5</sup> 1×10<sup>6.0</sup> 1×10<sup>6.8</sup> 1×10<sup>6.5</sup>
对比例2 1×10<sup>6.1</sup> 1×10<sup>6.4</sup> 1×10<sup>6.5</sup> 1×10<sup>6.8</sup> 1×10<sup>6.4</sup>
对比例3 1×10<sup>6.1</sup> 1×10<sup>6.3</sup> 1×10<sup>6.5</sup> 1×10<sup>6.6</sup> 1×10<sup>6.3</sup>
对比例4 4×10<sup>4.0</sup> 3×10<sup>5.2</sup> 1×10<sup>7.5</sup> 1×10<sup>6.2</sup> 1×10<sup>6.0</sup>
根据表1的数据可知，与实施例4对比，对比例1在稳定剂中不加入尿素，制备的毒液获得的LMH细胞用于制备制苗病毒液在120h达到最大值1×106.8TCID50/0.1ml，病毒效价低于实施例4。
对比例2与实施例4相比，对比例2在稳定剂中加入过量浓度的尿素，使得制备的毒液获得的LMH细胞用于制备制苗病毒液在120h达到最大值1×106.8TCID50/0.1ml，病毒效价低于实施例4。
对比例3与实施例4相比，对比例3在稳定剂中不添加海藻糖，使得制备的毒液获得的LMH细胞用于制备制苗病毒液在120h达到最大值1×106.6TCID50/0.1ml，病毒效价低于实施例4。
对比例4未设置在不同低温条件下进行溶解，使得制备的毒液获得的LMH细胞用于制备制苗病毒液在72h达到最大值1×107.5TCID50/0.1ml，效价低于实施例4。
实验2：鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗效力实验。
取7日龄健康易感鸭90只，每组10只，将实施例1-4以及对比例1-4制备的灭活疫苗分别以0.3mL/只胸肌注射，剩余一组作为空白对照组，14、28、42和56天，分别采血分离血清，测定其血清中和抗体效价根据Reed-Muench方法计算鸭呼肠孤病毒和鸭坦布苏病毒中和抗体效价，免疫42天后，通过肌肉接种方式对免疫鸭进行攻毒实验，分别用鸭呼肠孤病毒和鸭坦布苏病毒进行攻毒，攻毒剂量各为1.0×108.0TCID50/只，空白对照组注射同体积生理盐水，攻毒后连续观察14日，统计鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗免疫保护率，实验结果见表2及表3。
表2鸭坦布苏病毒中和抗体测定及攻毒结果
Figure BDA0002326028750000171
表3鸭腺病毒中和抗体测定及攻毒结果
Figure BDA0002326028750000172
Figure BDA0002326028750000181
根据表2以及表3的数据可知，实施例1-4制备的鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗免疫保护效果较佳，实施例4组的免疫鸭得到100％是保护，观察未见任何异常现象，剖检未见相关组织病变。
根据实施例4与对比4相比，可知采用分步低温操作，配合稳定剂中的各成分，使得疫苗制剂具有较好的免疫原性，进而使得生产出的疫苗制剂进入鸭体后能较快的诱导抗体，产生较多的抗体，使得能够持续表达，同时免疫鸭坦布苏病毒病和I群2型腺病毒病两种疾病。
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征是：包括以下步骤：
S1.用LMH传代细胞分别接种鸭坦布苏病毒毒株和鸭腺病毒毒株；
S2.在鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒的含量均大于108.0TCID50/mL时，分别收获鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒，在-20℃条件下，将病变细胞反复冻融2次，离心10min-20min，保存备用；
S3.分别灭活鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒；
S4.将灭活后的鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒混合加入含有浓度为0.15％-0.25％(v/v)尿素的稳定剂以形成混合病毒溶液，配制疫苗制剂。
2.根据权利要求1所述的一种鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征是：所述步骤S1具体步骤如下：LMH细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，用含5～10％新生牛血清的DMEM/F12培养液继续传代培养LMH细胞，获取LMH传代细胞，LMH传代细胞形成良好单层时，用于接种病毒；利用所述LMH传代细胞分别接种鸭坦布苏病毒毒株和鸭腺病毒毒株，吸附培养后吸弃病毒液，再用含1～2％新生牛血清的DMEM/F12培养液培养至细胞出现80％病变时收获。
3.根据权利要求1所述的一种鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征是：所述步骤S4中添加的稳定剂还包括1％-2％(v/v)海藻糖、1％-2％(v/v)葡萄糖、1％-2％(v/v)果糖、1％-2％(v/v)甘露糖的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的一种鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征是：所述步骤S4中添加的稳定剂还包括浓度为0.1％-0.2％(v/v)的有机蒙脱土。
5.根据权利要求1所述的一种鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征是：所述步骤S4中添加的稳定剂还包括浓度为4％-6％(v/v)三羟甲基氨基甲烷。
6.根据权利要求2所述的一种鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征是：所述步骤S1中，LMH细胞在转瓶内或在微载体反应器中培养。
7.根据权利要求1所述的一种鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征是：所述步骤S4中配制疫苗制剂包括以下步骤：
a.在搅拌装置中加入检验合格的疫苗抗原和表面活性剂，搅拌均匀使得表面活性剂完全溶解以形成预混物；
b.将步骤a得到的预混物与步骤S4中添加的稳定剂混合，充分搅拌，使得步骤S4中添加的稳定剂充分溶解；
c.在搅拌装置中加入矿物油，搅拌均匀，温度为零下20℃至零下30℃保温溶解，零下20℃至零下30℃条件下恒温，保温30-40min，开始均质，直至矿物油被分散，持续搅拌并降温为零下35℃至零下45℃后加入乳化剂，直至充分溶解，高温灭菌备用；
d.分装。
8.根据权利要求7所述的一种鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征是：所述步骤c中的矿物油为白油。
9.根据权利要求7所述的一种鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗的制备方法，其特征是：所述步骤c中的乳化剂为硬脂酸铝、司班-80、卡波姆和乙二胺四乙酸二钠中的一种或多种。
10.一种通过权利要求1-9任一项所述的方法制备的鸭坦布苏病毒和鸭腺病毒二联灭活疫苗。
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